La membrane plasmique des cellules épithéliales polarisées comporte deux domaines distincts, le domaine apical et le domaine basolatéral. Chaque domaine a une composition en lipides et en protéines déterminée, leur permettant d'assurer des fonctions spécifiques. Les mécanismes moléculaires responsables du tri et de l'adressage des protéines transmembranaires vers le pôle apical sont encore mal connus. La membrane apicale est enrichie en glycosphingolipides et en cholestérol qui forment des microdomaines appelés « rafts ». Expérimentalement, les rafts peuvent être isolés sous forme de DRM (detergent-resistant membranes) définis par leur résistance à un détergent non ionique, le Triton X-100. Il a été proposé que les rafts recrutent les protéines apicales au niveau du réseau trans-golgien et servent de plateforme pour leur adressage au pôle apical. Effectivement les protéines ancrées par le glycosylphosphatidyl-inositol sont résistantes au Triton et sont localisées en général à la membrane apicale. En revanche, la plupart des protéines transmembranaires apicales sont solubles dans le Triton, bien qu'elles soient résistantes à l'action de détergents plus doux comme le Lubrol WX. L'objectif des travaux de thèse a été d'étudier le rôle des rafts dans l'adressage apical de protéines transmembranaires et de comprendre l'effet différentiel du Triton et du Lubrol sur leur solubilisation. Les nucléotides pyrophosphatases NPP1 (basolatérale) et NPP3 (apicale) exprimées de façon stable dans les cellules MDCK ont servi de modèles. NPP3 est insoluble dans le Lubrol et partiellement insoluble dans le Triton, tandis que NPP1 est essentiellement solubilisée. L'étude de la localisation et de la sensibilité aux détergents de mutants et de chimères combinant des domaines cytoplasmiques, transmembranaires et extracellulaires de NPP3 et NPP1, a montré qu'il n'existait pas de corrélation stricte entre l'adressage apical et la résistance aux détergents. La résistance de NPP3 à la solubilisation par le Lubrol est acquise précocement au cours de sa biosynthèse, indépendamment de sa destination finale. Cette résistance dépend d'acides aminés chargés positivement situés dans la queue cytoplasmique, proches de la membrane. Afin de comprendre la sélectivité du Triton et du Lubrol dans l'extraction des protéines et des lipides membranaires, la composition lipidique des DRM obtenus après extraction par le Triton et le Lubrol a été comparée. Les DRM extraits par le Triton et le Lubrol sont enrichis en cholestérol ce qui correspond à la définition des rafts. Cependant, les DRM Triton sont appauvris en lipides du feuillet interne tandis que les DRM Lubrol sont enrichis en phosphatidyléthanolamine. Les DRM Lubrol sont également enrichis en protéines associées au feuillet interne de la membrane. En conclusion, ces travaux montrent que la résistance de la protéine apicale NPP3 à l'extraction par le Lubrol, et en partie par le Triton, est une propriété intrinsèque qui correspond probablement à une adaptation de la protéine à la composition lipidique du domaine apical, mais que cette propriété ne détermine pas son adressage polarisé. De plus, ces travaux montrent que les détergents sont des outils très intéressants pour étudier les interactions entre les protéines et les lipides membranaires, mais qu'il n'existe probablement pas de détergent capable d'isoler de façon stricte des microdomaines membranaires tels que sont définis les rafts. Nos résultats suggèrent que le feuillet interne des rafts est enrichi en phosphatidyléthanolamine et en cholestérol, qu'il est en partie solubilisé par le Triton, ce qui déstabiliserait les protéines transmembranaires et entraînerait leur extraction. Mots clés: détergent, raft, , ciblage apical, cholestérol, microdomaine membranaire, feuillet interne de la membrane, phosphatidyléthanolamine.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les liposomes ayant des lipides cationiques (liposomes cationiques) sont évalués dans plusieurs domaines thérapeutiques pour la libération intracellulaire des oligonucléotides antisenses et des plasmides ayant différents gènes humains. La majorité de ces liposomes sont composés de dioléoylphosphatidyléthanolamine (DOPE) pour assurer la déstabilisation de l'endosome suite à l'endocytose, et d'un lipide cationique pour assurer l'interaction avec les molécules d'ADN négativement chargés. Bien que les liposomes cationiques ont été administrés via les voies orale, pulmonaire et systémique, leur problème de stabilité dans différents milieux biologiques n'était pas complètement résolu. Il était déjà démontré que les liposomes cationiques ayant des ADN