Im Kontext komplexer zellulärer Prozesse stellen Phosphopeptide essentielle bioaktive Verbindungen dar, die mit Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen eng verbunden sind. Diese Prozesse sind in die Regulation nahezu jeder zellulären Funktion involviert und spielen damit ebenso im Falle von Erkrankungen eine tragende Rolle. Synthetische Phosphopeptide könnten in Form molekularer Sonden zur Charakterisierung dieser physiologisch fundamentalen Prozesse beitragen. Die radiopharmazeutische Forschung brachte in den letzten zwei Jahrzehnten zahlreiche radiomarkierte Peptide für das Peptidrezeportargeting im Rahmen der Tumordiagnose und -therapie hervor. Unter diesen regulatorischen Peptiden mit vorwiegend neuroendokrinem Ursprung sind bisher keine radiomarkierten Phosphopeptide für die Anwendung in der molekularen Bildgebung bekannt. Das Anliegen dieser Arbeit ist es, grundlegende Erkenntnisse zur Synthese und Markierung von Phosphopeptiden zu erlangen. Neben der Etablierung der Radiomarkierung von Phosphopeptiden mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 und deren radiopharmakologischen Charakterisierung steht auch die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluorophor 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) im Fokus. Phosphopeptidliganden der kürzlich identifizierten Polo-Box-Domäne (PBD) als Phosphopeptid-bindende Proteindomäne der Zellzykluskinase Plk1, die ebenso ein interessantes onkologisches Target darstellt, wurden für diese Arbeit als Model ausgewählt. Es stand ein Repertoire verschiedenster Methoden zur Verfügung, welche molekulare Bildgebung mittels Kleintier-PET, wie auch optische Bildgebung und die Radiomarkierung mittels klassischer und Mikrofluidik-Technik beinhalten. Im ersten Abschnitt der Promotion wurden kürzlich vorgestellte Plk1-PBD-gerichtete Phosphopeptide mit einer Ser-pThr-Kernsequenz ausgewählt und deren Darstellung mit der Fmoc-gestützten orthogonalen Festphasenpeptidsynthese (SPPS) vollzogen. Dabei erfolgt die Umsetzung nach dem Prinzip des Synthon-basierten Ansatzes, der den Einsatz des monobenzylierten Phosphothreonin-Bausteines involviert. Das Uronium-basierte Kupplungs- und Aktivierungsreagenz HBTU/HOBt/DIPEA, sowie das Abspaltreagenz TFA/Wasser/Thioanisol/EDT als eine modifizierte Variante des Reagenz K garantiert die zuverlässige Synthese von Phosphopeptiden unter Erhalt der Phosphatfunktion. Zur Charakterisierung der Peptide wurden HPLC und Massenspektrometrie als geeignete Methoden herangezogen. An die erfolgreiche Darstellung von Phosphopeptiden schloss sich im Weiteren die Ausarbeitung einer zuverlässigen Radiomarkierungsstrategie mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 an. Das bifunktionelle, aminogruppenselektive Agenz N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat ([18F]SFB) ist für eine indirekte und milde Markierung von Peptiden geeignet. Durch Optimierung der N-terminalen 18F-Fluorbenzoylierung des Phosphopeptides MQSpTPL 2 hinsichtlich der Verwendung eines 0,05 M Na2HPO4-Puffers (pH 9) als Reaktionsmedium bei geringer Peptidmenge (0,5 mg), sowie 40°C Reaktionstemperatur und 30 min Reaktionszeit kann das 18F-markierte Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 in guten radiochemischen Ausbeuten von 25-28%, mit entsprechender radiochemischer Reinheit >95% mittels HPLC-Reinigung und guter spezifischer Aktivität (20-40 GBq/µmol) hergestellt werden. Der Einsatz von Peptiden ist für die molekulare Bildgebung besonders attraktiv, jedoch oftmals durch ihre Instabilität in vivo, ausgelöst durch ubiquitär vorhandene endogene Peptidasen, limitiert. Beispielsweise besitzt ein N-terminal 18F-fluorbenzoyliertes Neurotensin(8-13) eine biologische Halbwertszeit von weniger als 5 min in vivo. Mit