Le vieillissement normal s’accompagne d’une diminution du contenu du cholestérol cérébral. Au contraire, une accumulation de cholestérol est associée aux processus toxiques dans plusieurs pathologies dégénératives (maladie d’Huntington, maladie de Parkinson, épilepsie, maladie de Niemann Pick de type C, maladie d’Alzheimer). De plus, les parallèles étroits existent entre la physiopathologie moléculaire de la maladie d’Alzheimer et celle de la maladie de Niemann Pick de type C, maladie de l’homéostasie du cholestérol. Ainsi on retrouve dans ces deux pathologies une hyperphosphorylation de la protéine Tau, associée à une augmentation des endosomes élargis et à la production de peptides A. L’ensemble de ces éléments évoque le rôle potentiel de la surcharge en cholestérol cérébral comme facteur favorisant le développement de la maladie d’Alzheimer. L’objectif de mon travail de doctorat a été de déterminer si une surcharge en cholestérol in vivo dans les neurones de l’hippocampe, région précocement touchée par la maladie d’Alzheimer, pouvait être à l’origine de processus neurotoxiques et de modifications biochimiques et neuropathologiques proches de ceux qui sont observés dans cette pathologie. La quasi-totalité du cholestérol cérébral est synthétisée in situ, la barrière hémato-encéphalique ne permettant qu’un apport minime du cholestérol périphérique. L’excès de cholestérol est exporté de la circulation sanguine sous la forme du 24-hydroxycholestérol, un métabolite produit exclusivement dans les neurones par la cholestérol-24-hydroxylase codée par le gène Cyp46a1.La surcharge en cholestérol a été induite in vivo par inhibition de la cholestérol-24-hydroxylase, dans l’hippocampe par une stratégie d’ARN interférence délivré par une injection stéréotaxique d’un vecteur AAV5. Nous avons étudié, d’une part la capacité d’une accumulation de cholestérol à induire chez la souris normale, un phénotype clinique et neuropathologique proche de la maladie d’Alzheimer et d’autre part si cette même accumulation de cholestérol neuronal pouvait aggraver ou compléter le phénotype Alzheimer d’un modèle murin de la maladie, la souris APP23. L’injection du vecteur AAV5-shCYP46A1 dans la stratum lacunosum moleculare de l’hippocampe conduit à une inhibition significative de l'expression du gène Cyp46a1, associée à une diminution de la concentration du 24-hydroxycholestérol et une augmentation du contenu en cholestérol dans les neurones de l’hippocampe, 3 semaines après l’injection. En réponse à cet excès de cholestérol, des mécanismes régulateurs permettent de diminuer, d’une part l’import et d’augmenter l’export du cholestérol de la cellule et d’autre part d’augmenter le contenu en phosphatidylcholine afin de rétablir un ratio phospholipide/cholestérol physiologique. Cependant, l'accumulation majeure de cholestérol intracellulaire conduit, 3 semaines après l’injection, à une activation de la réponse UPR (Unfolded Protein Response ou stress du réticulum endoplasmique) caractérisée par l'expression des gènes codant les facteurs XBP1s, ATF6, GRP78 associée à celles des protéines PERK phosphorylée, CHOP et caspase 12, entraînant l'activation des caspases 9 et 3. Elle est associée à la phosphorylation des protéines GSK3 (Tyr216) et Tau (Thr231). En parallèle, l’augmentation du cholestérol induit, 3 semaines après l’injection, une augmentation de l’expression de la protéine Rab5 (marqueur des endosomes précoces) et une relocalisation de la protéine APP dans les fractions de radeaux lipidiques associées à l'activation de la voie amyloïdogénique (production des fragments-CTF et des peptides A42). L’étude lipidomique met en évidence, 4 semaines après l’injection, une augmentation du contenu en céramide à longues chaînes et à une augmentation des gangliosides. Tous ces éléments aboutissent à un processus de perte neuronale associée à un recrutement des astrocytes dès la quatrième semaine après l’injection.... / An increasing number of arguments suggest a close and complex link between cholesterol metabolism and neurodegenerative diseases, particularly with Alzheimer’s disease. Normal ageing is associated with a decrease of brain cholesterol content. Conversly, accumulation of brain cholesterol is associated with several neurodegenerative diseases (Huntington disease, Parkinson disease, epilepsy, Niemann Pick C disease, Alzheimer’s disease). Moreover, close connections exist between molecular physiopathology of AD and that of Niemann Pick, a disease of cholesterol homeostasis. Altogether, these results suggest that cholesterol overload might play a role, as an initiating factor for the development of AD.In the brain, cholesterol metabolism is tightly controlled. In adults, cholesterol is mainly synthetized by astrocytes, then shuttles to neurons where it is used. All cholesterol excess must be eliminated. Cholesterol cannot cross freely the blood-brain-barrier. To be metabolized, brain cholesterol must be converted in 24-hydroxy-cholesterol by the cholesterol-24 hydroxylase enzyme, coded by CYP46A1 gene. The objective of my PhD project was to determine if cholesterol accumulation in vivo