Thesis (M.S.)--University of Wisconsin--Madison, 1937. / Typescript. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Wisconsin--Madison, 1938. / Typescript. Includes abstract and vita. eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references (leaves 47-48).

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:07:24Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Introdução: A literatura registra grande variação nos índices de resistência a fluconazol observadas em amostras de Candida tropicalis, com índices de 0 a 35%. Esta variação faz supor que o fenômeno in vitro conhecido como "trailing", que é caracterizado pela inibição parcial de inóculo na presença de drogas fungistáticas, esteja sendo interpretado como resistência. Devido a essa discrepância de resultados, Arthington-Skaggs e cols.,(1999), sugeriram a técnica de quantificação de ergosterol para determinar valores de CIMs em cepas que apresentam "trailing". Objetivos: 1.Descrever o perfil de susceptibilidade de cepas de C. tropicalis isoladas de episódios de fungemia frente a fluconazol, 2.Avaliar a prevalência de cepas de C. tropicalis com o fenótipo "low-high MICs" observados em leitura após 24 e 48 horas de incubação e 3.Utilizar a quantificação de ergosterol como ferramenta para descriminar cepas verdadeiramente resistentes a fluconazol entre aquelas com "trailing". Material e Métodos: Foram incluídas 224 cepas de C. tropicalis provenientes de episódios de candidemia que foram encaminhados ao Laboratório Especial de Micologia, durante o período de 2000 a 2005. Após triagem de C. albicans, utilizando-se meio cromogênico CHROMagar- Candida, os isolados de Candida não-albicans foram identificados por análise do perfil bioquímico pelo método comercial ID32C e análise de microcultivo. O perfil de susceptibilidade das amostras frente à fluconazol foi realizado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com a normatização do documento do CLSI M27-A2 (2002). Os valores de CIMs foram obtidos nas leituras após 24 e 48 horas de incubação, utilizando critérios visuais e espectrofotométricos. A metodologia padrão utilizada para quantificar ergosterol de células fúngicas foi realizada de acordo com a técnica desenvolvida por Arthington-Skaggs e cols., 1999. Resultados: O perfil de susceptibilidade das 224 cepas de C. tropicalis frente à fluconazol foi analisado pelo método de microdiluição em caldo, de acordo com o documento CLSI M27-A2 (2002). Com relação às leituras realizadas após 24 horas de incubação, os valores de CIM50 foram de 0,5µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 1,0 µg/mL para a leitura visual. Já os valores de CIM90 foram de 4,0µg/mL para a leitura espectrofotométrica e 8,0 µg/mL para leitura visual. Com relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, os valores de CIM50 e CIM90 foram de 2,0µg/mL nas duas leituras e os valores de CIM90 foram de 8,0µg/mL também nos dois critérios de leitura. Houve uma concordância entre os resultados das leituras visual e espectrofotométrica de 96,87% e 98,21% após 24 e 48 horas de incubação, respectivamente. O fenômeno de trailing esteve presente em apenas 87 (38,83%) isolados após 24 horas de incubação, sendo que destas 9 (10,35%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Já em relação às leituras realizadas após 48 horas de incubação, 118 (52,67%) isolados apresentaram crescimento de trailing e 32 (27,11%) foram classificados como trailing moderado/intenso. Todas as 20 (8,92%) cepas que apresentaram valores CIMs ≥16µg/mL em qualquer leitura após 24 horas de incubação foram submetidas à quantificação de ergosterol de suas membranas, em ensaios com exposição a diferentes concentrações de fluconazol. Destes 20 isolados, 17 (85%) foram considerados sensíveis (CIMs ≤4µg/ml) e apenas 3 (15%) isolados foram considerados resistentes (CIMs ≥64µg/ml) pela técnica de quantificação de ergosterol. Conclusões: 1. As leituras visuais e espectrofotométricas de ensaios com fluconazol apresentam grande semelhança de resultados; 2. O fenômeno de trailing moderado/intenso é muito freqüente com cepas de C tropicalis, dificultando a interpretação dos resultados; 3. A grande maioria (85%) das 20 amostras inicialmente identificadas como resistentes nos ensaios de microdiluição apresentaram redução de ergosterol em suas membranas quando expostas a droga, mostrando tratar-se de trailing; 4. Tais dados sugerem que a ocorrência de cepas de C. tropicalis verdadeiramente resistentes a fluconazol seja bem menos freqüente que o sugerido na literatura. / Introduction: Recently, C. tropicalis resistance to fluconazole has been highlighted as a problem around the world. A large variation on resistance rates was mentioned in previous reports and it may be in part related to the phenomenon "trailing". The term ‘trailing’ has been used to describe the reduced but persistent growth that some isolates of Candida albicans and Candida tropicalis exhibit in susceptibility testing with azole antifungal agents, such as fluconazole. Arthington-Skaggs et al., (1999), suggested the technique of quantification of ergosterol content to determine values of MIC in strains with “trailing” growth. Objectives: The aims of this study were: 1. to evaluate the antifungal susceptibility profile of C. tropicalis bloodstream isolates to fluconazole, 2. to evaluate the prevalence of isolates with the low-high phenotype and 3. to use the quantification of ergosterol content as tool to identify strains truily resistant to fluconazol. Materials and Methods: We obtained a collection of 224 samples of bloodstream C. tropicalis strains isolated between 2000 to 2005. After initial screening for Candida albicans in chromogenic medium CHROMagar® Candida, the samples of non-albicans Candida species were identified based on their micromorphology and biochemical profile evaluated by the commercial system ID32C. The susceptibility testing of clinical isolates was performed by the CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) broth microdilution method. The methodology standard used to quantify the ergosterol content was performed in accordance with Arthington-Skaggs et al., 1999. Results: MIC50 values at 24 hours of incubation was 0,5µg/mL by spectrophotometric reading and 1,0 µg/mL by visual reading. MIC90 values at 24 hours of incubation was 4,0µg/mL by spectrophotometric reading and 8,0 µg/mL by visual reading. After 48 hours of incubation, the MIC50 and MIC90 were 2,0µg/mL and 8,0µg/mL for both readings. The rates of agreement between the visual and spectrophotometric readings were 96,87% and 98,21% after 24 and 48 hours of incubation, respectively. The 20 (8.92%) strains that at 24 hours of incubation exhibited MIC values ≥16µg/mL in any reading were submitted to the quantification of ergosterol content. Seventeen (85%) of these 20 isolates tested were considered susceptible to fluconazole (MICs ≤4µg/ml) and only 3 (15%) isolates were considered truly resistant (MICs ≥64µg/ml). Conclusions: 1. Visual and spectrophotometric readings of fluconazole susceptibility testing presents similarity of results; 2. The phenomenon of moderate/intense “trailing” is very frequent with strains of C. tropicalis, making it difficult to interpret the results; 3. The great majority (85%) of the 20 samples initially identified as resistant in the microdilution method showed reduction of ergosterol content when exposed to the drug, having shown to be susceptible; 4. This data suggest that the occurrence of Candida tropicalis truly resistant to fluconazole is less frequent than suggested in the literature. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

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Tesis para optar al grado de Doctora en Ciencias con mención en Microbiología / Xanthophyllomyces dendrorhous es una levadura basidiomicete que sintetiza carotenoides, siendo el principal de ellos astaxantina. Esta característica la hace de gran interés comercial y objeto de numerosos estudios; sin embargo, existen muchos aspectos desconocidos relacionados con los mecanismos de regulación transcripcional del proceso de carotenogénesis. Estudios recientes proponen la participación del ergosterol, principal esterol en levaduras, en la regulación de genes carotenogénicos y otros esenciales en la vía del mevalonato. En este aspecto, se ha demostrado en otros hongos que el mecanismo por el que el ergosterol regula la transcripción génica es mediante la vía SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein). El factor transcripcional Sre1 posee el dominio activador de la transcripción en el amino terminal (Sre1N) y su activación ocurre cuando bajan los niveles de esteroles y/u oxígeno en la célula regulando la transcripción de genes involucrados en la biosíntesis de esteroles y respuesta a hipoxia, entre otros. El objetivo general de este trabajo fue estudiar el mecanismo de regulación de la expresión génica mediada por la vía SREBP dependiente de los niveles de ergosterol y oxígeno en la biosíntesis de carotenoides y esteroles en X. dendrorhous, enfocándose en la función del regulador transcripcional Sre1. En primer lugar, se identificaron y caracterizaron bioinformaticamente posibles genes de la vía SREBP: SRE1, SCP1, STP1 y OFD1 de X. dendrorhous. Para estudiar la funcionalidad del gen SRE1, se construyó mutantes por deleción de este gen: CBS.sre1- y CBS.cyp61-/sre1- que provienen de las cepas parentales CBS 6938 y CBS.cyp61- (esta última no produce ergosterol), respectivamente. Además, se construyó la cepa mutante CBS.gSRE1N, que expresa sólo el dominio activador de la