Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / La levadura Xanthophyllomyces dendrorhous es capaz de sintetizar astaxantina, un carotenoide utilizado en la industria acuícola. La síntesis de este pigmento se produce a partir de metabolitos de la ruta del mevalonato, que también son necesarios para la síntesis de esteroles. El ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) es un componente de las membranas celulares de los hongos y el producto final de la ruta de esteroles. Ambas rutas han manifestado estar reguladas por la vía SREBP, la cual en mamíferos regula los niveles de colesterol en la células. En hongos la vía SREBP se encuentra conservada, como en la levadura Schizosaccharomyces pombe donde el factor de transcripción Sre1N regula la síntesis de esteroles y la respuesta a hipoxia. Se ha visto que la regulación de las rutas biosintéticas de carotenoides y esteroles está relacionada, ya que la deleción del gen CYP61 que participa en la síntesis de ergosterol (mutante CBS-6938cyp61-), resultó en un fenotipo que sobreproduce carotenoides. Estas observaciones podrían ser explicadas por un efecto negativo del ergosterol sobre la regulación de la biosíntesis de carotenoides y esteroles, especialmente a nivel de la transcripción de genes de la ruta del mevalonato como el gen HMGR. Es así como en este seminario de título se planteó poner a prueba dicha hipótesis construyendo otros mutantes de la biosíntesis de ergosterol (mutantes de los genes ERG3 y ERG4) para evaluar si estos mantienen el mismo fenotipo que la mutante CBS-6938cyp61- (ausencia de ergosterol y sobreproducción de carotenoides). Mediante análisis bioinformático se identificaron los genes ERG3 y ERG4 de X. dendrorhous y se construyeron los plásmidos para la deleción de ambos genes en la cepa CBS-6938, obteniendo las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. Se evaluó el fenotipo de las mutantes con respecto a la cepa CBS-6938 mediante análisis xiii de carotenoides y esteroles totales, obrservando un aumento en los niveles de esteroles, aunque no se afectó el nivel de carotenoides totales. También se realizó un análisis de expresión mediante RT-qPCR del gen HMGS, el cual posiblemente es regulado por vía SREBP en X. dendrorhous, donde solo observó un aumento en el nivel de transcrito de este gen en la mutante del gen ERG4. Además, las cepas mutantes presentaron una disminución en el crecimiento en presencia de los azoles clotrimazol y ketoconazol y el antifúngico Anfotericina B. Los resultados indican que la via SREBP no se encuentra activa en las mutantes CBS-6938Δerg3 y CBS-6938Δerg4. En conclusión, no es la ausencia de ergosterol lo que estaría activando la via SREBP, sino más bien la acumulación de esteroles específicos como sería el caso la cepa CBS-6938cyp61-. / The yeast Xanthophyllomyces dendrorhous is able to synthesize astaxanthin, a carotenoid used in the aquaculture industry. This pigment is synthesized from metabolites of the mevalonate pathway, which are also necessary for the synthesis of sterols. Ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3β-ol) is a component of fungal cell membranes and the final product of the sterol pathway. Both routes have been reported to be regulated by the SREBP pathway, which in mammals regulates cholesterol levels in cells. In fungi the SREBP pathway is conserved, as in the yeast Schizosaccharomyces pombe where the transcription factor Sre1N regulates the synthesis of sterols and the response to hypoxia. It has been found that the regulation of the biosynthetic pathways of carotenoids and sterols is related, since the deletion of the CYP61 gene involved in the synthesis of ergosterol (mutant CBS-6938cyp61-), resulted in a phenotype that overproduces carotenoids. These observations could be explained by a negative effect of ergosterol on the regulation of the biosynthesis of carotenoids and sterols, especially at the level of the transcription of genes of the mevalonate route such as the HMGR gene. Thus, in this work it was proposed to test this hypothesis by the mutation other mutants of ergosterol biosynthesis (mutants of the ERG3 and ERG4 genes) to evaluate whether they maintain the same phenotype as the mutant CBS-6938cyp61- (absence of ergosterol and overproduction of carotenoids). By bioinformatic analysis, the ERG3 and ERG4 genes of X. dendrorhous were identified and the plasmids were constructed for the deletion of both genes in strain CBS-6938, obtaining the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. The phenotype of the mutants was evaluated with respect to the aforementioned strain CBS-6938 by analysis xv of carotenoids production and total sterols, were an increase in sterol levels was observed although no change was observed in total carotenoids. . An expression analysis was also performed by RT-qPCR of the HMGS gene, which is suggested to be regulated via SREBP in X. dendrorhous. In this case, the mutants presented only increase in the transcript level in the mutant of ERG4. In addition, a decrease in the growth of the mutant strains was observed in the presence of the azoles clotrimazole and ketoconazole and the antifungal agent Amphotericin B. The results indicate that the SREBP pathway is not active in the mutants CBS-6938Δerg3 and CBS-6938Δerg4. In conclusion, it is not the absence of ergosterol that would be activating the SREBP pathway, but rather the accumulation of specific sterols as would be the case with the strain CBS-6938cyp61-.

