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Analyse phosphoprotéomique pour la recherche de biomarqueurs : développements et applications / Phosphoproteomics in cancer biomarkers discovery : chromatographic development and applicationsNegroni, Luc 13 December 2013 (has links)
L’analyse protéomique est une méthode de choix pour la recherche de biomarqueurs. Sans à priori, elle permet d’établir un catalogue de protéines qui sont exprimées dans une cellule, un tissu ou un organisme entier. Cette approche a été mise en œuvre pour une analyse protéomique de cellules coliques cancéreuses et une analyse phosphoprotéomique de biopsies hépatiques.L’étude de cellules coliques cancéreuses transformées par le gène cytosine désaminase et traitées par la prodrogue 5-fluorocytosine a été réalisée par électrophorèse bidimensionnelle des extraits protéiques. L’analyse d’image a permis la quantification de 353 protéines et isoformes dont 14 sont surexprimées et 4 sous exprimées lors d’un traitement par la prodrogue. Parmi les protéines dont l’expression est affectée par le traitement, l’HSP90 présente un niveau d’expression constant mais est identifiée sous deux formes qui diffèrent par leur pI. L’analyse par spectrométrie de masse à identifier une phosphorylation de ser 254 qui pourrait contribuer à la régression tumorale.Après avoir développé une méthode HPLC-TiO2 pour la purification de phosphopeptides, une analyse protéomique de 24 biopsies humaines provenant de carcinomes hépatocellulaires sur foie non fibreux (nf-CHC) et de tissus sains a été réalisée avec la technologie iTRAQ. Les peptides surexprimés dans les tumeurs correspondent à des protéines de choc thermiques, des protéines liées à l’ADN/ARN (histones, protéines du splicéosome), des protéines de la phase 1 de la détoxification (carboxyestérase, époxide hydrolase), les protéines du cytosquelette (actinine, tubuline), des protéines ou enzymes anti-oxydantes (superoxide dismutase, thiorédoxine). Les peptides sous-exprimés correspondent à des protéines du cycle de l’urée, de la détoxification (alcool déhydrogénase) du métabolisme des sucres, des lipides et des acides aminés. Dans la fraction TiO2, 19 phosphopeptides sont significativement surexprimés et 15 phosphopeptides sont significativement sous exprimés, mettant en en évidence une surreprésentation du motif –(S/T)P- parmi les phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs. Une activation des proline directed kinases ou une inhibition des phosphatases correspondantes est donc probablement un événement caractéristique des nf-CHC. Ces peptides/protéines dérégulées sont autant de biomarqueurs potentiels pour le carcinome hépatocellulaire. / Proteomic is a method of choice for biomarker research, without a priori, it establishes a directory of proteins that are expressed in a cell, tissue or an entire organism. This approach has been implemented for proteomic analysis of colon cancer cells and phosphoproteomic analysis of liver biopsies.The study of colon cancer cells transformed by the cytosine deaminase and treated with the prodrug 5-fluorocytosine was performed by two-dimensional electrophoresis. Image analysis allowed the quantification of 353 proteins, 14 isoforms are overexpressed and 4 under expressed during treatment with the prodrug. Among the proteins whose expression is affected by the treatment, HSP90 has a constant level of expression, but is identified in two isoforms that differ in their pI. Mass spectrometry identified phosphorylation of ser 254 which could contribute to tumour regression.After developed an HPLC- TiO2 method for the purification of phosphopeptides, a proteomic analysis of 24 biopsies from human hepatocellular carcinoma on non-fibrous liver (nfCHC) and normal tissue was performed with the iTRAQ technology. Peptides overexpressed in tumours correspond to HSPs, DNA / RNA binding proteins (histones, spliceosome), proteins form Phase 1 detoxification (carboxyesterase, epoxide hydrolase), the cytoskeletal proteins (actinin, tubulin), antioxidant proteins or enzymes (superoxide dismutase, thioredoxin). The under-expressed peptides belong to proteins of the urea cycle, the detoxification (alcohol dehydrogenase) metabolism of sugars, lipids and amino acids. In the TiO2 fraction, 19 phosphopeptides are significantly overexpressed and 15 phosphopeptides were significantly under-expressed. This phosphoproteome has demonstrated an overrepresentation of the (S/T)P pattern among overexpressed phosphopeptides, indicating activation of proline-directed kinases in nfCHC or inhibition of the corresponding phosphatases. These deregulated peptides/proteins are as potential biomarkers for hepatocellular carcinoma.
