Les différentes protéines accessoires du VIH-1, l’agent étiologique du SIDA, optimisent la réplication et la propagation du virus in vivo. Parmi ces dernières figure Vpu, l’antagoniste du facteur de restriction nommé Tetherin qui prévient la relâche des particules virales à partir de la surface de cellules infectées. En diminuant son expression de surface, Vpu prévient l’incorporation de ce facteur de restriction dans la particule virale en formation et conséquemment, empêche la formation d’une ancre protéique reliant le virus mature à la membrane plasmique de la cellule infectée. La mécanistique sous-jacente n’était cependant pas connue. Cette présente thèse relate nos travaux exécutés afin d’élucider la dynamique des mécanismes cellulaires responsables de cet antagonisme. Une approche de mutagénèse dirigée a d’abord permis d’identifier deux régions contenant des déterminants de la localisation de Vpu dans le réseau trans-Golgi (RTG), puis de démontrer la relation existante entre cette distribution et l’augmentation de la relâche des particules virales. Des expériences subséquentes de marquage métabolique suivi d’une chasse exécutées dans des systèmes cellulaires où Tetherin est exprimée de façon endogène ont suggéré le caractère dispensable de l’induction par Vpu de la dégradation du facteur de restriction lors de son antagonisme. En revanche, une approche de réexpression de Tetherin conduite en cytométrie en flux, confirmée en microscopie confocale, a mis en évidence une séquestration de Tetherin dans le RTG en présence de Vpu, phénomène qui s’est avéré nécessiter l’interaction entre les deux protéines. L’usage d’un système d’expression de Vpu inductible conjugué à des techniques de cytométrie en flux nous a permis d’apprécier l’effet majeur de Vpu sur la Tetherin néo-synthétisée et plus mineur sur la Tetherin de surface. En présence de Vpu, la séquestration intracellulaire de la Tetherin néo-synthétisée et la légère accélération de l’internalisation naturelle de celle en surface se sont avérées suffisantes à la réduction de son expression globale à la membrane plasmique et ce, à temps pour l’initiation du processus de relâche virale. À la lumière de nos résultats, nous proposons un modèle où la séquestration de la Tetherin néo-synthétisée dans le RTG préviendrait le réapprovisionnement de Tetherin en surface qui, combinée avec l’internalisation naturelle de Tetherin à partir de la membrane plasmique, imposerait l’établissement d’un nouvel équilibre de Tetherin incompatible avec une restriction de la relâche des particules virales. Cette thèse nous a donc permis d’identifier un processus par lequel Vpu augmente la sécrétion de virus matures et établit une base mécanistique nécessaire à la compréhension de la contribution de Vpu à la propagation et à la pathogénèse du virus, ce qui pourrait mener à l’élaboration d’une stratégie visant à contrer l’effet de cette protéine virale. / All accessory proteins of HIV-1, the ethiologic agent of AIDS, are thought to optimize viral replication and propagation in vivo. Among them, Vpu antagonizes Tetherin, a cellular factor that inhibits viral particle release. Downregulation of cell-surface Tetherin by Vpu is believed to prevent incorporation of this restriction factor into nascent viral particles, which would impede the formation of a Tetherin-derived protein anchor that bridges the virus to the plasma membrane of the infected cell. This thesis presents our studies on cellular mechanisms governing Tetherin antagonism by Vpu. A directed mutagenesis approach first identified two regions encompassing determinants of the localization of Vpu in the trans-Golgi network, and it correlated this intracellular distribution with enhanced release viral particle. Pulse-chase experiments in cellular systems wherein Tetherin was endogenously expressed showed that Vpu-induced Tetherin degradation is dispensable for restriction. In contrast, both a flow cytometry-based Tetherin re-expression assay and confocal microscopy analyses demonstrated that Vpu-mediated sequestration of Tetherin in the trans-Golgi network, a phenomenon that appeared to be triggered by the transmembrane association of the two proteins, was necessary for release inhibition. Vpu inducible expression in flow cytometry-based experiments provided evidence for an optimal antagonism of Tetherin at 6h after Vpu expression, following the interruption of Tetherin re-supply and a to the modest acceleration of the natural clearance of surface-localized Tetherin. Our work supports a model in which Tetherin sequestration in the trans-Golgi network prevents its re-supply, which, combined with its clearance from the surface, imposes a new equilibrium at the plasma membrane that is incompatible with the restriction of viral particle release. Overall, this thesis sheds light on the processes by which Vpu enhances the secretion of mature viruses and it establishes a mechanistic basis that could serve as starting point for the development of strategies aimed at interfering with Tetherin functions.