plamidiques sont déstabilisés par les protéines anioniques se trouvant dans le plasma. Les liposomes ayant une couche de poly(éthylène glycol) (PEG) à la surface ont largement contribué au développement des liposomes à longue circulation à cause de l'interaction réduite avec les protéines plasmatiques et les membranes cellulaires. Les liposome-PEG sont normalement préparés en faisant dissoudre le lipide-PEG avec les autres lipides et les phospholipides dans la phase organique avant l'hydratation et l'association des lipides en liposomes. Cette méthode conventionnelle d'incorporation de PEG possède plusieurs inconvénients. D'une part, les chaînes polymériques sont incorporées dans l'espace interne aqueux et entre les bicouches lipidiques où l'eau est normalement enfermée. Ceci réduit significativement le volume aqueux interne et nuit à l'incorporation des médicaments dans les liposomes. D'autre part, les molécules d'ADN sont reconnues pour se lier aux lipides cationiques dans les liposomes par des forces électrostatiques en formant des complexes ADN/liposome assez stables. Dans cette étude, nous présentons deux méthodes de modification des liposomes pré-formés, l'une est une réaction chimique ayant lieu dans le milieu aqueux et l'autre est une insertion des dérivés pégylés connus pour être non-toxiques et économiques. Ces nouvelles procédures de postmodification liposonnique s'effectuent dans des conditions douces et dans des temps très courts. L'efficacité de ces nouvelles méthodes a été prouvée par les mesures du changement de diamètre et de la charge apparente à la surface des liposomes. Les liposomes classiques DOPE/DOTAP (1:1) ont un potentiel zéta (Ç) moyen de +33 mV et l'incorporation par la méthode conventionnelle de 1 et 0.5 mol% de PE-PEG2000 (Phosphatidyléthanolamine-PEG2000) et PE-PEG5000réduit complètement la charge des liposomes. Une concentration cinquante fois plus grande de M-SC-PEG (N-hydroxysuccinimidyl carbonate méthoxy-PEG) et BTC-PEG (Benzotriazolyl carbonate PEG) était nécessaire pour réduire la charge des liposomes pré-formés d'une façon significative. La méthode d'insertion membranaire du PEG1760-nnonostéarate s'avère beaucoup plus avantageuse vu le temps très minime qu'elle requiert (1 minute) d'une part, et l'efficacité d'insertion proche de 95% d'autre part, une efficacité jamais préalablement atteinte.

La couche de nacre de la coquille de l'huître perlière Pinctada radiata des côtes tunisiennes est considérée comme un biomatériau ostéogénique prometteur. L’objectif de ce travail intitulé « Ostéogénie, intégration et qualité de la nacre d’un bivalve des côtes tunisiennes : Pinctada radiata (Leach, 1814) » consiste dans un premier temps à valoriser l’espèce P. radiata par sa qualité nutritionnelle par un suivi saisonnier de la composition de sa chair en lipides totaux et en phospholipides particulièrement les PC, PE, PS et PI. Les analyses effectuées ont montré que les lipides de P.radiata sont caractérisés par une richesse en acides gras polyinsaturés (AGPI) de la série n-3 qui dépasse 3 fois celle des AGPI de la série n-6. Ces AGPI de la série n-3 en particulier l’EPA (C20:5n-3) et le DHA (C22:6n-3), sont connus comme étant les AG les plus importants dans l’alimentation humaine puisqu’ils préviennent des maladies cardiovasculaires et des pathologies ostéo-articulaires. Par ailleurs, P. radiata de la région de Maharès présente la meilleure qualité de nacre en Tunisie. Les analyses biochimiques ont montré que cette région, constitue la meilleure localisation de cette espèce qui est loin des zones portuaires et des différentes origines de stress (pêche, exploitation, zone touristique etc…). En plus de cet aspect, la zone de Maharès renferme des pintadines présentant une bonne qualité en termes d’épaisseur de nacre. Nos résultats montrent que la composition, saisonnière, en acide gras des phospholipides et en particulier des glycérophospholipides (PE, PI, PS et PC) de la nacre est riche en acides gras saturés C14 :0, C16 :0 et C18 :0 particulièrement en hiver et dans un moindre degré au printemps. La nacre, substance ostéogénique, a été également caractérisée par un taux élevé de plusieurs AGPI de la série n-3 et n-6, particulièrement (18:3n-3, 18:4n-3, 20:5n-3, 22:5n-3, 22:6n-3 et le 20:4n-6). Pour démontrer les potentialités ostéogéniques des extraits de la nacre, nous avons utilisé un modèle "in vitro" utilisant 4 extraits lipidiques : l’extrait lipidique de la nacre de P.radiata (Ln), l’extrait lipidique de la chair de P.radiata (Lc), l’ESM (Ethanol soluble Matrix) de la nacre de P.radiata (Br) et l’ESM de la nacre de P.margaritifera (Bm). Nous avons