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Développement d’un laboratoire sur puce pour la préconcentration sur support monolithique. Application à l'enrichissement et la séparation en ligne de phosphopeptides. / Development of a lab on-a-chip for monolith-based preconcentration and separation of phosphopeptidesAraya-Farias, Monica 22 March 2016 (has links)
Les laboratoires sur puce sont des dispositifs miniaturisés qui offrent la possibilité d'intégrer en ligne toutes les étapes de la chaîne analytique tout en réduisant les volumes d’échantillon et les temps d’analyse. Ainsi, ils constituent potentiellement un outil de diagnostic particulièrement adapté pour l’analyse de biomarqueurs phosphorylés, pour lesquels une préconcentration est nécessaire en raison de leur faible abondance dans les fluides biologiques. C’est pourquoi, de nouvelles méthodes, dédiées à l'enrichissement de phosphopeptides, ont été développées ces dernières années et en particulier celles utilisant des supports solides basées sur la chromatographie d’affinité sur des ions métalliques immobilisés (IMAC). Parmi les supports solides intégrables en microsystème, les monolithes organiques constituent une option privilégiée grâce à la possibilité d’être synthétisés in situ. Le but de ce travail de thèse était donc de développer un laboratoire sur puce intégrant une préconcentration des phosphopeptides sur support monolithique basé sur le principe de l’IMAC et leur séparation électrophorétique en ligne.Dans un premier temps, nous avons développé deux approches innovantes qui ont permis de synthétiser pour la première fois un monolithe à base d’éthylène glycol méthacrylate phosphate (EGMP) et de bisacrylamide (BAA) par voie photochimique dans des microsystèmes. La première stratégie développée dans des puces en verre repose sur la synthèse du monolithe à l’aide d’un microscope à épifluorescence. La deuxième approche est basée sur les propriétés photochimiques d’un nouvel amorceur qui a permis de synthétiser et d’ancrer le monolithe, en une seule étape, aux parois des puces en polydiméthylsiloxane (PDMS). Une caractérisation de ce monolithe en termes de morphologie, de perméabilité, de porosité et de surface spécifique a ensuite été réalisée. Ceci a permis de démontrer le potentiel de ce monolithe pour la préconcentration.Dans un deuxième temps, une méthode de séparation par électrophorèse couplée à une détection par fluorescence a été développée sur puce en verre. Celle-ci a permis de séparer un mélange de phosphopeptides modèles fluorescents possédant différents sites et degrés de phosphorylation. Les phosphopeptides ont été détectés en moins de 2 min avec une excellente résolution (R>3) et une bonne efficacité (plateaux théoriques compris entre 11000 et 25000). Enfin, le couplage en ligne du module de préconcentration monolithique et de séparation/détection a été réalisé. Sur ce dispositif miniaturisé, une préconcentration basée sur l’IMAC-Zr4+ a ainsi été développée. L’efficacité de la capture et de l’élution des phosphopeptides a été démontrée et des facteurs de préconcentration supérieurs à 340 ont été obtenus. En conclusion, ce laboratoire sur puce ouvre des perspectives très prometteuses dans le domaine du diagnostic de pathologies dont le processus physiopathologique implique des phosphopeptides.Mots clés : laboratoire sur puce, microsystème, phosphopeptide, IMAC, monolithe, photopolymérisation, préconcentration, électrophorèse sur puce / A lab on-a-chip is a miniaturized device that integrates onto a single chip different analytical steps (preconcentration, separation, detection...) with minimal sample consumption and short analysis time. They are potentially beneficial in phosphorylated biomarker analysis for which a preconcentration step is necessary because of their low abundance in biological fluids. That's why selective enrichment methods of phosphopeptides have been developed in recent years in particular those based on solid supports like Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC). Among the solid supports, organic polymer monoliths present practical advantages when used in microchips due to their ease of preparation and in situ polymerization. The aim of this work was to develop a lab-on-a-chip integrating a monolithic support for online IMAC-based preconcentration and electrophoretic separation of phosphopeptides.In the first part, we developed two innovative approaches which allowed us to synthesize, for the first time, an ethylene glycol methacrylate phosphate-co-bisacrylamide (poly (EGMP-co-BAA)) monolith by a photo-driven process in microsystems. The first monolith synthesis approach was developed in glass microchannels using an inverted epifluorescence microscope as UV-irradiation source. The second approach was based on the photochemical properties of a new initiator which allowed the simultaneous synthesis and anchorage of the monolith in native polydimethylsiloxane (PDMS) microchips. A characterization (morphology, permeability, porosity and specific surface area) of (poly (EGMP-co-BAA)) monolith was then performed which demonstrated the potential of this monolith for preconcentration.Then a glass microchip electrophoresis method coupled to a detection by fluorescence was developed to separate a mixture of phosphopeptides fluorescent models differing with the position and number of phosphorylation sites. The phosphopeptides were detected in less than 2 min with excellent resolution (R> 3) and good efficiencies ranging from 11000 to 25000 plates. Finally, an integrated microdevice was developed by combining online preconcentration based on IMAC-Zr4+ and separation/detection of phosphopeptides. The performance of this integrated microdevice to capture and to elute the phosphopeptides was demonstrated and signal enhancement factors (SEF) higher than 340 were obtained. This lab-on-a-chip device opens news perspectives for phosphoproteomic applications and the diagnostic of diseases where the pathophysiological process involves phosphopeptides
