Le latex de Carica papaya est un milieu riche en cystéine protéinases. Celles-ci ont été régulièrement utilisées en cosmétique ou pour l’attendrissement de la viande. Mais ces protéines ont aussi un intérêt pharmaceutique. En effet, le latex est bien connu pour posséder une activité antifongique mais aussi une activité anthelminthique. Ces effets sont régulièrement attribués aux cystéine protéinases qui se trouvent en concentration importante dans le latex. Malgré ces concentrations importantes en protéinases, d’autres protéines restent actives dans ce milieu. C’est le cas de la glutamine cyclase, qui a été extraite intacte de ce milieu et cristallisée. Sa structure nous a révélé une architecture particulière en ‘’-propeller‘’ à cinq pales avec double fermeture. Cette structure lui confère sa très grande stabilité. Les industries pharmaceutiques sont aussi à la recherche de protéines très stables et résistantes aux protéinases endogènes. Nous avons donc entrepris l’étude du protéome de Carica papaya afin de mettre en évidence d’autres protéines minoritaires relativement stables pouvant conférer au latex son activité anthelminthique. Cette analyse a permis la mise en évidence de différentes protéines appartenant à diverses familles des « pathogenesis related protéins » (PR-proteins): une -1,3 glucosidase, une analogue à la barwin, une thaumatine et deux chitinases. Nous nous sommes particulièrement intéressés à ces deux dernières au cours de cette thèse. Une caractérisation de ces deux protéines a permis de montrer que celles-ci étaient bien deux protéines distinctes, identifiées comme chitinases majeure et mineure selon leur abondance dans le latex. Elles sont relativement stables et résistantes à la protéolyse. Une analyse de la séquence de la chitinase majeure a montré que celle-ci était homologue à la chitinase issue de l’orge et une analyse de sa structure révèle la présence d’une grande concentration en prolines localisées principalement dans les neuf boucles de sa structure. Cela pourrait expliquer sa grande résistance vis à vis des cystéine protéinases. La cristallisation de cette même chitinase en présence de N-acétyl-glucosamine comme additif, a conduit à une structure contenant trois molécules de GlcNac, deux dans le centre actif de notre protéine et une participant au réseau cristallin. Aucune structure de chitinase n’avait encore pu être obtenue en co-cristallisation avec un substrat. A partir des deux GlcNac observés dans le centre actif, nous avons reconstruit un complexe chitinase/(GlcNac)4. L’analyse de ce complexe a permis de mettre en évidence de nouvelles interactions entre (GlcNac)4 et les acides aminés du centre actif ainsi que de confirmer le mécanisme de la famille GH 19. Des tests préliminaires sur nématodes ont finalement confirmé l’activité anthelminthique du latex et montré que la chitinase pouvait aussi être un bon nématocide

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Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la première cause de décès dans le monde. Une alimentation riche en précurseurs de méthyles pourrait diminuer le risque de survenue des MCV. Le statut en PDM a de très nombreuses conséquences car son altération va des risques de défaut de fermeture du tube neural au cours de l'embryogenèse au développement de maladies chroniques. Les PDM interviennent dans la voie de reméthylation de l'homocystéine en méthionine. Une diminution des niveaux de PDM entraîne une hyperhomocystéinémie considérée comme un facteur de risque de MCV via notamment son rôle dans le développement de l'athérosclérose. Relativement peu d'études se sont intéressées à l'effet d'une déficience en PDM sur le coeur. Afin de mieux comprendre les conséquences de la déficience en PDM sur cet organe, nous avons analysé les modifications du protéome myocardique chez des ratons de 21 jours nés de mères nourries avec un régime carencé en PDM comparativement à des ratons issus de mères normalement nourries. Les résultats de notre analyse protéomique ont montré que l'abondance de 22 protéines était augmentée entre 1,1 et 1,7 fois, alors que celle de 17 autres était diminuée entre 1,1 et 2,3 fois. Ces protéines interviennent surtout dans la production d'énergie cellulaire (21%), le métabolisme lipidique (18%) et le stress du réticulum endoplasmique (RE) (15%). Au moyen de l'outil bio-informatique "Ingenuity Pathway Analysis", nous avons montré que 34 d'entres-elles appartenaient à un réseau métabolique en relation avec "une perturbation du développement cardiaque et une altération cellulaire et du métabolisme lipidique". De plus, la carbonylation, principale modification posttraductionnelle oxydative des protéines, quantifiée par une technique de Dot-blot était augmentée de 1,9 fois dans le myocarde des ratons déficients en PDM comparativement aux contrôles. Afin d'étudier les mécanismes à l'origine de ces