dem neuartigen 18F-markierten Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 wurde ein Peptid geschaffen, das in vitro und besonders in vivo außerordentlich hohe Stabilität von > 50% nach 60 min aufweist und damit wegweisende Eigenschaften für die Entwicklung neuer stabiler Radiopeptide für die molekulare Bildgebung aufzeigt. Da Phosphopeptiden aufgrund ihrer negativgeladenen Phosphatfunktionalität ein intrazellulärer Zugang verwehrt bleibt, wie auch in dieser Arbeit an den Tumorzelllinien HT-29 und FaDu nachgewiesen wurde, steht die Realisierung einer verbesserten intrazellulären Internalisierung von Phosphopeptiden im Blickfeld des zweiten Teils der Promotion. Der Versuch einer gezielten Zellaufnahme über rezeptorinternalisierende Peptide wurde mit dem Neuropeptidhormon Neurotensin(8-13) (NT(8-13)), welches über einen G-Protein-gekoppelten Mechanismus in die Zelle gelangt, beschritten. Jedoch zeigte ein Triazol-verbrücktes Konjugat 8 aus NT(8-13) als molekularer Transporter und dem Phosphopeptid MQSpTPL 2, welches auf Basis der Azid-Alkin-Click-Chemie synthetisiert wurde, anhand seiner niedrigen Bindungsaffinität (IC50 = 8,33 µM) kein Potential zu einer erfolgreichen Zellinternalisierung des Phosphopeptides. Vermittler eines rezeptorunabhängigen molekularen Zelltransportes stellen zellpenetrierende Peptide (CPP) dar. Versuche mit den derzeit kürzesten CPPs, den zellpenetrierenden Pentapeptiden (CPP5) oder auch Bax-Inhibitoren genannt, waren nicht erfolgreich. Zwei weitere, in dieser Arbeit verwendete, potente CPPs sind sC18, abgeleitet aus dem antimikrobiellen Peptid Cathelicidin, sowie hCT(18-32)-k7, einem verzweigten Calcitonin-Derivat. Mit den Phosphopeptid-CPP-konjugierten Verbindungen MQSpTPL-sC18 2-CPP1 und MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 2-CPP2 wurden nicht-toxische Konstrukte geschaffen, die eine definierte Aufnahme in HeLa, MCF-7 und HT-29 Zellen aufweisen, wie nach Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxfluorescein (CF) mittels optischer Bildgebung nachgewiesen werden konnte. Die Integration und Anwendung der Mikrofluidik-Technik im Rahmen der Darstellung der N-terminal 18F-fluorbenzoylierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate [18F]FBz-MQSpTPL-sC18 [18F]2-CPP3 und [18F]FBz-MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 [18F]2-CPP4 weist im Vergleich zur konventionellen Radiomarkierung entscheidende Vorteile auf. In Anwesenheit der für die [18F]SFB-Markierung reaktiven ε-NH2-Gruppen in den CPP-Fragmenten zeichnet sich im Rahmen der mikrofluiden Markierung entscheidende Selektivität für den N-Terminus der Peptide ab. Die radiochemischen Markierungsausbeuten betragen 21% für [18F]2-CPP3 und 26% für [18F]2-CPP4, im Vergleich zu 2-4% für [18F]2-CPP3 und [18F]2-CPP4 bei klassischer Markierung. In Zellaufnahmestudien wurde ebenfalls eine Internalisierung der 18F-markierten Konjugate in FaDu, HT-29 und MCF-7 Zellen bestätigt, die in allen drei Zelllinien vergleichbar ist und um 40% ID/mg Protein liegt. Wie auch das 18F-markierte Hexaphosphopeptid selbst in Wistar-Unilever-Ratten, zeigten die 18F-markierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate in Kleintier-PET-Untersuchungen in Balb/C-Mäusen (Normaltiere) die für ein radiomarkiertes Peptid typische Bioverteilung. Hierbei ist eine renale Exkretion eingeschlossen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, erstmals 18F-markierte Phosphopeptide mit zellpenetrierenden Eigenschaften für die molekulare Bildgebung zu entwickeln. Diese neuen zellpenetrierenden Phosphopeptide stehen für die Untersuchung intrazellulärer Prozesse, die auf Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsprozessen basieren, zur Verfügung.