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Analyse phosphoprotéomique pour la recherche de biomarqueurs : développements et applicationsNegroni, Luc 13 December 2013 (has links) (PDF)
L'analyse protéomique est une méthode de choix pour la recherche de biomarqueurs. Sans à priori, elle permet d'établir un catalogue de protéines qui sont exprimées dans une cellule, un tissu ou un organisme entier. Cette approche a été mise en œuvre pour une analyse protéomique de cellules coliques cancéreuses et une analyse phosphoprotéomique de biopsies hépatiques.L'étude de cellules coliques cancéreuses transformées par le gène cytosine désaminase et traitées par la prodrogue 5-fluorocytosine a été réalisée par électrophorèse bidimensionnelle des extraits protéiques. L'analyse d'image a permis la quantification de 353 protéines et isoformes dont 14 sont surexprimées et 4 sous exprimées lors d'un traitement par la prodrogue. Parmi les protéines dont l'expression est affectée par le traitement, l'HSP90 présente un niveau d'expression constant mais est identifiée sous deux formes qui diffèrent par leur pI. L'analyse par spectrométrie de masse à identifier une phosphorylation de ser 254 qui pourrait contribuer à la régression tumorale.Après avoir développé une méthode HPLC-TiO2 pour la purification de phosphopeptides, une analyse protéomique de 24 biopsies humaines provenant de carcinomes hépatocellulaires sur foie non fibreux (nf-CHC) et de tissus sains a été réalisée avec la technologie iTRAQ. Les peptides surexprimés dans les tumeurs correspondent à des protéines de choc thermiques, des protéines liées à l'ADN/ARN (histones, protéines du splicéosome), des protéines de la phase 1 de la détoxification (carboxyestérase, époxide hydrolase), les protéines du cytosquelette (actinine, tubuline), des protéines ou enzymes anti-oxydantes (superoxide dismutase, thiorédoxine). Les peptides sous-exprimés correspondent à des protéines du cycle de l'urée, de la détoxification (alcool déhydrogénase) du métabolisme des sucres, des lipides et des acides aminés. Dans la fraction TiO2, 19 phosphopeptides sont significativement surexprimés et 15 phosphopeptides sont significativement sous exprimés, mettant en en évidence une surreprésentation du motif -(S/T)P- parmi les phosphopeptides surexprimés dans les tumeurs. Une activation des proline directed kinases ou une inhibition des phosphatases correspondantes est donc probablement un événement caractéristique des nf-CHC. Ces peptides/protéines dérégulées sont autant de biomarqueurs potentiels pour le carcinome hépatocellulaire.
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Etude des événements moléculaires de la gamétogenèse de Plasmodium berghei par des approches protéomiques / Estudo dos eventos moleculares da gametogênese de Plasmodium berghei por abordagens proteômicas / Investigation of the molecular events in Plasmodium berghei gametogenesis through proteomic approachesSaraiva Garcia, Carlos Henrique 27 October 2016 (has links)
Le paludisme est causé par des parasites du genre Plasmodium et la gamétogenèse est une étape essentielle à sa transmission. Afin d'améliorer les connaissances sur la genèse des gamètes, nous avons mené des études protéomiques sur des gamétocytes de P. berghei sauvages ou mutants avec le gène moteur de la kinésine 8 interrompu. Le mutant est morphologiquement semblable au type sauvage mais incapable de compléter la gamétogenèse et les gamètes mâles d'exflageller. A partir d'échantillons enrichis en gamétocytes, la gamétogenèse a été suivie sur 15 min après induction par l'acide xanthurénique. Les peptides marqués par iTRAQ à partir de triplicatas biologiques ont été analysés par nanoLC/MS-MS et interprétés par les logiciels Patternlab et Blast2GO. Les phosphopeptides ont été enrichis au TiO2. Chez le parasite sauvage, 443 protéines et 206 phosphoprotéines ont été identifiées à partir de 2617 peptides et chez le mutant, 530 protéines et 218 phosphoprotéines à partir de 3198 peptides. L'induction de la gamétogenèse est marquée par une transcription, une biosynthèse de protéines et de l'ADN importantes. Chez le mutant, la formation des fuseaux mitotiques et des axonèmes des flagelles des gamètes mâles est fortement affectée. Des protéines du complexe du protéasome dépendant de l'ubiquitine, de la réponse au stress, du métabolisme énergétique sont également affectées. Cette étude apporte de nouveaux éléments de compréhension sur le rôle joué par la kinésine 8 dans la gamétogenèse de Plasmodium. / Malaria is caused by parasites from Plasmodium genus and its gametogenesis is an essential step to ensure the malaria transmission. In efforts to improve the knowledge on gamete biology we did quantitative proteomic and phosphoproteomic comparative experiments with P. berghei WT and gametocytes disrupted for the motor gene kinesin 8. The mutant is morphologically similar to wild-type parasite but impaired gametogenesis and unable to exflagellate. The Gametocytes-enriched sample from mice at time T0 were xanthurenic acid-induced to exflagellate and harvested at time T7 and T15. The iTRAQ labelled peptides from independent biological triplicate sample were analyzed overtime through nanoLC/MS-MS Orbitrap after TiO2 enrichment, and interpreted by Patternlab and Blast2GO softwares. The wild type had 443 proteins and 206 phosphoproteins identified from 2,617 peptides. The mutant had 530 proteins and 218 phosphoproteins identified from 3,198 peptides. GO biological processes related to RNA translation, DNA and protein biosynthesis were most prominent and phosphorylated proteins are mainly RNA, ATP or protein binding proteins. Within the mutant, the axoneme and mitotic spindle microtubules disorganization were strongly affected. The nucleosome components are key to nuclear division disorganization. The ubiquitin-dependent proteasome complex and stress/folding response, energy metabolism and egress proteins were affected. The Plasmodium proteomic approach brings that insight into kinesin 8 critical importance for male gametogenesis in Plasmodium with effect on protein expression, phosphorylation modulation, flagellar organization and biology.