O ergosterol é um componente responsável por manter a integridade e a fluidez das membranas de Leishmania spp. A partir de uma metodologia que consiste em seleção por superexpressão gênica, foram isolados nove diferentes loci de L. (L.) major relacionados com a resistência a dois inibidores da via de biossíntese do ergosterol: Terbinafina (TBF) e Itraconazol (ITZ). Análises funcionais individuais desses nove loci na presença de TBF e ITZ (ou do análogo Cetoconazol - CTZ) apresentaram níveis significantes de resistência após transfecção em células selvagens de L. (L.) major. Nesse trabalho apresentamos a metodologia de isolamento de um desses loci (cItz2), bem como a análise in silico das regiões cromossômicas correspondentes aos insertos dos nove cosmídios no genoma de L. (L.) major / Ergosterol is an important compound responsible to maintain integrity and fluidity of Leishmania spp. membranes. Starting from an overexpression/selection method, our group has isolated nine different loci of L. (L.) major related to resistance against two inhibitors of the ergosterol biosynthesis pathway, Terbinafine (TBF) and Itraconazole (ITZ). Individual functional analysis of these nine loci in the presence of TBF and/or ITZ (or the ITZ analog Ketoconazole, CTZ), have showed significant levels of resistance after transfection into L. (L.) major wild-type cells, followed by over expression induction. In this work, we show the insert mapping and chromosomal identification of one of these loci (cItz2), as well as discuss the in silico chromosomal analysis of the nine correspondent inserts in the L. (L.) major genome

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arquivototal.pdf: 12262121 bytes, checksum: 2c0c8aa4e0b4b5920d10e406ad12ef1a (MD5) Previous issue date: 2012-08-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Trichophyton rubrum is the main responsible microorganism of chronic cases of dermatophytosis on nails, feet, hands, torso, neck and scalp, with high rates of resistance to antifungal agents. The clinical and epidemiological importance concerned dermatophytosis encourage studies for searching of new antifungal agents. In this context, attention has been drawn to the products from aromatic plants, especially essential oils and their components. The monoterpenes stands out due to widespread recognition of its antimicrobial activity. Therefore, it was investigated the antifungal activity of the monoterpenes citronellal, geraniol and citronellol against 14 strains of T. rubrum. For this, it was determined the minimum inhibitory concentration (MIC) of each drug, as well as their effects on mycelial growth (dry weight), the viability (logCFU/mL), conidial germination and morphogenesis. The action of the drugs on the fungal cell wall (test with sorbitol) and on the fungal cell membrane (release of cellular material, complex with ergosterol and ergosterol synthesis) were also investigated. Moreover, it was analyzed the interference on the infectivity of T. rubrum (in vitro nail infection). Among the tested monoterpenes, geraniol and citronellol were the most potent, since they showed lower MIC values. Assays were performed with geraniol (MIC = 32 μg/mL and MICx2 = 64 μg/mL) and citronellol (MIC = 128 μg/mL and MICx2 = 256 μg/mL), they significantly inhibited the mycelial growth and conidial germination. The monoterpenes showed fungicidal effect and caused caused abnormalities in morphogenesis showing large, short and twisted hyphal in the strains ATCC1683 and LM422. With sorbitol, the MIC values of these monoterpenes increased against the strain ATCC1683, suggesting action on the fungal cell wall. The results of the assays on the cell membrane showed that geraniol and citronellol released intracellular material, formed complexes with the ergosterol and decreased content of ergosterol. Therefore, the results suggest that that geraniol and citronellol act on the membrane of T. rubrum by a mechanism that appears to involve a complex with ergosterol and inhibition its biosynthesis, indirectly affecting the cell wall and causing cell lysis. Moreover, geraniol and citronellol at MIC and MICx2 also prevented infection of T. rubrum on nail fragments. Thus, the monoterpenes geraniol and citronellol are presented as promising antifungal agents, with potential applicability in the treatment of dermatophytosis, especially against the agent T. rubrum. / Trichophyton rubrum é o principal agente responsável por quadros crônicos de dermatofitoses em unhas, nos pés, nas mãos, no tronco, pescoço e couro cabeludo, com altos índices de resistência aos antifúngicos. A importância clínica e epidemiológica dispensada às dermatofitoses impulsionam estudos que visam à descoberta de novos agentes antifúngicos. Neste contexto, grande atenção vem sendo dada aos produtos oriundos de plantas aromáticas, especialmente os óleos essenciais e seus componentes. Entre estes, os monoterpenos se destacam por possuírem amplo reconhecimento do