Im Kontext komplexer zellulärer Prozesse stellen Phosphopeptide essentielle bioaktive Verbindungen dar, die mit Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsreaktionen eng verbunden sind. Diese Prozesse sind in die Regulation nahezu jeder zellulären Funktion involviert und spielen damit ebenso im Falle von Erkrankungen eine tragende Rolle. Synthetische Phosphopeptide könnten in Form molekularer Sonden zur Charakterisierung dieser physiologisch fundamentalen Prozesse beitragen. Die radiopharmazeutische Forschung brachte in den letzten zwei Jahrzehnten zahlreiche radiomarkierte Peptide für das Peptidrezeportargeting im Rahmen der Tumordiagnose und -therapie hervor. Unter diesen regulatorischen Peptiden mit vorwiegend neuroendokrinem Ursprung sind bisher keine radiomarkierten Phosphopeptide für die Anwendung in der molekularen Bildgebung bekannt. Das Anliegen dieser Arbeit ist es, grundlegende Erkenntnisse zur Synthese und Markierung von Phosphopeptiden zu erlangen. Neben der Etablierung der Radiomarkierung von Phosphopeptiden mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 und deren radiopharmakologischen Charakterisierung steht auch die Fluoreszenzmarkierung mit dem Fluorophor 5(6)-Carboxyfluorescein (CF) im Fokus. Phosphopeptidliganden der kürzlich identifizierten Polo-Box-Domäne (PBD) als Phosphopeptid-bindende Proteindomäne der Zellzykluskinase Plk1, die ebenso ein interessantes onkologisches Target darstellt, wurden für diese Arbeit als Model ausgewählt. Es stand ein Repertoire verschiedenster Methoden zur Verfügung, welche molekulare Bildgebung mittels Kleintier-PET, wie auch optische Bildgebung und die Radiomarkierung mittels klassischer und Mikrofluidik-Technik beinhalten. Im ersten Abschnitt der Promotion wurden kürzlich vorgestellte Plk1-PBD-gerichtete Phosphopeptide mit einer Ser-pThr-Kernsequenz ausgewählt und deren Darstellung mit der Fmoc-gestützten orthogonalen Festphasenpeptidsynthese (SPPS) vollzogen. Dabei erfolgt die Umsetzung nach dem Prinzip des Synthon-basierten Ansatzes, der den Einsatz des monobenzylierten Phosphothreonin-Bausteines involviert. Das Uronium-basierte Kupplungs- und Aktivierungsreagenz HBTU/HOBt/DIPEA, sowie das Abspaltreagenz TFA/Wasser/Thioanisol/EDT als eine modifizierte Variante des Reagenz K garantiert die zuverlässige Synthese von Phosphopeptiden unter Erhalt der Phosphatfunktion. Zur Charakterisierung der Peptide wurden HPLC und Massenspektrometrie als geeignete Methoden herangezogen. An die erfolgreiche Darstellung von Phosphopeptiden schloss sich im Weiteren die Ausarbeitung einer zuverlässigen Radiomarkierungsstrategie mit dem kurzlebigen Positronenstrahler Fluor-18 an. Das bifunktionelle, aminogruppenselektive Agenz N-Succinimidyl-4-[18F]fluorbenzoat ([18F]SFB) ist für eine indirekte und milde Markierung von Peptiden geeignet. Durch Optimierung der N-terminalen 18F-Fluorbenzoylierung des Phosphopeptides MQSpTPL 2 hinsichtlich der Verwendung eines 0,05 M Na2HPO4-Puffers (pH 9) als Reaktionsmedium bei geringer Peptidmenge (0,5 mg), sowie 40°C Reaktionstemperatur und 30 min Reaktionszeit kann das 18F-markierte Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 in guten radiochemischen Ausbeuten von 25-28%, mit entsprechender radiochemischer Reinheit >95% mittels HPLC-Reinigung und guter spezifischer Aktivität (20-40 GBq/µmol) hergestellt werden. Der Einsatz von Peptiden ist für die molekulare Bildgebung besonders attraktiv, jedoch oftmals durch ihre Instabilität in vivo, ausgelöst durch ubiquitär vorhandene endogene Peptidasen, limitiert. Beispielsweise besitzt ein N-terminal 18F-fluorbenzoyliertes Neurotensin(8-13) eine biologische Halbwertszeit von weniger als 5 min in vivo. Mit dem neuartigen 18F-markierten Phosphopeptid [18F]FBz-MQSpTPL [18F]4 wurde ein Peptid geschaffen, das in