changements, nous avons développé un modèle in vitro de cellules cardiaques déficientes uniquement en folates ou en PDM. Des cellules de la lignée H9c2, dérivée de cardiomyoblastes embryonnaires de rat, ont été cultivées jusqu'à 4 jours dans un milieu carencé en folates (F) ou en PDM, comparativement à un milieu complet (C). Ceci nous a permis de disposer de deux modèles, constitués : (1) de cellules uniquement déficientes en folates et ne produisant pas davantage d'Hcy que les cellules contrôles, et (2) de cellules déficientes en au moins 2 PDM (folates et vitamine B12) et produisant des quantités accrues d'Hcy. Une analyse comparative des protéomes des cellules F et PDM vs C a permis d'identifier des différences et similitudes entre les 2 déficiences. Treize protéines présentant des abondances significativement différentes entre les cellules carencées pendant 4 jours en folates ou en PDM et leurs contrôles ont été mises en évidence : 7 avaient une abondance accrue et 6 une abondance diminuée. La comparaison des résultats obtenus a montré que des protéines mitochondriales ou intervenant dans la structure cellulaire n'ont été identifiées que dans le modèle de déficience en PDM. Nos résultats ont aussi démontré que les 2 types de carences affectaient des voies similaires à celles retrouvées dans notre étude in vivo : métabolisme énergétique et stress du RE. Nous avons alors confirmé que des protéines chaperones, a-crystalline B et prohibitine, avaient leur expression modifiée de la même manière dans les modèles de déficience in vivo (myocarde des ratons) et in vitro (cardiomyoblastes). Notre étude a également montré que l'induction rapide du stress du RE dans les cardiomyoblastes déficients en PDM est suivie par l'activation plus tardive du système d'ubiquitination des protéines et probablement de la voie de dégradation protéolytique dépendante du protéasome. En conclusion, cette thèse ouvre de nouvelles perspectives dans la compréhension des mécanismes des effets de la déficience en PDM ou en folates au niveau cardiaque. / No abstract available

Le paludisme est causé par des parasites du genre Plasmodium et la gamétogenèse est une étape essentielle à sa transmission. Afin d'améliorer les connaissances sur la genèse des gamètes, nous avons mené des études protéomiques sur des gamétocytes de P. berghei sauvages ou mutants avec le gène moteur de la kinésine 8 interrompu. Le mutant est morphologiquement semblable au type sauvage mais incapable de compléter la gamétogenèse et les gamètes mâles d'exflageller. A partir d'échantillons enrichis en gamétocytes, la gamétogenèse a été suivie sur 15 min après induction par l'acide xanthurénique. Les peptides marqués par iTRAQ à partir de triplicatas biologiques ont été analysés par nanoLC/MS-MS et interprétés par les logiciels Patternlab et Blast2GO. Les phosphopeptides ont été enrichis au TiO2. Chez le parasite sauvage, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2617 peptides et chez le mutant, 530 protéines et 218 phosphoprotéines à partir de 3198 peptides. L'induction de la gamétogenèse est marquée par une transcription, une biosynthèse de protéines et de l'ADN importantes. Chez le mutant, la formation des fuseaux mitotiques et des axonèmes des flagelles des gamètes mâles est fortement affectée. Des protéines du complexe du protéasome dépendant de l'ubiquitine, de la réponse au stress, du métabolisme énergétique sont également affectées. Cette étude apporte de nouveaux éléments de compréhension sur le rôle joué par la kinésine 8 dans la gamétogenèse de Plasmodium. / Malaria is caused by parasites from Plasmodium genus and its gametogenesis is an essential step to ensure the malaria transmission. In efforts to improve the knowledge on gamete biology we did quantitative proteomic and phosphoproteomic comparative experiments with P. berghei WT and gametocytes disrupted for the motor gene kinesin 8. The mutant is morphologically similar to wild-type parasite but impaired gametogenesis and unable to exflagellate. The Gametocytes-enriched sample from mice at time T0 were xanthurenic acid-induced to exflagellate and harvested at time T7 and T15. The iTRAQ labelled peptides from independent biological triplicate sample were analyzed overtime through nanoLC/MS-MS Orbitrap after TiO2 enrichment, and interpreted by Patternlab and Blast2GO softwares. The wild type had 443 proteins and 206 phosphoproteins identified from 2,617 peptides. The mutant had 530 proteins and 218 phosphoproteins identified from 3,198 peptides. GO biological processes related to RNA translation, DNA and protein biosynthesis were most prominent and phosphorylated proteins are mainly RNA, ATP or protein binding proteins. Within the mutant, the axoneme and mitotic spindle microtubules disorganization were strongly affected. The nucleosome components are key to nuclear division disorganization. The ubiquitin-dependent proteasome complex and stress/folding response, energy metabolism and egress proteins were affected. The Plasmodium proteomic approach brings that insight into kinesin 8 critical importance for male gametogenesis in Plasmodium with effect on protein expression, phosphorylation modulation, flagellar organization and biology.