seu poder antimicrobiano. Por isso, foi investigada a atividade antifúngica dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol frente a 14 cepas de T. rubrum. Para tal, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) de cada produto, como também os seus efeitos sobre o crescimento micelial (massa seca), a viabilidade (LogUFC/mL), a germinação de conídios e a morfogênese de T. rubrum. A ação dos produtos sobre a parede celular fúngica (ensaio com sorbitol) e sobre a membrana plasmática fúngica (perda de material citoplasmático, complexação com ergosterol e síntese de ergosterol) também foi investigada. Além disso, foi analisada a interferência sobre a infectividade de T. rubrum (infecção in vitro em unhas). Entre os monoterpenos testados, geraniol e citronelol foram os mais potentes, pois apresentaram menores valores de CIM. Ensaios foram realizados com geraniol (CIM = 32 μg/mL e CIMx2 = 64 μg/mL) e citronelol (CIM = 128 μg/mL e CIMx2 = 256 μg/mL), nos quais eles inibiram significativamente o desenvolvimento micelial e a germinação dos conídios. Os monoterpenos apresentaram efeito fungicida e provocaram alterações na morfogênese formando hifas largas, curtas e tortuosas nas cepas ATCC1683 e LM422. Com sorbitol, os valores de CIM desses monoterpenos aumentaram frente à cepa ATCC1683, sugerindo ação sobre a parede celular fúngica. Os resultados dos ensaios sobre a membrana plasmática mostraram que geraniol e citronelol provocaram liberação de material intracelular, formaram complexos com o ergosterol e diminuíram o conteúdo de ergosterol. Diante dos resultados, sugere-se que o geraniol e citronelol atuam sobre a membrana de T. rubrum por um mecanismo que parece envolver a complexação com o ergosterol e inibição de sua biossíntese, afetando indiretamente a parede celular e ocasionando lise celular. Além do mais, geraniol e citronelol, na CIM e CIMx2, também inibiram a infecção de T. rubrum em fragmentos ungueais. Dessa maneira, os monoterpenos geraniol e citronelol se apresentam como promissores agentes antifúngicos, com potencial aplicabilidade no tratamento das dermatofitoses, em especial contra o agente T. rubrum.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / As membranas biológicas são formadas por uma mistura de várias classes de lipídeos, cujo empacotamento preferencial entre esfingolipídeos e esteróis formam junto com proteínas específicas, esta complexa organização conhecida como microdomínios de membrana. Com o intuito de verificar a presença de microdomínios de membrana em leveduras de fungos patogênicos como Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum, as leveduras desses dois fungos foram lisadas com pérolas de vidro e incubadas com Brij 98 a 4°C. As frações de microdomínios de membrana foram separadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose e, seus componentes analisados por HPTLC, SDS-PAGE e “Western blotting”. As análises dos lipídeos de membrana mostram que aproximadamente 40% do ergosterol das duas espécies de leveduras analisadas estão presentes nos microdomínios de membrana. Enquanto as porcentagens de glicoesfingolipídeos presentes nessas frações correspondem a 42% e 25%, em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. Em conjunto com as análises lipídicas, verificou-se nas duas espécies, um enriquecimento protéico nas frações de microdomínios de membrana, entre estas proteínas podemos citar a Pma1p, uma proteína marcadora de microdomínios de fungos, e uma proteína de 30 kDa, capaz de se ligar a laminina. Para determinar a importância do ergosterol na manutenção da integridade dos microdomínios de membrana utilizou-se metil-beta-ciclodextrina (mβCD), que é capaz de complexar e retirar o ergosterol. Após o tratamento das leveduras com mβCD verificou-se a extração dos esteróis numa proporção de 80% e 70% para P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. No entanto, o perfil de distribuição dos glicoesfingolipídeos e fosfolipídeos, analisados por HPTLC, não apresentou mudanças significativas após o tratamento com a mβCD. As análises protéicas demonstraram o deslocamento de algumas proteínas para frações solúveis do gradiente de sacarose como Pma1p e uma proteína de 30 kDa. Por outro lado, a marcação com o anticorpo anti-α5-integrina mostra a presença de uma proteína de 50 kDa nos microdomínios de membrana, mesmo após o tratamento com a mβCD, sugerindo a existência de uma população de microdomínios de membrana que não depende do ergosterol para manutenção de sua integridade. A importância desses microdomínios de membrana foi testada na infectividade de macrófagos alveolares, onde uma redução de 53% na infectividade de macrófagos foi verificada após o tratamento das leveduras de H. capsulatum com mβCD. Os resultados apresentados nessa tese demonstram a existência de microdomínios de membrana em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, bem como sua importância para a interação levedura-macrófago. / Biological membranes