vitro und besonders in vivo außerordentlich hohe Stabilität von > 50% nach 60 min aufweist und damit wegweisende Eigenschaften für die Entwicklung neuer stabiler Radiopeptide für die molekulare Bildgebung aufzeigt. Da Phosphopeptiden aufgrund ihrer negativgeladenen Phosphatfunktionalität ein intrazellulärer Zugang verwehrt bleibt, wie auch in dieser Arbeit an den Tumorzelllinien HT-29 und FaDu nachgewiesen wurde, steht die Realisierung einer verbesserten intrazellulären Internalisierung von Phosphopeptiden im Blickfeld des zweiten Teils der Promotion. Der Versuch einer gezielten Zellaufnahme über rezeptorinternalisierende Peptide wurde mit dem Neuropeptidhormon Neurotensin(8-13) (NT(8-13)), welches über einen G-Protein-gekoppelten Mechanismus in die Zelle gelangt, beschritten. Jedoch zeigte ein Triazol-verbrücktes Konjugat 8 aus NT(8-13) als molekularer Transporter und dem Phosphopeptid MQSpTPL 2, welches auf Basis der Azid-Alkin-Click-Chemie synthetisiert wurde, anhand seiner niedrigen Bindungsaffinität (IC50 = 8,33 µM) kein Potential zu einer erfolgreichen Zellinternalisierung des Phosphopeptides. Vermittler eines rezeptorunabhängigen molekularen Zelltransportes stellen zellpenetrierende Peptide (CPP) dar. Versuche mit den derzeit kürzesten CPPs, den zellpenetrierenden Pentapeptiden (CPP5) oder auch Bax-Inhibitoren genannt, waren nicht erfolgreich. Zwei weitere, in dieser Arbeit verwendete, potente CPPs sind sC18, abgeleitet aus dem antimikrobiellen Peptid Cathelicidin, sowie hCT(18-32)-k7, einem verzweigten Calcitonin-Derivat. Mit den Phosphopeptid-CPP-konjugierten Verbindungen MQSpTPL-sC18 2-CPP1 und MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 2-CPP2 wurden nicht-toxische Konstrukte geschaffen, die eine definierte Aufnahme in HeLa, MCF-7 und HT-29 Zellen aufweisen, wie nach Markierung mit dem Fluoreszenzfarbstoff 5(6)-Carboxfluorescein (CF) mittels optischer Bildgebung nachgewiesen werden konnte. Die Integration und Anwendung der Mikrofluidik-Technik im Rahmen der Darstellung der N-terminal 18F-fluorbenzoylierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate [18F]FBz-MQSpTPL-sC18 [18F]2-CPP3 und [18F]FBz-MQSpTPL-hCT(18-32)-k7 [18F]2-CPP4 weist im Vergleich zur konventionellen Radiomarkierung entscheidende Vorteile auf. In Anwesenheit der für die [18F]SFB-Markierung reaktiven ε-NH2-Gruppen in den CPP-Fragmenten zeichnet sich im Rahmen der mikrofluiden Markierung entscheidende Selektivität für den N-Terminus der Peptide ab. Die radiochemischen Markierungsausbeuten betragen 21% für [18F]2-CPP3 und 26% für [18F]2-CPP4, im Vergleich zu 2-4% für [18F]2-CPP3 und [18F]2-CPP4 bei klassischer Markierung. In Zellaufnahmestudien wurde ebenfalls eine Internalisierung der 18F-markierten Konjugate in FaDu, HT-29 und MCF-7 Zellen bestätigt, die in allen drei Zelllinien vergleichbar ist und um 40% ID/mg Protein liegt. Wie auch das 18F-markierte Hexaphosphopeptid selbst in Wistar-Unilever-Ratten, zeigten die 18F-markierten Phosphopeptid-CPP-Konjugate in Kleintier-PET-Untersuchungen in Balb/C-Mäusen (Normaltiere) die für ein radiomarkiertes Peptid typische Bioverteilung. Hierbei ist eine renale Exkretion eingeschlossen. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, erstmals 18F-markierte Phosphopeptide mit zellpenetrierenden Eigenschaften für die molekulare Bildgebung zu entwickeln. Diese neuen zellpenetrierenden Phosphopeptide stehen für die Untersuchung intrazellulärer Prozesse, die auf Phosphorylierungs-/Dephosphorylierungsprozessen basieren, zur Verfügung.