Résumé : INTRODUCTION : Les protéines doivent se retrouver dans le bon compartiment cellulaire afin de pouvoir exercer leurs fonctions. Une fois synthétisées dans le cytoplasme, les protéines se déplacent à travers les différents compartiments cellulaires, guidés par des signaux de ciblage protéique. Des modifications post-traductionnelles jouent un rôle dans la régulation et le contrôle dynamique de la localisation des protéines. Des exemples dans la littérature indiquent que cette régulation existe également au niveau pré-traductionnel. Ce projet cherche à investiguer cette régulation pré-traductionnelle sur les motifs d’import et d’export nucléaires choisi comme signaux modèles. A l’aide de la bio-informatique, nous caractérisons cette régulation pré-traductionnelle, pour ensuite analyser de façon quantitative le niveau du contrôle de l’inclusion de ces motifs dans les transcrits en considérant des données de RNA-seq. MÉTHODE : Des données du transcriptome humain ont été regroupées dans une base de données locale MySQL. Une curation extensive de bases de données publiques a permis d’identifier les motifs d’import et d’export nucléaires, validés expérimentalement. Des scripts dans les langages Python et PHP ont été créés afin d’interroger la base de données et d’implémenter les algorithmes. Par la suite des ensembles de données de RNA-seq ont été analysés pour quantifier le niveau d’inclusion de ces motifs. RÉSULTATS : La majorité de ces motifs varie pour les gènes dont seulement certaines isoformes contiennent ce motif. Nous avons pu déterminer la distribution de la position des motifs chez l’humain, et caractériser quatre différents types de régulation pré-traductionnelles pour ces motifs. Ces catégories sont : les sites d’initiation et de terminaison différentiels de transcription /traduction, l’épissage (d’introns/d’exons) et le décalage du cadre de lecture. L’index d’inclusion du motif (MII) varie pour les gènes à travers différents tissus d’un même ensemble de données et varie également dans des tissus cancéreux. Certains gènes produisent des isoformes dont le MII est tissu-spécifique. CONCLUSION : La régulation pré-traductionnelle de l’inclusion de motifs de ciblage d’import et d’export nucléaires joue un rôle important sur la localisation de la protéine résultante. Les données de RNA-seq ont abouti à une analyse quantitative sur ces motifs dans différents tissus normaux et cancéreux. / Abstract : INTRODUCTION: Proteins have to be in the right compartment in order to perform their functions. Once synthesized in the cytosol, proteins are guided by sorting signals as they move through different subcellular compartments. Post-translational modifications play a role in the regulation and dynamic control of protein localization. Some examples in the literature show that this regulation also exist at the pre-translational level. The purpose of this research is to investigate this regulation on nuclear import and export motifs, chosen as model signals. Using bioinformatics, we characterize this pre-translational regulation then using RNA-seq data, perform a quantitative analysis on the level of motif inclusion among transcripts. METHODS: Data of the human transcriptome was put in MySQL in house. For this study, we used experimental data. Extensive manual curation was performed on nuclear import and export motifs that were experimentally validated and obtained from public databases. In order to interrogate the database and implement the algorithms, scripts in Python and PHP were used. RNA-seq data were used and analyzed in order to quantify the level of inclusion of these motifs. RESULTS: The majority of these motifs are only present in a subset of the coding isoforms of the genes. The position distribution of these motifs in the human proteome was determined. We characterized four different types of pre-translational regulation for alternative motifs. The categories a re: differential initiation and termination sites of transcription/translation, splicing (of introns/exons) and frameshift mutation. Genes have a motif inclusion index (MII) that varies among different types of tissues within the same dataset and varies as well in cancer tissues. Some genes produce isoforms with MII that are tissue-specific. CONCLUSION: Pre-translational regulation plays an important role in the inclusion of nuclear import and export motifs and the localization of proteins containing them. Quantitative analyses showing the behaviour of the motifs in different types of normal and cancer tissues were performed with RNA-seq data.