are constituted by a mixture of several classes of lipids. In this enviroment, sphingolipids and sterols pack tightly to form together with specific proteins a complex membrane organization known as membrane microdomains. In order to detect the presence of membrane microdomains in yeast forms of pathogenic fungi, such as Paracoccidioides brasiliensis and Histoplasma capsulatum, yeast forms of both fungi were lysed by vortexing with glass beads and then incubated with Brij 98 at 4ºC. Fractions containing membrane microdomains were isolated by ultracentrifugation on sucrose gradient, and their components were analyzed by HPTLC, SDSPAGE and Western blotting. Analysis of membrane lipids showed that about 40% of ergosterol from both P. brasiliensis and H. capsulatum was present in the membrane microdomains, whereas the percentage of glycosphingolipids present in P. brasiliensis and H. capsulatum was 42% and 25%, respectively. Analysis by SDS-PAGE and Western blotting clearly showed a protein enrichment in the membrane microdomains fraction of both fungi. It is noteworthy the presence of Pma1p, a fungal microdomain marker, and also the presence of a 30 kDa (glyco)protein which binds to laminin. To investigate the requirement of ergosterol to mantain the integrity of membrane microdomains, it was used methylbeta- cyclodextrin (mβCD) an agent able to efficiently extract membrane sterols. After treatment of yeasts using mβCD, it was observed the removal of 80% and 70% of ergosterol in P. brasiliensis and H. capsulatum, respectively. After treatment with mβCD it was observed a shift of 25% of the glycosphingolipids from the insoluble to the soluble fraction, conversely the distribution profile of phospholipids remained unmodified after treatment with mβCD. The protein analysis showed the displacement of a few proteins to soluble fractions of the sucrose gradient, such as Pma1p and the (glyco)protein of 30 kDa. On the other hand, using an anti-α5-integrin antibody it was detected, even after the mβCD treatment, the presence of a 50 kDa protein in membrane microdomains, suggesting the existence of microdomains that do not depend on ergosterol for their integrity. These data strongly suggest the existence of two population of microdomains: i) dependent of ergosterol for integrity maintenance of microdomains and ii) microdomains non-dependent of ergosterol for the maintenance of their functional role. Furthermore, the biological importance of membrane microdomains was clearly demonstrated by a 53% reduction of infectivity of alveolar macrophage infectivity when yeast forms of H. capsulatum were treated with mβCD. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Thesis (M.S.)--Youngstown State University, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 63-68). Also available via the World Wide Web in PDF format.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. Texto parcialmente liberado pelo autor. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-09T17:56:06Z No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-15T13:24:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-15T13:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / O ergosterol tem papel fundamental na estrutura e função da membrana plasmática de fungos. Ele tem sido utilizado como marcador da biomassa fúngica, pois sua variação no tempo está associada à variação de biomassa. Diversos métodos de extração de ergosterol são reportados na literatura. Vários autores têm reportado o uso de delineamentos experimentais para otimizar procedimentos relacionados ao ergosterol, como a extração, cultivo de fungos ou a seleção de substratos para cultivo. Este trabalho teve por objetivo desenvolver e otimizar um método de extração assistida por micro-ondas de ergosterol de Aspergillus tamarii cultivado na presença de casca da maracujá-amarelo (CMA) como fonte de carbono (FC) e determinar o perfil de crescimento de A. tamarii pela quantificação do ergosterol. A massa de ergosterol extraído dividida pela massa inicial de amostra (µg/mg) foi usada como resposta nos experimentos de otimização. A triagem de variáveis da extração indicou que tempo de irradiação, volume de pentano e massa de amostra afetaram a resposta significativamente Um planejamento fatorial 23 foi modelado pela Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) para maximizar a quantidade de ergosterol obtida. Os valores ótimos encontrados foram de 45 s de irradiação, 50 mg de amostra e 10 mL + 5 mL de pentano. A análise de ergosterol por HPLC-DAD apresentou tempo de retenção de 2,8 minutos e não foi observada co-eluição. O método apresentou boa linearidade (r2>0,999; 0,01 – 200,00 µg/mL) e precisão (CV<8.77%) em todas as análises. O ergosterol apresentou uma forte correlação com a biomassa de A. tamarii, além de aparentar ter alguma associação com a biomassa fúngica e a atividade de pectinase em função do tempo de crescimento. / Ergosterol plays an important role to the