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die Staudinger-Phosphonit-Reaktion auf Azidohomoalanin-haltiges Ubiquitin angewendet, um ortsspezifisch modifizierte Alkinphosphonamidat-Ubiquitine zu erzeugen. Diese Ubiquitin-basierten Sonden wurden bei neutralem pH-Wert in selektiven Konjugationen mit DUBs, die ein Cystein im aktiven Zentrum beinhalten, eingesetzt, auch in Anwesenheit anderer Thiole. Dabei beobachteten wir DUB-Spezifitäten in Abhängigkeit von der Phosphonamidat-Position innerhalb der Sonde. Die DUB-Selektivität konnte auch an Pull-Down-Experimenten aus Zelllysaten gezeigt werden. Zusätzlich konnte die Cystein-Selektivität der Sonde an ausgewählten konjugierten DUBs mittels MS/MS-Analyse nachgewiesen werden. Wir beobachteten auch unterschiedliche Ausmaße der DUB-Inhibition bei der Inkubation mit den verschiedenen Phosphonamidat-Sonden. Im Hinblick auf das DUB-Targeting in lebenden Zellen untersuchten wir auch Bedingungen für zellpenetrierende Peptid-konjugierte Ubiquitine für einen Transport der Sonde in das Zytosol der Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit haben wir die neuartige, chemisch induzierte Phosphonothiolat Elektrophile für Thiol-Konjugation angewendet, um unhydrolysierbare ubiquitinierte Substrate herzustellen. Es gelang uns, ein hoch elektrophiles Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat mit guter Ausbeute zu erzeugen. Wir konnten die frisch hergestellte Sonde in Konjugationen mit Cysteinen an ausgewählten Proteinen einsetzen. Um unser Konzept zu etablieren, generierten wir ein monoubiquitiniertes α-Synuclein und demonstrierten dessen strukturelle Integrität in einer enzymatischen Ubiquitinierung des Konjugats. Außerdem stellten wir ein künstlich K48-verknüpftes Diubiquitin her, das von spezifischen Antikörpern ähnlich erkannt wurde wie das native K48-verknüpfte Diubiquitin, aber in Gegenwart von DUBs sich als stabil erwies. Das Ubiquitin-Vinylphosphonothiolat zeigte ebenfalls eine selektive DUB-Konjugation, wenn nur kurze Inkubationszeiten verwendet wurden. / In the first part of this thesis a Staudinger-phosphonite reaction was applied on azidohomoalanine-containing ubiquitin to generate site-specifically modified alkynephosphonamidate ubiquitins. These ubiquitin-based probes were utilized in selective conjugations of active site cysteine-containing DUBs at neutral pH, even in the presence of other thiols. Furthermore, we observed DUB specificities depending on the phosphonamidate position within the probe. The selectivity could also be demonstrated in pull-down experiments from cell lysates. Moreover, the probe’s cysteine selectivity within chosen conjugated DUBs could be determined using MS/MS analysis. Consequently, we observed varying extents of DUB inhibition upon incubation with the different phosphonamidate probes. For DUB targeting in living cells we also investigated conditions of cell penetrating peptide conjugated ubiquitin in order to successfully deliver them to the cytosol. In the second part of this thesis, we applied the novel chemically induced phosphonothiolate electrophiles for thiol conjugation to produce unhydrolyzable ubiquitinated substrates. Starting from a disulfide-activated cysteine ubiquitin mutant, we managed to generate a highly electrophilic ubiquitin vinylphosphonothiolate in satisfactory yield. We could apply the freshly prepared probe in conjugations with cysteines on selected proteins, in which the conjugation product showed to be remarkably stable. To establish our concept, we prepared monoubiquitinated α-synuclein and demonstrated its structural integrity in the performance of an enzymatical ubiquitination of the conjugate. Furthermore, we produced an artificially K48-linked diubiquitin, which was similarly recognized by specific antibodies as the native K48-linked diubiquitin and was not hydrolyzed in the presence of DUBs. The ubiquitin vinylphosphonothiolate displayed also selective DUB conjugation, when only short incubations were used.