transcripción (Sre1N). Se evaluó el fenotipo de estas cepas en cuanto a la producción de esteroles y carotenoides, crecimiento en presencia de un inhibidor de la síntesis de esteroles (clotrimazol) y la expresión a nivel de transcritos de algunos genes. Como resultado, se observó que la deleción del gen disminuye la producción de ambos tipos de metabolitos y además, SRE1 es esencial para el crecimiento en clotrimazol. Adicionalemente, la cepa CBS.gSRE1N produce doble cantidad de carotenoides y esteroles, respecto a la cepa silvestre. Paralelamente, se realizó un ensayo de complementación heteróloga vía expresión del gen SRE1 de X. dendrorhous en una cepa mutante sre1- de Schizosaccharomyces pombe y se observó que existe una complementación parcial, dado que la cepa complementada presenta un mejor crecimiento en anaerobiosis y cloruro de cobalto, respecto al control sre1-. Por otra parte, se realizaron análisis transcriptómicos de las cepas mutantes en condiciones de normoxia, hipoxia y cloruro de cobalto, dado que este último compuesto se ha descrito como un agente que imita las condiciones de hipoxia. De estos análisis se desprende que Sre1 es necesario para la respuesta a hipoxia y que el cloruro de cobalto imitaría esta respuesta transcripcional en la levadura al menos en algunos genes de la biosíntesis de esteroles. Finalmente, de acuerdo a los resultados obtenidos en este estudio se concluyó que el gen SRE1 identificado en X. dendrorhous es funcional y participa en la regulación de la biosíntesis de esteroles y carotenoides. / Xanthophyllomyces dendrorhous is a basidiomycete yeast that synthesizes carotenoids, mainly astaxanthin, this characteristic is of great commercial interest and subject of numerous studies. However, there are many unknown aspects related to transcriptional regulation mechanisms of carotenogenesis. Recent studies propose that ergosterol, the main sterol in yeast, is involved in the regulation of carotenogenic genes expression and on other genes of the mevalonate pathway. In this aspect, in other fungi it has been demonstrated that the mechanism by which ergosterol regulates gene transcription is through the SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein) pathway. The transcriptional factor Sre1 contains a transcriptional activation domain at its amino terminal end (Sre1N) that is activated when cellular sterols and/or oxygen levels decrease and by this way, it regulates the transcription of genes involved in the biosynthesis of sterols and response to hypoxia, among others. The general goal of this work was to study if this mechanism, the SREBP pathway, regulates the biosynthesis of carotenoids and sterols in X. dendrorhous, focusing on the function of the transcriptional regulator Sre1. First, X. dendrorhous potential genes of the SREBP pathway, SRE1, SCP1, STP1 and OFD1, were identified and bioinformatically characterized. To study the functionality of the SRE1 gene, deletion mutants of this gene were constructed: CBS.sre1- and CBS.cyp61- / sre1- that derived from the parental strains CBS 6938 and CBS.cyp61- (which does not produce ergosterol), respectively. In addition, the mutant strain CBS.gSRE1N was generated, which expresses only the transcription activating domain (Sre1N). The phenotype of these strains was evaluated in relation to sterol and carotenoids production, growth in the presence of sterol synthesis inhibitor (clotrimazole) and transcript level of some genes. As a result, it was observed that the SRE1 gene deletion, decreases the production of both types of metabolites and also this gene is essential for growth in the presence of clotrimazole. In addition, the production of carotenoids and sterols in the CBS.gSRE1N strain was increased 2-fold compared to the wild-type strain. In parallel, a heterologous complementation assay was performed by expressing the X. dendrorhous SRE1 gene in a Schizosaccharomyces pombe sre1- mutant strain. Partial complementation was observed as the complemented strain displayed better growth in anaerobiosis and in the presence of cobalt chloride (an agent that imitates hypoxia conditions), regarding to the controls strains. On the other hand, transcriptomic analyses of the mutant strains were carried out in conditions of normoxia, hypoxia and cultures in the presence of cobalt chloride. In general, it was observed that Sre1 is necessary for the response to hypoxia conditions and that cobalt chloride would imitate these conditions in the transcriptional response in the yeast, at least in some genes of the sterol biosynthesis. In conclusion, the SRE1 gene identified in X. dendrorhous is functional and it is involved in the regulation of the biosynthesis of sterols and carotenoids in this yeast. / Beca Doctoral y Proyecto FONDECYT 1160202. / 20 de febrero 2020.