structure and function of the membrane. It has been used in many studies as a marker of fungal biomass. Several methods of ergosterol extraction are found in literature. Authors have also reported the use of experimental designs to optimize procedures related to ergosterol, such as extraction, fungi cultivation or selection of different substrates. In this work, we aimed to develop and optimize a microwave-assisted extraction method of ergosterol from Aspergillus tamarii grown in the presence of passion fruit peel as carbon source and use the ergosterol production profile to determine the growth curve of A. tamarii. Ergosterol mass divided by initial sample mass (µg/mg) was used as response in optimization experiments. Preliminary selection of variables indicated that irradiation time, pentane volume and sample mass significantly affected the response. The data from a 23 factorial design were used to maximize the amount of ergosterol obtained in the extraction by Response Surface modeling. Ergosterol separation was achieved at 2.8 minutes and no co-elution was observed. The method has showed a good linearity (r2 >0.999, 0.01 – 200.00 µg/mL) and precision (CV<8.77%) to all analyses. Ergosterol showed to be strongly correlated to both pure fungal biomass and sample mass with residual lignocellulosic carbon source, and it appears to have some degree of correlation to the fungal biomass and pectinase activity along the growth time.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-03-17T13:29:19Z No. of bitstreams: 2 Dissertaçao VERA LÚCIA PEREIRA.pdf: 654781 bytes, checksum: 58208be95d7e3eb0df2a87d8e1323112 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-17T13:29:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertaçao VERA LÚCIA PEREIRA.pdf: 654781 bytes, checksum: 58208be95d7e3eb0df2a87d8e1323112 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / CNPq e FACEPE / A região semiárida do nordeste brasileiro é ocupada por uma vegetação de fisionomia variada, adaptada às condições de aridez, denominada caatinga. A Caatinga vem sendo gradativamente impactada pelo desmatamento e uso inadequado dos recursos naturais. Ainda são práticas comuns no preparo da terra para a agropecuária, o desmatamento e as queimadas, que contribuem para desequilibrar o clima, piorar a qualidade do solo e prejudicar a manutenção de populações presentes. Embora grande volume de trabalhos sobre monitoramento da qualidade do solo, envolvendo variados cenários ambientais e de manejo sejam relatados, pouca ênfase é dada à degradação dos solos em regiões secas. Considerando que a atuação dos micro-organismos do solo pode contribuir para a qualidade edáfica, objetivou-se comparar a atividade microbiana em solos sob caatinga nativa e após o desmatamento. Coletas de solo foram realizadas em área sob caatinga nativa (T0), e com 60 (T1), 106 (T2) e 160 (T3) dias de desmatamento, no município de Petrolina, Pernambuco. Avaliaram-se: atividade enzimática, carbono da biomassa microbiana, respiração microbiana, quociente metabólico, ergosterol no solo e estrutura da comunidade microbiana por DGGE. O carbono da biomassa microbiana (CBM) teve maiores valores em T3 e a fosfatase ácida foi significativamente maior em T0. Com o resultado da análise multivariada foram formados três grupos envolvendo os períodos amostrais. O primeiro foi formado pela caatinga nativa (T0), o segundo por T1 e T2, e o último por T3. A maioria da variabilidade dos dados entre os tempos amostrais foi correlacionada positivamente com o carbono da biomassa microbiana e com a atividade da fosfatase ácida, correlação positiva também foi observada para respiração edáfica basal, o teor de ergosterol e atividade da β-glicosidase. As variáveis físicas e químicas do solo, temperatura, CTC, umidade, Na, Al, K e Mg, contribuíram para a separação dos tempos amostrais. A umidade foi determinante para a separação de T3. A temperatura do solo, CTC, os nutrientes K e Mg edáfico influenciaram na formação do grupo composto por T1 e T2. As duas amostragens realizadas após o desmatamento da caatinga apresentaram semelhança formando apenas um grupo, no entanto, após 160 dias de desmatamento, a área mostrou-se diferente de todos os tempos amostrados, fato atribuído às melhores condições proporcionadas pela umidade no solo em decorrência da chuva. Conclui-se que a umidade do solo é mais determinante para a atividade microbiana edáfica do que o desmatamento da caatinga.