La myostatine, un facteur de croissance de la superfamille des TGF-béta, régule négativement la croissance et la masse du muscle squelettique en contrôlant le nombre de fibres par son action anti-proliférative, et la croissance individuelle de chacune d'entre elles. Dans le but de compléter les connaissances sur ces mécanismes d'action, cette thèse (2006-2009) avait pour objectif d'identifier de nouvelles cibles moléculaires de la myostatine impliquées dans l'hypertrophie musculaire. Ce travail de thèse a révélé de nouvelles cibles de la myostatine, notamment une activation de la cascade PI3K/Akt, une expression différentielle des gènes et des protèines impliquées dans la régulation de la survie cellulaire. L'inhibition de l'apoptose des noyaux musculaires en l'absence de myostatins fonctionnelle, et par conséquent , l'augmentation du nombre de noyaux et de la taille du domaine nucléo-cytoplasmique pourraient ainsi contribuer au phénomène d'hypertrophie

Le cancer de la vessie représente le 4ième cancer de l'homme en Europe. Dans la majorité des cas, les primo-tumeurs sont traitées facilement par résection mais dans 60% des cas, il y a récidives sous formes plus agressives. Il est donc nécessaire de détecter au plus tôt ces récidives. A ce jour, l'examen de référence pour le diagnostic d'un cancer de la vessie est la cystoscopie. Cet examen permet d'examiner l'intérieur de la vessie à l'aide d'un système optique introduit via l'urètre. Cette méthode est spécifique et sensible mais inconfortable et invasive pour le patient. Il est donc important de trouver de nouvelles méthodes de diagnostic de tumeurs de la vessie et, de surveillance aussi sensibles et spécifiques pour réduire l'inconfort chez le patient et par la même occasion, le coût associés à la cystoscopie. La recherche de biomarqueurs protéiques dans l'urine représente une alternative majeure pour le diagnostic, le pronostic et le suivi thérapeutique de patients atteints de pathologies uro-génitales. Dans le cas présent du cancer de la vessie, la vessie joue le rôle de réservoir de cellules relarguées par la tumeur, ce qui fait de l'urine, fluide dit "proximal", le fluide idéal pour la recherche de biomarqueurs protéiques. Ces dernières années, la recherche de biomarqueurs protéiques a bénéficié de progrès spectaculaires dans le domaine de la spectrométrie de masse et de la biochimie, permettant d'accéder à une large variété de protéines sur une large gamme dynamique de concentration. De plus, l'apparition de nouvelles approches de protéomique quantitatives, telle que la stratégie "Accurate Mass and Time (AMT) tags" couplée à la quantification « label free », permet la comparaison de protéomes d'états physiologiques distincts par mesures d'abondances des protéines. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons ainsi développé un protocole expérimental couvrant l'ensemble du processus de découverte de nouveaux biomarqueurs associés au cancer de la vessie dans l'urine, i.e., de la collecte et préparation des échantillons d'urine à l'évaluation de méthodes de fractionnement pour la caractérisation la plus exhaustive possible du protéome urinaire, en utilisant des méthodes de protéomiques quantitatives et des méthodes de statistiques dédiées. Ce travail nous a permis de constituer une base de données contenant 2014 protéines urinaires. Des variations d'abondances ont été mesurées pour plus de la moitié d'entre elles, au travers d'une cohorte de 98 patients constituée de patients atteints de cancers de la vessie et de patients contrôles. Une liste finale composée de 97 candidats biomarqueurs du cancer de la vessie a été établit. Cette liste contient un grand nombre de protéines exosomales potentiellement sécrétées de façon spécifique par la tumeur. / Bladder cancer is the 4th type of cancer causing man death in Europe. In most cases, primary tumors can be easily removed by resection but in 60% of the cases, the tumors regrowth in more aggressive forms. Therefore, it is essential to detect early recurrence of bladder cancer. To date, the gold standard for