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ELEMENTAL SPECIATION ANALYSIS OF METALS, PHOSPHORUS AND SULFUR: EXPLORING ENVIRONMENTAL AND BIOLOGICAL SAMPLESELLIS, JENNY L. January 2007 (has links)
No description available.
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Characterization of a serine/threonine phosphatase-kinase pair in Bacillus anthracisShakir, Salika Mehreen. January 2010 (has links) (PDF)
Thesis (Ph. D.)--University of Oklahoma. / Bibliography: leaves 116-129.
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Enhanced gel electrophoresis (GE) and inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS) based methods for the identification and separation of proteins and peptidesHaider, Syed January 2012 (has links)
The main focus of the PhD study was to develop new gel electrophoresis and ICP-MS based methods to analyze a wide variety of the bio-molecules such as proteins, phosphoproteins and metalloproteins etc. The tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (tricine-SDS-PAGE) method is commonly used to resolve low molecular mass proteins, however, it requires a high percentage gel and a very complicated procedure to achieve this separation. This study describes a modification to tricine-SDS-PAGE to make it more effective for the separation of smaller proteins and for coupling to ICP-MS. The modified method employs low percentage PAGE gels and low reagent concentrations that provide efficient separations, good quantitation and low matrix levels that are compatible with ICP-MS. This modified method was applied to analyze phosphopeptides. Phosphopeptides are very small in size and difficult to separate using the other techniques such as Laemmli SDS-PAGE, original tricine-SDS-PAGE, immobilized metal affinity chromatography (IMAC), size exclusion chromatography (SEC) etc. In this study a simplified procedure is described based on modifying the original tricine-SDS-PAGE method. A comparative study showed that this modified method successfully resolved a digest mixture of very low to high molecular mass phosphopeptides/peptides. In off-line coupling of this method with ICP-MS, much better recoveries of the peptides from the gel were obtained as compared to traditional methods which indicate the compatibility of this modified method for quantitative studies. An on-line coupling of the modified system with ICP-MS was also demonstrated and it was applied for the separation, detection and quantification of phosphopeptides. Another application of this modified system was the separation of serum proteins. Blood serum contains five major protein groups i.e., albumin, alpha-1 globulin, alpha-2 globulin, beta globulin and gamma globulin. The separation of these five major proteins in a single gel is difficult to achieve using traditional methods. The modified system was shown to be superior for the separation of these serum proteins in a 7% (m/v) native-PAGE gel and a cellulose acetate membrane. A further study was carried out into controlling the factors that cause metal loss and protein fragmentation in SDS-PAGE. Using a reducing sample buffer, and heating to high temperatures (90-100ºC) in alkaline or acidic conditions may cause protein fragmentation and decrease the metal binding affinity. 70ºC was found suitable to prepare the sample at neutral, alkaline or acidic pH as no fragmentation observed. To prevent metal loss, the binding constant (log K) values of metal-amino acids, play the major role. Those metals which have high binding affinities with the amino acids in proteins can also be affected by the variation of the pH so prior information about pH to maintain the binding constant values is essential to minimize metal loss. This was observed in the loss of zinc, and to a lesser extent copper from human serum albumin (HSA) as measured by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). The method described above was applied for the separation and quantification of the serum proteins obtained from age-related macular degeneration (AMD) patients (where the AMD patients were from Moorfields Eye Hospital, London). Zn and Cu were quantified employing external calibration. Zn concentration showed variation whilst Cu did not show any significant variations in samples from AMD patients. A brief study of the interaction of cisplatin and oxaliplatin with HSA and transferrin was also performed. Cisplatin bound much faster than oxaliplatin with HSA. After 24 hours incubation, cisplatin showed a decrease in signal intensity which indicates that cisplatin binding decreases with time. Cisplatin binding with transferrin as compared to HSA was not significant, which could be the result of unstable Pt-transferrin complex formation. Oxaliplatin did not show high binding to either protein, perhaps due to the presence of the bulky, non polar DACH ligand.