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-08-18T12:24:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DissertaçãoPPGBF_MarinaAraújo__VF_2016_MA.pdf: 3564525 bytes, checksum: 787b002a72b4c3884e6c55f35a8f508d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-18T12:24:45Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DissertaçãoPPGBF_MarinaAraújo__VF_2016_MA.pdf: 3564525 bytes, checksum: 787b002a72b4c3884e6c55f35a8f508d (MD5) Previous issue date: 2016-02-17 / CNPQ / Os fragmentos de Mata Atlântica do Nordeste brasileiro representam um abrigo para a diversidade de espécies e a redução de vários hectares de mata ao longo dos anos gera perda de diversidade, principalmente, da micobiota microscópica associada a esses ambientes. O desenvolvimento rural sustentável necessita de práticas menos agressivas ao ambiente e, dessa forma, os Sistemas Agroflorestais (SAFs), pela semelhança aos ecossistemas naturais em estrutura e diversidade, têm papel de destaque como alternativa para produção agrícola. Os ambientes de mata, assim como os SAFs, além de fornecerem diferentes substratos para a colonização fúngica, propiciam um ambiente com calor e umidade essenciais para o desenvolvimento de fungos. A micobiota microscópica em folhas em decomposição é composta principalmente por fungos conidiais. Esses fungos exibem grande diversidade de formas e adaptações, estando entre os principais decompositores da matéria orgânica. Dessa forma, o presente trabalho teve por objetivo realizar um estudo de diversidade de fungos conidiais e biomassa fúngica em folhedo de sistema agroflorestal, comparando-o com um fragmento de Mata Atlântica, na região Norte de Pernambuco. Coletas bimestrais foram realizadas na Mata Atlântica nativa de Monjope e no Sítio São João – Sistema agroflorestal (ambos em Abreu e Lima - PE), entre agosto de 2014 e maio de 2015. As amostras de folhedo foram submetidas à técnica de lavagem em água corrente, colocados em câmaras-úmidas e incubados em temperatura ambiente por um período de 45 dias, sendo observados diariamente sob estereomicroscópio. Lâminas semi-permanentes e permanentes foram confeccionadas com as estruturas reprodutivas para a identificação morfológica dos espécimes. As lâminas foram depositadas no Herbário URM da UFPE. A análise da biomassa de fungos no folhedo foi realizada pelo método de quantificação do ergosterol e a relação entre o teor de ergosterol e a ocorrência de fungos conidiais foi determinada. Foram registradas ocorrências de 65 táxons de fungos conidiais, incluindo uma nova espécie (Selenodriella amoena) e uma nova ocorrência para a América do Sul (Linodochium sideroxyli). A concentração de ergosterol foi diferente entre as duas áreas estudadas nos meses de out./14, jan./15 e maio/15, sendo maior no SAF em todos os períodos. O teor de ergosterol da biomassa de fungos no folhedo, em ambas as áreas, possui forte correlação com a ocorrência dos fungos conidiais. Este estudo contribui para ampliar o conhecimento da diversidade de fungos conidiais presentes em folhedo em Pernambuco. / The Brazilian Northeast Atlantic Forest fragments represent a refuge for species diversity and the reduction of several hectares of forest over the years generates loss of diversity, especially microscopic mycobiota associated with these environments. Sustainable rural development requires less aggressive practices to the environment and thus agroforestry systems (AFS), with their similarity to natural ecosystems in structure and diversity, have an important role as an alternative for agricultural production. The forest environments, as well as the SAF’s, provide various substrates for fungal colonization and an environment with heat and humidity essential for the development of fungi. Microscopic mycobiota in decaying leaves is mainly composed of conidial fungi. These fungi exhibit great diversity of shapes and adaptations, being among the major decomposers of organic matter. Thus, this study aimed to investigate conidial fungal diversity and fungal biomass in leaf litter of agroforestry system by comparing it with a fragment of Atlantic Forest in the northern region of Pernambuco. Every two months, samples were taken in the Monjope native Atlantic Forest and Sítio São João - Agroforestry system (both in Abreu e Lima - PE) between August 2014 and May 2015. The litter samples were submitted to the washing technique in running water, placed in humid chambers, and incubated at room temperature for a period of 45 days and observed daily under a stereomicroscope. Semi-permanent and permanent slides were prepared with the reproductive structures for morphological identification of specimens. The slides were deposited in the Herbarium URM UFPE. Analysis of the fungal biomass in leaf litter was carried out using the quantification of ergosterol and the relationship between the ergosterol content and the presence of fungal conidia was determined. The occurrence of 65 taxa of conidial fungi was recorded, including a new species (Selenodriella amoena) and a new record for South America (Linodochium sideroxyli). The concentration of ergosterol was different between the two study areas in the months of Oct. / 14, Jan. / 15 and May / 15, being higher in the SAF in all periods. The ergosterol content of the fungal biomass in leaf litter in both areas has strong correlation with the occurrence of conidial fungi. This study contributes to the understanding of the diversity of conidial fungi present in litter in Pernambuco.