the diagnosis of bladder cancer is cystoscopy. It allows the examination of the inside of the bladder using an optical system which is inserted in the urethra. This method is sensitive and specific but extremely uncomfortable and invasive for the patient. Therefore, it is crucial to find new diagnosis and monitoring methods for bladder tumour more comfortable for the patient, in a cost efficient way. The search for clinically useful protein biomarkers in the urine is a major alternative for the diagnosis, the prognostic and the therapeutic treatment of patients with urea-genital pathologies. In the specific case of the bladder cancer, the bladder contains the cells left by the tumour, and subsequently urine becomes the ideal fluid for biomarker investigation as a “proximal fluid”. In the last few years, the search for protein biomarkers has benefited of significant progress in the field of mass spectrometry and bio-chemistry, allowing the detection of a wide variety of proteins in a large dynamic range of concentrations. In addition, new approaches of quantitative proteomic, such as the “Accurate Mass and Time (AMT) tags” approach, coupled with the “label free” quantification, allows the comparison of proteomes from distinct physiological state by measuring protein abundances. During this thesis, we developed an experimental protocol covering the whole process of discovering new biomarkers associated to bladder cancer in urines, i.e., from the collection and preparation of urine samples, to the evaluation of the best fractioning method to define the urinary proteome using quantitative approaches and dedicated statistical methodologies. This work enables the population of a database containing 2014 urinary proteins. Abundance variations were measured for more than the half through a cohort of 98 healthy and bladder cancer patients. A final list of 97 biomarker candidates has been established. This list holds a significant number of exosomal proteins that are potentially secreted by the tumour.

Des populations tolérante (métallicole: M) et sensible (non-métallicole: NM) d’Agrostis capillaris L. ont été exposées à des doses croissantes de Cu (1-50 μM) pour étudier la tolérance au Cu par une approche pluridisciplinaire. Selon les paramètres phénotypiques (biomasse, longueur des feuilles et symptômes visuels), les plantes M ont une meilleure croissance aux expositions supérieures à 10 μM Cu. Les concentrations en Cu des tissus reflètent une rétention racinaire (phénotype d’exclusion) et une réduction de la translocation vers les feuilles quand le stress augmente. En excès de Cu, le protéome soluble racinaire présente des altérations du métabolisme énergétique chez M et NM, plus marquées chez NM (glycolyse, cycle de Krebs /phosphorylation oxydative). Le protéome foliaire indique des impacts sur les phases claires et obscures de la photosynthèse chez M et NM, et un besoin plus important en acides aminés soufrés (augmentation des cystéine et méthionine synthases). Chez NM, l’augmentation d’enzymes de la glycolyse, de la voie des pentoses phosphates et du cycle de Calvin indiquent un besoin énergétique accru, tandis que la stimulation des chaperonnes et des processus de synthèse protéique suggère des impacts sur le métabolisme des protéines et celle des enzymes redox un stress oxydatif plus fort. Plusieurs protéines, surexprimées ou accumulées, interviendraient dans la tolérance au Cu chez M, en protégeant le métabolisme des protéines (HSP70, racines et feuilles) et en augmentant les mécanismes anti-oxydants (ascorbate péroxydases), de détoxification (GST et aldéhyde déshydrogénase) et de protéolyse (peptidase et protéasomes, racines). / Cu-tolerant (metallicolous: M) and sensitive (non-metallicolous: NM) populations of Agrostis capillaris L. were exposed to increasing Cu concentrations (1-50 μM) to investigate Cu tolerance by a pluridisciplinary approach. Phenotypic parameters (biomass production, shoot length, and visual symptoms) indicated a higher growth and a better fitness of M plants over 10 μM Cu. Plant Cu concentrations