Du fait de leur présence à la surface de la particule virale, les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 du virus HCV jouent un rôle essentiel dans sa morphogenèse ainsi que lors de son entrée dans la cellule hôte. Jusqu’à récemment, les travaux de recherche sur les glycoprotéines d’enveloppe du virus HCV se sont essentiellement focalisés sur E2 car elle est la protéine d’attachement du virus. De plus, elle est la cible majeure des anticorps neutralisants et il a été longtemps postulé qu’elle était la protéine de fusion du virus. Cependant, les récentes publications de la structure de E2 ne mettent pas en évidence la présence d’un peptide de fusion et sa structure ne correspond pas aux critères attendus pour une protéine de fusion, suggérant que la glycoprotéine E1 seule ou en association avec E2 pourrait être responsable de l’étape de fusion. La structure de la région N-terminale de E1 (acides aminés 192 à 270) a récemment été résolue et a mis en évidence la présence d’une épingle à cheveux formée par 2 feuillets beta (β1 et β2) suivie par un segment de 16 acides aminés qui forme une hélice alpha (α1) flanquant 3 feuillets beta antiparallèles (β3, β4 et β5). En plus de la caractérisation de ces structures secondaires de E1, une région qui se situe au milieu de la protéine (approximativement entre les résidus 274 et 292) a été proposée avoir un rôle actif au cours du processus de fusion et elle pourrait correspondre à un peptide de fusion.Nous nous sommes basés sur ces travaux récents pour investiguer le rôle fonctionnel de la glycoprotéine E1 par une approche de mutagenèse dirigée des résidus conservés dans la région N-terminale et dans la région du potentiel peptide de fusion, dans le contexte d’un clone infectieux du HCV. Comme attendu, nos résultats indiquent que ces mutations introduites dans E1 n’ont aucun effet sur la réplication virale. Cependant, vingt-et-un parmi les vingt-huit mutants produits conduisent à une atténuation ou une perte de l’infectiosité virale. D’une manière très intéressante, deux mutants atténués, le T213A et le I262A, se sont montrés moins dépendants au co-récepteur claudine-1. D’autre part, nous avons montré que ces mutants utilisent un autre récepteur de la famille des claudines (claudine-6) pour l’entrée virale, indiquant ainsi un changement de dépendance à son co-récepteur claudine-1. A l’opposé, deux autres mutants, le L286A et le E303A, se sont révélés avoir une plus grande dépendance au co-récepteur claudin-1 pour l’entrée dans les cellules d’hépatome. Au cours de ce travail, nous avons également identifié une mutation intéressante à proximité du potentiel peptide de fusion. Cette mutation, G311A, conduit à la sécrétion de particules virales entières mais non infectieuses, suggérant un défaut d’entrée cellulaire pour ce virus. De façon très surprenante, nous avons également identifié une mutation (D263A) qui conduit à la sécrétion de particules virales dépourvues d’ARN génomique. Une caractérisation plus poussée de ce mutant a de plus révélé une modification dans la co-localisation subcellulaire entre l'ARN viral et la glycoprotéine E1, mettant en évidence pour la première fois un dialogue croisé entre E1 et l'ARN génomique du HCV lors de la morphogenèse du virus.En conclusion, nos observations permettent d’identifier précisément les régions spécifiques de la protéine E1 qui jouent un rôle dans l’assemblage et l’entrée du virus dans la cellule, mettant en évidence le rôle majeur de la glycoprotéine E1 au niveau des différentes étapes du cycle infectieux du HCV. / Being part of the viral particle, HCV envelope glycoproteins E1 and E2 play an essential role in virion morphogenesis as well as in HCV entry into liver cells. These glycoproteins form a non-covalent heterodimer, and until recently, research on HCV envelope glycoproteins has been mainly focused on E2. Indeed, this glycoprotein is the receptor-binding protein, it is also the major target of neutralizing antibodies and it was postulated to be the fusion protein. However, the recent publications of the structure of E2 do not show the presence of a fusion peptide and its structure does not fit with what one would expect for a fusion protein, suggesting that E1 alone or in association with E2 might be responsible for the fusion step. Concerning E1, only the crystal structure of the two-fifth N-terminal region, comprising amino acids 192 to 270, has been reported. This partial structure reveals a complex network of covalently linked, intertwined homodimers. The overall fold of the N-terminal E1 monomer consists of a beta-hairpin (β1 and β2) followed by a segment composed of a 16 amino-acid long alpha-helix (α1) flanking a three-strand antiparallel beta-sheet (β3, β4 and β5). In addition to the characterization of secondary structures within E1, a region located in the middle of the polypeptide (approximately between aa 274 and 292) has been suggested to play an active role during the fusion process and might potentially act as a fusion peptide. We took advantage of these recently published data to further investigate the functional role of HCV glycoprotein E1 by using a site-directed mutagenesis approach targeting conserved amino acids in the N-terminal region as well as in the region postulated to contain the fusion peptide in the context of an infectious clone. As expected, our results indicate that these mutations have no effect on virus replication. However, twenty-one out of twenty-eight mutations led to attenuation or inactivation of infectivity. Interestingly, two attenuated mutants, T213A and I262A, were less dependent on tight junction protein claudin-1, a co-receptor for HCV. Instead, these mutant viruses relied on another claudin (claudin-6) for cellular entry, indicating a shift in receptor dependence. In contrast, two other mutants, L286 and E303, were more dependent on claudin-1 for cellular entry into hepatoma cells cells. We also identified an interesting mutation downstream of the putative fusion peptide, G311A, which leads to the release of non-infectious particles having a defect in cellular entry. Finally, an unexpected phenotype was also observed for D263A mutant, which was no longer infectious but led to the secretion of viral particles devoid of genomic RNA. Further characterization of the D263A mutant revealed a change in subcellular co-localization between HCV RNA and E1, highlighting for the first time a crosstalk between HCV glycoprotein E1 and the genomic RNA during HCV morphogenesis.In conclusion, our observations allowed for the identification of specific regions in the E1 glycoprotein that play a role in virion assembly and entry, highlighting the major role played by this protein at different steps of the HCV infectious cycle.