in hippocampal neurons, a region early involved in AD pathology, could trigger neurotoxic processes with biochemical and neuropathological modifications close to what is observed in AD. Cholesterol overload in vivo was induced by inhibiting cholesterol 24-hydroxylase enzyme activity, using an RNA interference strategy. Stereotactic injection of an AAV5- shCYP46A1 vector in the stratum lacunosum moleculare of the hippocampus led to significant and rapid (as soon as 3 weeks after injection) inhibition of the Cyp46a1 gene in the hippocampus with an absence of RNA interference off-target effect. This inhibition was associated with a decrease of 24-hydroxycholesterol content and an increase of the cholesterol content. In response to this cholesterol excess, cell control mechanisms were initiated leading to decrease import and increase export of cholesterol, accompanied with an increase of phosphatidylcholine content to restore a physiological ratio of phospholipide/cholesterol. However, major accumulation of cholesterol led to neuronal death with activation of caspases 9 et 3, suggesting an apoptotic process. The cholesterol overload drives to an endoplasmic reticulum stress, with activation of the unfolded protein response (UPR) and expression of spliced XBP1, ATF6, GRP78, phosphorylated PERK, CHOP and caspase 12. These modifications were associated with phosphorylation of GSK3 (Tyr 216) and tau (Thr 231) proteins. In parallel, cholesterol accumulation led to increased expression of Rab5 (early endosome marker) and relocalization of APP in rafts domains associated to activation of amyloid pathway (production of -CTF fragments and A42 peptides). Lipidomic analysis showed an increase of ceramides and gangliosides content. All these modifications were associated with neuronal death 4 weeks after injection and astrocytosis, leading to an EEG theta rhythm accelerated to beta frequencies, memory deficits and hippocampal atrophy. In a mouse model of Alzheimer disease, the APP23 mouse, cholesterol accumulation led to major aggravation of the phenotype, with increased production of A peptides, occurring of tau phosphorylation and UPR response, leading to accelerated neuronal death. Altogether, these results suggest a direct link between cholesterol accumulation in the brain and Alzheimer’s disease. Brain cholesterol accumulation could seed the sows to the development of Alzheimer’s pathology. Reducing cerebral cholesterol could thus be a relevant therapeutic strategy to prevent the development, or at least slow down the evolution of the pathology in Alzheimer’s disease.

La maladie d’Alzheimer (MA) se caractérise par une perte mnésique progressive et au plan neuropathologique par le dépôt extracellulaire de plaques amyloïdes, résultant de l’agrégation de peptides amyloïdes (Aβ), et par l’apparition d’une dégénérescence neurofibrillaire (DNF) constituée d’agrégats intraneuronaux de protéines Tau hyper et anormalement phosphorylées. L’évolution des déficits cognitifs des patients est particulièrement corrélée à la progression spatio-temporelle de la DNF. A l’heure actuelle, il n’existe aucun traitement curatif de la maladie. Le cholestérol joue un rôle central dans la physiopathologie de la MA. En particulier, l’allèle ε4 du gène de l’apolipoprotéine E, transporteur cérébral essentiel du cholestérol, est le principal facteur de risque génétique des formes sporadiques de la MA. De nombreuses études in vitro montrent qu’une surcharge en cholestérol induit la production d’Aβ pathogènes et qu’inversement, une déplétion en cholestérol entraîne une diminution de la voie amyloïde. Le cholestérol ne peut pas passer librement la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le cholestérol cérébral est exclusivement synthétisé in situ. Le cholestérol cérébral en excès doit être exporté dans la circulation sanguine pour être métabolisé. Pour franchir la BHE, sa conversion en 24(S)-hydroxycholestérol est nécessaire, étape contrôlée par la cholestérol 24-hydroxylase (CYP46A1). Deux précédents travaux de thèse effectués dans le laboratoire ont permis de mettre en évidence des connexions étroites entre le métabolisme du cholestérol et la MA in vivo. La surexpression intracérébrale de CYP46A1 dans un modèle murin amyloïde à l’aide d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) a conduit à la diminution de la production d’Aβ, des plaques amyloïdes et à l’amélioration des performances mnésiques des animaux. A l’inverse, l’inhibition de l’expression de CYP46A1 dans l’hippocampe de souris sauvages induit la production d’Aβ, la phosphorylation de Tau et des défauts mnésiques chez la souris. L’objectif de mon travail de doctorat a été de déterminer s’il existait un lien direct entre CYP46A1 et la pathologie Tau et si la modulation du métabolisme du cholestérol pourrait avoir un effet bénéfique sur la pathologie Tau associée à la MA. Pour répondre à ces questions, le modèle murin THY-Tau22, qui développe une pathologie Tau de type Alzheimer, a été utilisé. Cette pathologie, essentiellement hippocampique, est évolutive et associée à des déficits mnésiques. Dans l’hippocampe des