Thesis (Ph. D.)--University of Chicago, 1935. / Lithoprinted. "Private edition, distributed by the University of Chicago libraries, Chicago, Illinois." Includes bibliographical references.

Made available in DSpace on 2016-03-15T14:19:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 valter_neto_ioc_dout_2013.pdf: 5032159 bytes, checksum: 09d4b19d84fdc8d6bc1295312fe03ccd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os tripanossomatídeos não sintetizam o colesterol e sim esteróis com o esqueleto ergostano, porém um percentual significativo de colesterol exógeno é encontrado em todas as espécies de Leishmania, sugerindo um papel biológico para esta molécula. Esta tese tem como objetivo estudar a importância do uso de colesterol para Leishmania spp. em várias situações, avaliando o potencial deste sistema como um possível alvo farmacológico. A atividade dos inibidores de biossíntese de ergosterol associado com inibidores de transporte de colesterol derivado de LDL, foi avaliada em promastigotas e amastigotas intracelulares. A associação entre LBqT01 e cetoconazol, miconazol ou terbinafina mostrou sinergia. A associação entre a imipramina ou progesterona e cetoconazol ou terbinafina indicaram um efeito aditivo. O cetoconazol e miconazol demonstraram uma diminuição de até duas vezes o valor de IC50 nas formas amastigotas, quando combinado com os inibidores de transporte de colesterol. Foi observado também alteração da biossíntese de ergosterol após tratamento dos parasitos com os inibidores de transporte de colesterol, demonstrado por CG/MS. A combinação de LBqT01 e cetoconazol mostrou ser mais ativa in vivo do que cada fármaco individualmente. Estudamos também o mecanismo de resistência desses inibidores, avaliando a modulação de enzimas da via de biossíntese de esteróis e a utilização de colesterol exógeno pelos parasitos. Promastigotas de Leishmania amazonensis, Leishmania braziliensis e Leishmania guyanensis foram cultivadas com concentrações crescentes de sinvastatina, terbinafina e miconazol Estes inibidores mostraram um índice de resistência de 2,5 - 8 vezes. A resistência cruzada também foi avaliada, com estes inibidores e fármacos de referência (miltefosina, anfotericina B e antimônio trivalente). A expressão de genes da biossíntese de esterol e utilização do colesterol exógeno entre as cepas selvagens e resistentes, foram avaliadas por PCR em tempo real e CG/MS, respectivamente. As enzimas HMGCoA e C -14 desmetilase foram as mais moduladas, independente do fármaco utilizado, variando sua expressão nas cepas resistentes. Promastigotas de L. braziliensis resistentes à terbinafina apresentaram alteração no perfil de esteróis, L. amazonensis resistente aos três inibidores e L. guyanensis resistente ao miconazol mostraram alteração da biossíntese de esteróis e aumento na absorção do colesterol exógeno. Os resultados mostram que alguns genes foram amplificados na cepa resistente em relação à cepa selvagem. Juntos estes resultados sugerem que o colesterol desempenha um papel importante na atividade e resistência aos inibidores da biossíntese de esteróis e que o bloqueio da sua utilização pela Leishmania spp. pode ser um alvo para a síntese de novos fármacos para o tratamento da leishmaniose / The trypanosomes do not synthesize cholesterol sterols but with ergostane skeleton, but a significant percentage of exogenous cholesterol is fou nd in all species of Leishmania , suggesting a biologica l rol e for this molecule. This work aims to study the importance of use cholesterol to Leishmania spp . in several cases , evaluating the potential of the s ystem as a possible drug target . The activity of the inhibitors of ergosterol biosynthesis inhibitors associated with transport of LDL cholesterol derivative was evaluated in intracellula r amastigotes and promastigotes . The