comparé, in vitro, le pouvoir ostéogénique des extraits ESM des deux espèces P. radiata et P. margaritifera sur deux types de cellules les préchondrocytes ATDC5 et les préostéoblastes murins MC3T3. Les différents extraits (Ln, Lc, Br et Bm) induisent l’engagement des cellules MC3T3 vers le lignage ostéoblastique par l’activation des promoteurs des gènes spécifiques du tissu osseux, tels que: le collagène de type 1, l’ostéocalcine (OC), l’ostéopontine(OP) et le Runx2. Ces extraits induisent aussi l’engagement des cellules ATDC5 vers la différenciation endochondrale par l’activation des promoteurs des gènes spécifiques du tissu osseux, tels que: le collagène de type 1 alpha-1 (Col1a1), l’Aggrécane et le collagène de type X alpha-1 (ColXA1). De plus, nous remarquons que la fraction organique ou ESMr(Br) en comparaison avec celle de P.margaritifera (Bm) présente également les propriétés stimulantes de la nacre et la stimulation est même beaucoup plus importante. Ces résultats mettent en évidence, dans les modèles expérimentaux mis en oeuvre, l’intérêt des lipides. Ces derniers semblent jouer un rôle important dans cette stimulation. De plus, nous pouvons penser à la possibilité de l’association des molécules de nacre ou de biominéralisation avec les acides gras de la nacre et de la chair dans les défauts osseux à travers les sites actifs de l’os ou du cartilage humain présentant les différentes pathologies ostéarticulaires / The nacre layer of the shell of the pearl oyster Pinctada radiata of tunisian coast is considered a promising osteogenic biomaterial. The objective of this work entitled "Osteogenie, integration and quality of nacre of a tunisian coast bivalve: Pinctada radiata (Leach, 1814)" is a first step to enhance the species P.radiata its nutritional quality by seasonal monitoring of the composition of the flesh of total lipids and phospholipids in particular PC, PE, PS and PI. The analyzes showed that lipids of P.radiata are characterized by rich in polyunsaturated fatty acids (PUFAs) of the n-3 more than 3 times that of PUFAs n-6 series. These PUFAs of the n-3 series particularly EPA (C20: 5n-3) and DHA (C22: 6n-3) are known to be the most important AG in the food as prevent of the cardiovascular disease, and joint/ bone pathologies. Moreover, P. radiata of Mahares region has the best quality of nacre in Tunisia. Biochemical analyzes showed that this region is the best location of this species that is far from the port areas and different sources of stress (fishing, exploitation, tourist area etc ...). In addition to this aspect, the area contains pintadines having good quality in terms of thickness of nacre. Our results show that the seasonal composition of fatty acid of phospholipids in particular glycerophospholipids (PE, PI, PS and PC) nacre is rich in saturated fatty acids C14: 0, C16: 0 and C18: 0 especially in winter and spring in a lesser degree. Nacre, osteogenic substance, was also characterized by a high rate of PUFA of the n-3 and n-6 rate, especially (18: 3n-3, 18: 4n-3, 20: 5n-3, 22 5n-3, 22: 6n-3 and 20: 4n-6). To demonstrate the osteogenic potential of extracts of nacre, we have established an "in vitro" model using 4 lipid extracts: the lipid extract of nacre P.radiata (Ln); the lipid extract of the flesh of P.radiata (Lc), ESM (Ethanol soluble Matrix) of the mother-of P.radiata (Br) and ESM nacre of P. margaritifera (Bm). We compared “in vitro” osteogenic power ESM extracts of both species P. radiata and P. margaritifera on two types of cells the préchondrocytes ATDC5 and the murine preosteoblasts MC3T3. The different extracts (Ln, Lc, Br and Bm) induce engagement MC3T3 osteoblast lineage cells to the activation of the promoters of specific genes of bone tissue, such as collagen type 1, osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and Runx2. These extracts also induce the commitment of ATDC5 cells to endochondral differentiation by activating specific genes promoters of bone tissue, such as collagen type 1 alpha 1 (COL1A1), the aggrecan and collagen type alpha 1-X (ColXA1). Moreover, we note that the organic fraction or ESMR (Br) compared with that of P. margaritifera (Bm) also has stimulant properties of nacre and the stimulation is even more important. These results demonstrate, in experimental models used, the interest of lipids. They seem to play an important role in this stimulation. Moreover, we can think about the possibility of the association of molecules or nacre biomineralization with the fatty acids of the nacre and flesh in bone defects through the active sites of bone or cartilage presenting the human osteoarticular different pathologies