souris THY-Tau22, le cholestérol libre total n’est pas modifié, alors que l’expression protéique de CYP46A1 est diminuée, et en conséquence le contenu en 24(S)-hydroxycholestérol. L’expression protéique de CYP46A1 dans l’hippocampe est également réduite dans un autre modèle murin de pathologie Tau, le modèle THY-Tau30. Ainsi, la pathologie Tau semble être à l’origine de la diminution de l’expression protéique de CYP46A1. Afin de déterminer si la surexpression de CYP46A1 chez la souris THY-Tau22 pouvait améliorer son phénotype biochimique, neuropathologique et clinique, un vecteur AAV codant pour CYP46A1 a été injecté dans l’hippocampe de souris THY-Tau22 âgées de trois mois et demi. Deux mois et demi après injection, la surexpression de CYP46A1 chez les souris THY-Tau22 induit une restauration de la concentration hippocampique en 24(S)-hydroxycholestérol et une augmentation de l’expression des gènes impliqués dans la synthèse du cholestérol, et plus particulièrement dans la voie du mévalonate. Deux mois et demi et cinq mois et demi post-injection, la surexpression de CYP46A1 entraîne une restauration complète des performances mnésiques des animaux qui s’accompagne d’un rétablissement de la dépression à long terme, de la longueur des dendrites secondaires, de la densité synaptique et de l’expression des gènes d’activité précoce dans l’hippocampe. (...) / Alzheimer’s disease (AD) is characterized by a progressive memory loss and neuropathologically by senile plaques and neurofibrillary tangles (NFTs). Senile plaques are constituted of extracellular amyloid peptide (Aβ) deposits while NFTs result from the accumulation and the aggregation of intracellular hyperphosphorylated Tau proteins. Spatiotemporal progression of NFTs particularly correlates with cognitive impairments. To date, there is no curative treatment for this disease. Cholesterol plays a central role in AD physiopathology. Indeed, the ε4 allele of the apolipoprotein E, the brain’s principal cholesterol-carrier protein, is the main genetic risk factor for sporadic forms of AD. Numerous in vitro studies have shown that cholesterol overload induces production of pathogenic Aβ and conversely, cholesterol depletion causes a reduction of the amyloidogenic pathway. In adult, brain cholesterol is exclusively synthesized in situ. Brain cholesterol is not able to freely cross the blood brain barrier and its major exportable form is 24(S)-hydroxycholesterol generated by the cholesterol 24-hydroxylase (CYP46A1). Two previous thesis works in this laboratory highlighted narrow connections between cholesterol metabolism and AD in vivo. The intracerebral overexpression of CYP46A1 mediated by an adeno-associated viral (AAV) vector, in a murine amyloid model, led to the decrease of Aβ production, senile plaques and improvement of memory abilities. At the opposite, hippocampal CYP46A1 inhibition in wild-type (WT) mice induced Aβ production, Tau phosphorylation and memory impairments. The aim of this thesis work was to determine whether there was a direct link between CYP46A1 and Tau pathology and whether cholesterol metabolism modulation could have a beneficial effect on AD-like Tau pathology. In order to answer these questions, the THY-Tau22 mouse model, that develops AD-like Tau pathology, was used. In this model, the pathology mainly occurs in the hippocampus, it is progressive, and associated with memory deficits. In THY-Tau22 mice, total free cholesterol in the hippocampus was unchanged, whereas both CYP46A1 protein expression and 24(S)-hydroxycholesterol content were decreased. Furthermore, we also demonstrated that CYP46A1 protein expression was reduced in another murine model of Tau pathology, the THY-Tau30 model. Therefore, it may suggest that Tau pathology can be responsible for CYP46A1 decrease. We next determined whether CYP46A1 overexpression in the THY-Tau22 mouse could improve its biochemical, clinical and neuropathologic phenotype. For this purpose, an AAV vector encoding CYP46A1 was injected in the hippocampus of 3.5-month-old WT and THY-Tau22 mice. Two and a half months after injection, hippocampal CYP46A1 overexpression in THY-Tau22 mice induced restoration of hippocampal 24(S)-hydroxycholesterol content and increased expression of genes involved in cholesterol synthesis, more particularly in the mevalonate pathway. Two and a half and five and a half months post-injection, CYP46A1 overexpression resulted in a complete restoration of memory abilities and was accompanied by restoration of long-term depression, length of secondary dendrites, synaptic density and expression of immediate-early genes in hippocampus. Despite this, abnormal Tau hyperphosphorylation and gliosis, that characterizes this model, remained unchanged after CYP46A1 overexpression. Altogether, these results suggest a direct connection between Tau pathology and CYP46A1 in vivo. In other words, Tau pathology could lead to memory deficits via CYP46A1 decrease. These data, together with the fact that CYP46A1 overexpression can modulate the amyloid pathology in mice, suggest that CYP46A1 may be a relevant therapeutic target for AD.