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Neue zellpenetrierende Phosphopeptide für die molekulare BildgebungRichter, Susan 15 July 2011 (has links) (PDF)
Im Kontext komplexer zellulärer Prozesse stellen Phosphopeptide essentielle bioaktive Verbindungen dar, die mit Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen eng verbunden sind. Diese Prozesse sind in die Regulation nahezu jeder zellulären Funktion involviert und spielen damit ebenso im Falle von Erkrankungen eine tragende Rolle. Synthetische Phosphopeptide könnten in Form molekularer Sonden zur Charakterisierung dieser physiologisch fundamentalen Prozesse beitragen. Die radiopharmazeutische Forschung brachte in den letzten zwei Jahrzehnten zahlreiche radiomarkierte Peptide für das Peptidrezeportargeting im Rahmen der Tumordiagnose und -therapie hervor. Unter diesen regulatorischen Peptiden mit vorwiegend neuroendokrinem Ursprung sind bisher keine radiomarkierten Phosphopeptide für die Anwendung in der molekularen Bildgebung bekannt.
Das Anliegen dieser Arbeit ist es, grundlegende Erkenntnisse zur Synthese und Markierung von Phosphopeptiden zu erlangen. Neben der Etablierung der Radiomarkierung von Phosphopeptiden mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 und deren radiopharmakologischen Charakterisierung steht auch die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluorophor 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) im Fokus. Phosphopeptidliganden der kürzlich identifizierten Polo-Box-Domäne (PBD) als Phosphopeptid-bindende Proteindomäne der Zellzykluskinase Plk1, die ebenso ein interessantes onkologisches Target darstellt, wurden für diese Arbeit als Model ausgewählt. Es stand ein Repertoire verschiedenster Methoden zur Verfügung, welche molekulare Bildgebung mittels Kleintier-PET, wie auch optische Bildgebung und die Radiomarkierung mittels klassischer und Mikrofluidik-Technik beinhalten.
Im ersten Abschnitt der Promotion wurden kürzlich vorgestellte Plk1-PBD-gerichtete Phosphopeptide mit einer Ser-pThr-Kernsequenz ausgewählt und deren Darstellung mit der Fmoc-gestützten orthogonalen Festphasenpeptidsynthese (SPPS) vollzogen. Dabei erfolgt die Umsetzung nach dem Prinzip des Synthon-basierten Ansatzes, der den Einsatz des monobenzylierten Phosphothreonin-Bausteines involviert. Das Uronium-basierte Kupplungs- und Aktivierungsreagenz HBTU/HOBt/DIPEA, sowie das Abspaltreagenz TFA/Wasser/Thioanisol/EDT als eine modifizierte Variante des Reagenz K garantiert die zuverlässige Synthese von Phosphopeptiden unter Erhalt der Phosphatfunktion. Zur Charakterisierung der Peptide wurden HPLC und Massenspektrometrie als geeignete Methoden herangezogen.