association between LBqT01 and ketoconazole , miconazol e or terbinafine showed synergy . The association bet ween imipramine or progester one, and ketoconazole , or terbinafine indica ted an additive effect . The ketoconazole and miconazole showed a reduction of up to twice the IC50 value in amastigotes when combined with the inhi bitors of cholesterol transport . Change of ergosterol biosynthesi s of parasites after treatment with inhibitors of cholesterol transport as demonstrat ed by GC/MS was also observed . The combination of LBqT01 and ketoconazole was more active in vivo than either drug individually. We also studied the mechanism of resistanc e of these inhibitors by evaluating the modulation of enzymes of the sterol biosynthesis pathway and use of exo genous cholesterol by parasites . Promastigotes of Leishmania amazonensis , Leishmania braziliensis and Leishmania guyanensis were cultured with in creasing concentrations of simvastati n, terbinafine and miconazole . These inhibitors showed resis tance index from 2.5 to 8 times . Cross - resistance was evaluated with these inhibitors an d reference drugs (miltefosine , amphot ericin B and trivalent antimony) . The expression of sterol biosynthesis genes and use of exogenous cholesterol in the wild and resistant strains were analyz ed by real - time PCR and GC / MS , respectively. The HMGCoA C and - 14 demethyl ase enzymes were more modulated, regardless of the drug u sed , varying its expression in resistant strains . Promastigotes of L. braziliensis resistant to terbinafine pres ented changes in sterol profile, L. amazonensis resistant to all three inhibitors amazonensis and L. guyanensis miconazole resistant showed alte rations in the biosynthesis of sterols and increase in the absorption of exogenous cholesterol. The results show that some genes were amplified in the resistant strain c ompared to the wild type strain . Together these results suggest that cholesterol plays an important role in the activity and resistance to inhibitors of sterol biosynthesis and blocking their use Leishmania spp . may be a target for the synthesis of new drugs for the treatment of leishmaniasis.

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O ergosterol é um componente responsável por manter a integridade e a fluidez das membranas de Leishmania spp. A partir de uma metodologia que consiste em seleção por superexpressão gênica, foram isolados nove diferentes loci de L. (L.) major relacionados com a resistência a dois inibidores da via de biossíntese do ergosterol: Terbinafina (TBF) e Itraconazol (ITZ). Análises funcionais individuais desses nove loci na presença de TBF e ITZ (ou do análogo Cetoconazol - CTZ) apresentaram níveis significantes de resistência após transfecção em células selvagens de L. (L.) major. Nesse trabalho apresentamos a metodologia de isolamento de um desses loci (cItz2), bem como a análise in silico das regiões cromossômicas correspondentes aos insertos dos nove cosmídios no genoma de L. (L.) major / Ergosterol is an important compound responsible to maintain integrity and fluidity of Leishmania spp. membranes. Starting from an overexpression/selection method, our group has isolated nine different loci of L. (L.) major related to resistance against two inhibitors of the ergosterol biosynthesis pathway, Terbinafine (TBF) and Itraconazole (ITZ). Individual functional analysis of these nine loci in the presence of TBF and/or ITZ (or the ITZ analog Ketoconazole, CTZ), have showed significant levels of resistance after transfection into L. (L.) major wild-type cells, followed by over expression induction. In this work, we show the insert mapping and chromosomal identification of one of these loci (cItz2), as well as discuss the in silico chromosomal analysis of the nine correspondent inserts in the L. (L.) major genome