O fenômeno de amplificação gênica é um mecanismo de auto-preservação celular observado com freqüência no protozoário parasita Leishmania quando submetido a estímulos negativos como, por exemplo, a presença de drogas. A região H do genoma de Leishmania (Leishmania) major é um dos loci mais estudados que leva à amplificação em resposta a drogas não relacionadas, como a terbinafina. Foram isoladas linhagens de L. (L.) major e Leishmania (Viannia) braziliensis resistentes à terbinafina. Análises por corridas curtas de eletroforese em campo pulsado (PFGE) e Southern blotting revelaram que a resistência observada nestas linhagens não foi gerada pela amplificação do locus H. Sendo assim, a resistência ao inibidor da esqualeno epoxidase está sendo gerada por um outro mecanismo uma vez que outros loci podem estar envolvidos na resistência à terbinafina e através da análise diferencial do perfil de proteínas, os mutantes resistentes apresentaram diferenças na expressão de proteínas. O alvo inicial para a elucidação da resistência à terbinafina nas linhagens selecionadas foi a via de biossíntese de ergosterol. Foram escolhidos os genes da 3-cetoacil-CoA tiolase (ERG10), esqualeno sintase (ERG9 ou SQS1), esqualeno epoxidase (ERG1), oxidoesqualeno-lanosterol ciclase (ERG7) e lanosterol 14-demetilase (ERG11), de L. major e L. braziliensis, além do gene YIP1 de L. braziliensis. Para isso foram sintetizados oligonucleotídeos a partir das seqüências geradas pelo projeto genoma destas espécies depositadas em bancos de dados. Os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 de L. major e de L. braziliensis além do YIP1 de L. braziliensis amplificados por PCR foram clonados no vetor pGEM-T Easy, que possibilitou a construção de reagentes para ruptura de todos genes pela inserção da marca HYG e, com exceção do gene ERG7 de L. braziliensis, os genes foram subclonados no vetor pXG1. Fragmentos de restrição dos genes clonados no vetor pGEM-T Easy foram utilizados para analisar o nível de seus transcritos por northern blot. Também verificamos através de corridas curtas de PFGE e análises de Southern, que as linhagens em estudo não apresentam amplificação dos loci em estudo. A participação de genes da via de biossíntese de ergosterol de L. major e L. braziliensis e do gene YIP1 de L. braziliensis na resistência ou susceptibilidade à terbinafina e/ou anfotericina B foi verificada através de experimentos funcionais. Com esse objetivo, os genes YIP1, ERG10 e ERG1 de L. braziliensis foram transfectados na linhagem LB2904 de L. braziliensis, e os genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 e ERG11 e a ruptura do gene ERG1 pelo cassete HYG de L. major foram transfectados na linhagem LT252 de L. major. Foram realizados experimentos para analisar a susceptibilidade à anfotericina B associada ou não à terbinafina, das linhagens selvagens de L. major e L. braziliensis, e a partir destes experimentos iniciais, foram selecionadas linhagens destas duas espécies resistentes à anfotericina B. Para analisar a possível função regulatória dos elementos RIME 5/2/6 de L. braziliensis, foi feita a amplificação por PCR da repetição invertida LbRIME 5/2/6b que permitiu a clonagem deste fragmento no vetor pGEM-T Easy e a sua ruptura pela marca SAT. A clonagem no vetor pGEM possibilitou a análise da interação de proteínas nucleares à repetição LbRIME 5/2/6b através do gel shift. / Gene amplification is a common phenomenon observed in Leishmania cell lines subjected to drug pressure. The H locus of Leishmania (Leishmania) major is normally found amplified in cell lines selected in unrelated drugs, as terbinafine. We selected cell lines of L. (L.) major and Leishmania (Viannia) braziliensis resistant to terbinafine. Short-run Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) and Southern blotting analysis showed that this resistance was not generated by H locus amplification. Resistance to squalene epoxidase inhibiter is being generated by other mechanism once others loci can be involved in the terbinafine resistance and through protein partner differential analysis, mutants resistant showed differences in protein expression. The initial target to terbinafine resistance elucidation in the cell lines selected was ergosterol biosynthesis pathway. We choose genes: 3-ketoacyl-CoA thiolase (ERG10), squalene synthase (ERG9 or SQS1), squalene epoxidase (ERG1), oxidosqualene-lanosterol cyclase (ERG7), and lanosterol 14-demethylase (ERG11), of L. major and L. braziliensis, besides YIP1 gene of L. braziliensis. For this, primers were synthesized using the sequences generated by genome project of these species inserted in gene bank. The genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 of L. major and of L. braziliensis besides YIP1 of L. braziliensis were amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector that enabled all genes disruption by insertion of HYG cassette and, with exception of the ERG7 gene of L. braziliensis, genes were subcloned into shuttle-vector pXG1. Restrictions fragments of these genes were used in Northern analysis to verify the transcripts level. We verified through short-run PFGE and Southern analysis that the resistant cell lines do not show amplification of studied loci. The participation of ergosterol biosynthesis pathway genes of L. major and L. braziliensis and YIP1 gene of L. braziliensis in the resistance to terbinafine was verified in functional experiments. With this objective, the genes YIP1, ERG10 and ERG1 of L. braziliensis were transfected into LB2904 cell line of L. braziliensis, and the genes ERG10, SQS1, ERG1, ERG7 and ERG11 and the ERG1 gene disruption by HYG mark of L. major were transfected into LT252 cell line of L. major. Experiments that analyze the susceptibility to amphotericin B associated or not to terbinafine were performed using the wild type cell lines of L. major and L. braziliensis, and with this initials experiments, we selected cell lines of these two species resistant to amphotericin B. In order to analyze the possible regulatory function of the RIME 5/2/6 elements of L. braziliensis, the repeat LbRIME 5/2/6b was amplified by PCR and cloned into pGEM-T Easy vector and with this clone, the element was disrupted with a SAT cassette. The cloning into vector pGEM enabled to analyze the interaction of the nuclear protein with the repeat LbRIME 5/2/6b through gel shift assay.