An die erfolgreiche Darstellung von Phosphopeptiden schloss sich im Weiteren die Ausarbeitung einer zuverlässigen Radiomarkierungsstrategie mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 an. Das bifunktionelle, aminogruppenselektive Agenz
N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat ([18F]SFB) ist für eine indirekte und milde Markierung von Peptiden geeignet. Durch Optimierung der N-terminalen 18F-Fluorbenzoylierung des Phosphopeptides MQSpTPL 2 hinsichtlich der Verwendung eines 0,05 M Na2HPO4-Puffers (pH 9) als Reaktionsmedium bei geringer Peptidmenge (0,5 mg), sowie 40°C Reaktionstemperatur und 30 min Reaktionszeit kann das 18F-markierte Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 in guten radiochemischen Ausbeuten von 25-28%, mit entsprechender radiochemischer Reinheit >95% mittels HPLC-Reinigung und guter spezifischer Aktivität (20-40 GBq/µmol) hergestellt werden.
Der Einsatz von Peptiden ist für die molekulare Bildgebung besonders attraktiv, jedoch oftmals durch ihre Instabilität in vivo, ausgelöst durch ubiquitär vorhandene endogene Peptidasen, limitiert. Beispielsweise besitzt ein N-terminal 18F-fluorbenzoyliertes Neurotensin(8-13) eine biologische Halbwertszeit von weniger als 5 min in vivo. Mit dem neuartigen 18F-markierten Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 wurde ein Peptid geschaffen, das in vitro und besonders in vivo außerordentlich hohe Stabilität von > 50% nach 60 min aufweist und damit wegweisende Eigenschaften für die Entwicklung neuer stabiler Radiopeptide für die molekulare Bildgebung aufzeigt.
Da Phosphopeptiden aufgrund ihrer negativgeladenen Phosphatfunktionalität ein intrazellulärer Zugang verwehrt bleibt, wie auch in dieser Arbeit an den Tumorzelllinien HT-29 und FaDu nachgewiesen wurde, steht die Realisierung einer verbesserten intrazellulären Internalisierung von Phosphopeptiden im Blickfeld des zweiten Teils der Promotion. Der Versuch einer gezielten Zellaufnahme über rezeptorinternalisierende Peptide wurde mit dem Neuropeptidhormon Neurotensin(8-13) (NT(8-13)), welches über einen G-Protein-gekoppelten Mechanismus in die Zelle gelangt, beschritten. Jedoch zeigte ein Triazol-verbrücktes Konjugat 8 aus NT(8-13) als molekularer Transporter und dem Phosphopeptid MQSpTPL 2, welches auf Basis der Azid-Alkin-Click-Chemie synthetisiert wurde, anhand seiner niedrigen Bindungsaffinität (IC50 = 8,33 µM) kein Potential zu einer erfolgreichen Zellinternalisierung des Phosphopeptides.
Vermittler eines rezeptorunabhängigen molekularen Zelltransportes stellen zellpenetrierende Peptide (CPP) dar. Versuche mit den derzeit kürzesten CPPs, den zellpenetrierenden Pentapeptiden (CPP5) oder auch Bax-Inhibitoren genannt, waren nicht erfolgreich. Zwei weitere, in dieser Arbeit verwendete, potente CPPs sind sC18, abgeleitet aus dem antimikrobiellen Peptid Cathelicidin, sowie hCT(18-32)-k7, einem verzweigten Calcitonin-Derivat. Mit den Phosphopeptid-CPP-konjugierten Verbindungen MQSpTPL-sC18 2-CPP1 und MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 2-CPP2 wurden nicht-toxische Konstrukte geschaffen, die eine definierte Aufnahme in HeLa, MCF-7 und HT-29 Zellen aufweisen, wie nach Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxfluorescein (CF) mittels optischer Bildgebung nachgewiesen werden konnte.
Die Integration und Anwendung der Mikrofluidik-Technik im Rahmen der Darstellung der N-terminal 18F-fluorbenzoylierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate [18F]FBz-MQSpTPL-sC18 [18F]2-CPP3 und [18F]FBz-MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 [18F]2-CPP4 weist im Vergleich zur konventionellen Radiomarkierung entscheidende Vorteile auf. In Anwesenheit der für die [18F]SFB-Markierung reaktiven ε-NH2-Gruppen in den CPP-Fragmenten zeichnet sich im Rahmen der mikrofluiden Markierung entscheidende Selektivität für den N-Terminus der Peptide ab. Die radiochemischen Markierungsausbeuten betragen 21% für [18F]2-CPP3 und 26% für [18F]2-CPP4, im Vergleich zu 2-4% für [18F]2-CPP3 und [18F]2-CPP4 bei klassischer Markierung. In Zellaufnahmestudien wurde ebenfalls eine Internalisierung der 18F-markierten Konjugate in FaDu, HT-29 und MCF-7 Zellen bestätigt, die in allen drei Zelllinien vergleichbar ist und um 40% ID/mg Protein liegt. Wie auch das 18F-markierte Hexaphosphopeptid selbst in Wistar-Unilever-Ratten, zeigten die 18F-markierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate in Kleintier-PET-Untersuchungen in Balb/C-Mäusen (Normaltiere) die für ein radiomarkiertes Peptid typische Bioverteilung. Hierbei ist eine renale Exkretion eingeschlossen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, erstmals 18F-markierte Phosphopeptide mit zellpenetrierenden Eigenschaften für die molekulare Bildgebung zu entwickeln. Diese neuen zellpenetrierenden Phosphopeptide stehen für die Untersuchung intrazellulärer Prozesse, die auf Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsprozessen basieren, zur Verfügung.