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Les tourbières couvrent 3 % des surfaces continentales et jouent un rôle important dans le cycle du carbone en stockant le tiers du carbone des sols. L'accumulation de tourbe est liée au déséquilibre production primaire/décomposition du à une activité microbienne limitée par les conditions environnementales. L'infection et la lyse virale ont un impact sur la diversité et l'activité des communautés microbiennes, et influent sur le cycle du carbone. Cependant, le fonctionnement de ce compartiment viral n'avait jamais été pris en compte dans les études de fonctionnement des tourbières. Le but de ce travail de thèse était d'analyser et comprendre la dynamique spatiale et temporelle de l'abondance et de la diversité virale des tourbières à Sphagnum. L'analyse de l'abondance virale et procaryote et de 12 metaviromes en lien avec la physico-chimie d'une tourbière tempérée en France montre une forte variation saisonnière des communautés virales. Cette variation semble très liée aux conditions environnementales générées par la fluctuation de la nappe d'eau. Dans cette même tourbière, l'analyse de la diversité taxonomique et fonctionnelle des communautés de microorganismes présents (métagénomes) et métaboliquement actifs (métatranscriptomes) indique que la structure taxonomique est différente entre les des deux principaux stades, le fen et le bog, mais que ces communautés présentent une diversité fonctionnelle similaire, dont l'expression est liée aux changements des conditions environnementales avec la profondeur. L'abondance des particules virales étudiées dans 5 tourbières à Sphagnum réparties en Finlande, au Canada, en France, et sur l'île subantarctique d'Amsterdam varie fortement avec les sites. L'analyse de la diversité virale de la matrice et de l'eau de tourbe du Canada et de Finlande montre que la diversité virale est structurée par le site, puis le stade dynamique, puis la profondeur, avec un rôle important de la saturation en eau au niveau du site. Ces résultats valident le fonctionnement proposé du compartiment viral et de la communauté d'hôtes procaryotes. Ces connaissances ont été utilisées pour analyser le fonctionnement du compartiment microbien de tourbières à Sphagnum soumises à des perturbations d'origine anthropique. Les 31 métaviromes produits pour cette thèse constituent l'une des plus grandes bases de données sur la diversité virale des écosystèmes alors que la diversité virale des sols n'avait presque jamais été étudiée auparavant. / Peatlands cover 3 % of the continental surfaces but represent up to a third of the soil carbon stock. Peat accumulation results from the imbalance between primary production and decomposition due to the limitation of the prokaryote activity caused by the environmental conditions. Viral infection and lysis impact the diversity and the activity of the microbial communities and influence the carbon cycle. However, the functioning of the viral compartment had never been taken into account in peatlands. The aim of this thesis was to gain knowledge about the spatio-temporal dynamic of viral abundance and diversity in Sphagnum-dominated peatlands. Spatio-temporal analysis of viral and prokaryote abundance and of 12 metaviromes (viral diversity) in relation to the physico-chemical features in a temperate Sphagnum-dominated peatland in France revealed the high seasonal variability of the viral communities. This dynamic appeared mainly related to the environmental conditions shaped by the fluctuation of the water-table level. In the same peatland the taxonomic diversity of the present microorganisms (metagenomes) differed between the fen and the bog, but these communities present a similar functional diversity, which expression in selected in the same way in the two dynamic stages, in relation to depth-related environmental conditions. Viral abundance analyzed in 5 Sphagnum-dominated peatlands from Finland, Canada, France and subantarctic Amsterdam Isle presented a high geographical variability. Investigation of the diversity of the viral communities from the peat matrix and the pore-water in Finland and Canada emphasized the structuration of the viral communities by the site, then the dynamic stage, and finally depth. These results confirm the first hypotheses about the functioning of the viral compartment depending on environmental conditions and prokaryote activity. Effects of human-derived disturbances on viral ecology in peatlands were investigated based on this knowledge. While soil viral diversity was poorly documented at the start of this thesis, the collection of 31 metaviromes from Sphagnum-dominated peatlands produced for this project represents the second largest dataset representing the viral diversity from environmental samples.