Ganoderma lucidum is one of most popular medicinal mushrooms in oriental countries. The medicinal properties of Ganoderma lucidum in the treatment of various diseases have been documented for hundreds of years. In recent years, more and more attentions are paid on the studies of the action mechanisms of bioactive compounds purified from this mushroom. / In conclusion, the Ganoderma steroids EP and 9(11)-DHEP can induce caspase-dependent apoptosis in susceptible cancer cells via the mitochondria-mediated pathway. In vitro and in vivo studies suggested that these two fungal steroids have the potential to be used as natural chemopreventive agents. / Keywords: Ergosterol peroxide, 9(11)-dehydroergosterol peroxide, Ganoderma lucidum, Mycelia, Antitumor activity, Apoptosis / The antiproliferative activities of EP and 9(11)-DHEP were studied by flow cytometry. Exposure of cancer cells with these two fungal steroids resulted in an accumulation of cell population at the subG1 phase in a dosage- and time-dependent manner, indicating the induction of apoptotic cell death. Morphological apoptotic changes in HepG2 cells and A375 cells were observed using TUNEL assay and Annexin-V-FLUOS assay. The signaling pathway in apoptotic cell death induced by EP and 9(11)-DHEP involved the activation of caspase 3, 7 and 9, followed by the cleavage of PARP. In Colo201 cells, a change in the ratio of expression levels of Bcl-2/Bax was observed in cells treated with EP and 9(11)-DHEP. In A375 cells, exposure to EP and 9(11)-DHEP resulted in the release of mitochondrial cytochrome c, the down-regulation of Mcl-1 and a slight up-regulation of Bak in a dosage-dependent manner. All these results indicated that apoptotic cell death in susceptible cancer cells induced by EP and 9(11)-DHEP was via the mitochondria-mediated pathway. / The in vivo antitumor activity of EP was demonstrated. EP was shown to suppress the growth of A375 cells in a nude mice xenograft model. Further studies showed that EP induced the cleavage of PARP and enhanced the total caspase 7 gene expression in the tumor cells. / Triterpenes and steroids are two important classes of Ganoderma lucidum metabolites of low molecular mass that are responsible for the antitumor activities of the mushroom. In this study, two fungal steroids, namely, 5alpha,8alpha-epidioxy-22E-ergosta-6,22-dien-3beta-ol (ergosterol peroxide (EP)) and 5alpha,8alpha-epidioxy-22E-ergosta-6,9(11),22-trien-3beta-ol (9,11-dehydroergosterol peroxide (9(11)-DHEP)) were purified from the mycelia of Ganoderma lucidum grown under submerged culture using activity-guided purification procedures against human breast adenocarcinoma MCF-7 cells. In addition to MCF-7 cells, both of these two fungal steroids showed antiproliferative activities against other human cancer cells including hepatocellular carcinoma HepG2 cells, colorectal carcinoma Colo201 cells, esophageal squamous carcinoma KYSE cells and malignant melanoma A375 cells. However, EP and 9(11)-DHEP were less toxic to MCF-10-2A, non-tumorigenic human epithelial cells, and the normal human skin fibroblast Hs68 cells. / Zheng, Lin. / Adviser: Y. S. Wong. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 71-01, Section: B, page: 0253. / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2009. / Includes bibliographical references (leaves 153-176). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. Ann Arbor, MI : ProQuest Information and Learning Company, [200-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.