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Neue zellpenetrierende Phosphopeptide für die molekulare BildgebungRichter, Susan 04 May 2011 (has links)
Im Kontext komplexer zellulärer Prozesse stellen Phosphopeptide essentielle bioaktive Verbindungen dar, die mit Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen eng verbunden sind. Diese Prozesse sind in die Regulation nahezu jeder zellulären Funktion involviert und spielen damit ebenso im Falle von Erkrankungen eine tragende Rolle. Synthetische Phosphopeptide könnten in Form molekularer Sonden zur Charakterisierung dieser physiologisch fundamentalen Prozesse beitragen. Die radiopharmazeutische Forschung brachte in den letzten zwei Jahrzehnten zahlreiche radiomarkierte Peptide für das Peptidrezeportargeting im Rahmen der Tumordiagnose und -therapie hervor. Unter diesen regulatorischen Peptiden mit vorwiegend neuroendokrinem Ursprung sind bisher keine radiomarkierten Phosphopeptide für die Anwendung in der molekularen Bildgebung bekannt.
Das Anliegen dieser Arbeit ist es, grundlegende Erkenntnisse zur Synthese und Markierung von Phosphopeptiden zu erlangen. Neben der Etablierung der Radiomarkierung von Phosphopeptiden mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 und deren radiopharmakologischen Charakterisierung steht auch die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluorophor 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) im Fokus. Phosphopeptidliganden der kürzlich identifizierten Polo-Box-Domäne (PBD) als Phosphopeptid-bindende Proteindomäne der Zellzykluskinase Plk1, die ebenso ein interessantes onkologisches Target darstellt, wurden für diese Arbeit als Model ausgewählt. Es stand ein Repertoire verschiedenster Methoden zur Verfügung, welche molekulare Bildgebung mittels Kleintier-PET, wie auch optische Bildgebung und die Radiomarkierung mittels klassischer und Mikrofluidik-Technik beinhalten.
Im ersten Abschnitt der Promotion wurden kürzlich vorgestellte Plk1-PBD-gerichtete Phosphopeptide mit einer Ser-pThr-Kernsequenz ausgewählt und deren Darstellung mit der Fmoc-gestützten orthogonalen Festphasenpeptidsynthese (SPPS) vollzogen. Dabei erfolgt die Umsetzung nach dem Prinzip des Synthon-basierten Ansatzes, der den Einsatz des monobenzylierten Phosphothreonin-Bausteines involviert. Das Uronium-basierte Kupplungs- und Aktivierungsreagenz HBTU/HOBt/DIPEA, sowie das Abspaltreagenz TFA/Wasser/Thioanisol/EDT als eine modifizierte Variante des Reagenz K garantiert die zuverlässige Synthese von Phosphopeptiden unter Erhalt der Phosphatfunktion. Zur Charakterisierung der Peptide wurden HPLC und Massenspektrometrie als geeignete Methoden herangezogen.
An die erfolgreiche Darstellung von Phosphopeptiden schloss sich im Weiteren die Ausarbeitung einer zuverlässigen Radiomarkierungsstrategie mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 an. Das bifunktionelle, aminogruppenselektive Agenz
N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat ([18F]SFB) ist für eine indirekte und milde Markierung von Peptiden geeignet. Durch Optimierung der N-terminalen 18F-Fluorbenzoylierung des Phosphopeptides MQSpTPL 2 hinsichtlich der Verwendung eines 0,05 M Na2HPO4-Puffers (pH 9) als Reaktionsmedium bei geringer Peptidmenge (0,5 mg), sowie 40°C Reaktionstemperatur und 30 min Reaktionszeit kann das 18F-markierte Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 in guten radiochemischen Ausbeuten von 25-28%, mit entsprechender radiochemischer Reinheit >95% mittels HPLC-Reinigung und guter spezifischer Aktivität (20-40 GBq/µmol) hergestellt werden.