indicated root Cu retention (‘excluder’ phenotype) and a reduced root-to-shoot translocation with increasing Cu stress. Based on root soluble proteome energy metabolism was altered by Cu excess in both populations with stronger impacts in NM (glycolysis, Krebs cycle/oxidative phosphorylation). Changes in shoot proteome showed impacts on both light dependent and independent photosynthesis phases in both populations, and an enhanced need in S-containing amino-acids (up-regulation of cysteine/methionine synthases). In NM leaves, increase of enzymes involved in glycolysis, pentose phosphate pathway and Calvin cycle indicated a stimulation of energy metabolism, while enhanced protein synthesis processes and protein chaperones suggested impacts on protein metabolism and increase of redox enzymes indicated a higher oxidative stress. Several over-expressed or accumulated proteins may be pivotal for Cu tolerance in M plants, for protecting protein metabolism (Heat shock protein 70kDa, roots and leaves), increasing anti-oxidative (ascorbate peroxidases, roots) – detoxification (Glutathione S-transferase and aldehyde dehydrogenase, roots) and proteolysis (peptidase and proteasome subunits) processes.

La maladie de Parkinson est une maladie neuro-dégénérative d'hypo-motricité. Des facteurs génétiques et environnementaux ont été mis en évidence dans son apparition. Les traitements reposent sur une approche pharmacologique ou chirurgicale. Le traitement par stimulation cérébrale profonde (SCP) mis au point par le Professeur Benabid a démontré son efficacité.<br />L'objectif de cette étude est de comprendre les mécanismes d'action de la SCP. Nous avons montré, par une étude du transcriptome par micro-array, que la stimulation électrique à haute fréquence provoque un profil d'expression génique propre. Les modifications de l'expression génique portent essentiellement sur des gènes de la synthèse et dégradation protéique ainsi que de la transcription et maturation des ARN. L'importance des contrôles qualités est mise en avant et nous présentons des moyens d'améliorer la reproductibilité des résultats de micro-array. L'étude a été poursuivi par une approche de l'expression protéique par incorporation de méthionine marquée et par spectrométrie de masse SELDI-TOF. Les résultats montrent une diminution significative de l'expression protéique lors de la stimulation électrique.

Ce travail a pour objet l'analyse de données transcriptome et protéome pour l'étude des réponses aux stress oxydants et aux métaux lourds, en particulier chez la cyanobactérie Synechocystis. Cet organisme procaryote permet notamment d'aider à la compréhension des plantes tout en étant facilement manipulable génétiquement. La démarche a d'abord consisté à analyser les réponses transcriptionnelles des gènes de Synechocystis en conditions de stress, notamment en présence de cadmium ou de peroxyde d'hydrogène. Des méthodes de prédiction d'interactions protéine-protéine ont ensuite été développées afin de construire un réseau d'interactions. Ce dernier a été comparé à un réseau d'interactions identifiées expérimentalement, notamment en termes de structure. Puis il a été complété avec les données de transcriptome précédemment analysées, afin d'obtenir une vision plus intégrée des différents phénomènes et d'étudier la dynamique des modules fonctionnels. Les résultats font apparaître différentes phases dans les réponses transcriptionnelles, ainsi que des groupes fonctionnels de protéines en interaction et co-exprimées. De plus, l'automatisation d'une méthode de classification mixte hiérarchique-pyramidale est proposée. Une méthode d'identification de biais de composition entre des groupes de protéines a aussi été développée. Par ailleurs, un outil de prédiction d'interactions protéine-protéine, applicable à toutes les espèces séquencées, a été développé. Ce logiciel open-source, InteroPorc, présente l'avantage d'être flexible, puisqu'il peut s'appliquer à différents jeux d'interactions sources. En outre, l'outil est facilement utilisable en ligne à travers une interface web.