Der Einsatz von Peptiden ist für die molekulare Bildgebung besonders attraktiv, jedoch oftmals durch ihre Instabilität in vivo, ausgelöst durch ubiquitär vorhandene endogene Peptidasen, limitiert. Beispielsweise besitzt ein N-terminal 18F-fluorbenzoyliertes Neurotensin(8-13) eine biologische Halbwertszeit von weniger als 5 min in vivo. Mit dem neuartigen 18F-markierten Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 wurde ein Peptid geschaffen, das in vitro und besonders in vivo außerordentlich hohe Stabilität von > 50% nach 60 min aufweist und damit wegweisende Eigenschaften für die Entwicklung neuer stabiler Radiopeptide für die molekulare Bildgebung aufzeigt.
Da Phosphopeptiden aufgrund ihrer negativgeladenen Phosphatfunktionalität ein intrazellulärer Zugang verwehrt bleibt, wie auch in dieser Arbeit an den Tumorzelllinien HT-29 und FaDu nachgewiesen wurde, steht die Realisierung einer verbesserten intrazellulären Internalisierung von Phosphopeptiden im Blickfeld des zweiten Teils der Promotion. Der Versuch einer gezielten Zellaufnahme über rezeptorinternalisierende Peptide wurde mit dem Neuropeptidhormon Neurotensin(8-13) (NT(8-13)), welches über einen G-Protein-gekoppelten Mechanismus in die Zelle gelangt, beschritten. Jedoch zeigte ein Triazol-verbrücktes Konjugat 8 aus NT(8-13) als molekularer Transporter und dem Phosphopeptid MQSpTPL 2, welches auf Basis der Azid-Alkin-Click-Chemie synthetisiert wurde, anhand seiner niedrigen Bindungsaffinität (IC50 = 8,33 µM) kein Potential zu einer erfolgreichen Zellinternalisierung des Phosphopeptides.
Vermittler eines rezeptorunabhängigen molekularen Zelltransportes stellen zellpenetrierende Peptide (CPP) dar. Versuche mit den derzeit kürzesten CPPs, den zellpenetrierenden Pentapeptiden (CPP5) oder auch Bax-Inhibitoren genannt, waren nicht erfolgreich. Zwei weitere, in dieser Arbeit verwendete, potente CPPs sind sC18, abgeleitet aus dem antimikrobiellen Peptid Cathelicidin, sowie hCT(18-32)-k7, einem verzweigten Calcitonin-Derivat. Mit den Phosphopeptid-CPP-konjugierten Verbindungen MQSpTPL-sC18 2-CPP1 und MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 2-CPP2 wurden nicht-toxische Konstrukte geschaffen, die eine definierte Aufnahme in HeLa, MCF-7 und HT-29 Zellen aufweisen, wie nach Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxfluorescein (CF) mittels optischer Bildgebung nachgewiesen werden konnte.
Die Integration und Anwendung der Mikrofluidik-Technik im Rahmen der Darstellung der N-terminal 18F-fluorbenzoylierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate [18F]FBz-MQSpTPL-sC18 [18F]2-CPP3 und [18F]FBz-MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 [18F]2-CPP4 weist im Vergleich zur konventionellen Radiomarkierung entscheidende Vorteile auf. In Anwesenheit der für die [18F]SFB-Markierung reaktiven ε-NH2-Gruppen in den CPP-Fragmenten zeichnet sich im Rahmen der mikrofluiden Markierung entscheidende Selektivität für den N-Terminus der Peptide ab. Die radiochemischen Markierungsausbeuten betragen 21% für [18F]2-CPP3 und 26% für [18F]2-CPP4, im Vergleich zu 2-4% für [18F]2-CPP3 und [18F]2-CPP4 bei klassischer Markierung. In Zellaufnahmestudien wurde ebenfalls eine Internalisierung der 18F-markierten Konjugate in FaDu, HT-29 und MCF-7 Zellen bestätigt, die in allen drei Zelllinien vergleichbar ist und um 40% ID/mg Protein liegt. Wie auch das 18F-markierte Hexaphosphopeptid selbst in Wistar-Unilever-Ratten, zeigten die 18F-markierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate in Kleintier-PET-Untersuchungen in Balb/C-Mäusen (Normaltiere) die für ein radiomarkiertes Peptid typische Bioverteilung. Hierbei ist eine renale Exkretion eingeschlossen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, erstmals 18F-markierte Phosphopeptide mit zellpenetrierenden Eigenschaften für die molekulare Bildgebung zu entwickeln. Diese neuen zellpenetrierenden Phosphopeptide stehen für die Untersuchung intrazellulärer Prozesse, die auf Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsprozessen basieren, zur Verfügung.
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