Made available in DSpace on 2014-06-12T15:07:00Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo918_1.pdf: 580682 bytes, checksum: b12f10fa83b5ebe63b7d20c267f8d8cd (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O querosene é um produto derivado da destilação do petróleo, formado por uma mistura de hidrocarbonetos parafínicos e naftênicos. O presente trabalho objetivou avaliar o potencial de Aspergillus tamarii (UFPEDA 870), Curvularia lunata (UFPEDA 885), Penicillium aurantiogriseum (UFPEDA 884), P. corilophylum (UFPEDA 886)e P. griseofulvum (UFPEDA 880), isolados de uma lagoa poluída na região portuária de Suape, Pernambuco, em degradar o querosene. Inicialmente foi feito um ensaio primário de degradação utilizando o indicador redox 2,6 diclorofenol indofenol. Em seguida os fungos foram adaptados em concentrações crescentes de querosene (1% a 30%) e os produtos da degradação foram analisados por fitotoxicidade. Os fungos que se destacaram foram submetidos ao ensaio de bioestímulo, onde foram empregados três meios de cultura: Bushnell-Haas: tradicional (BH1) e modificados com relações carbono:nitrogênio de 50:1 (BH2) e de 100:1 (BH3). Nos ensaios preliminares A. tamarii e P.griseofulvum apresentaram menor tempo de mudança do indicador, com 14 horas de contato e ainda promoveram um efeito sinérgico para com as demais linhagens, quando em consórcio. Nos ensaios de adaptação, os mesmos cresceram em até 30% de querosene, enquanto que as demais linhagens não sobreviveram a concentrações superiores a 5% (C. lunata) ou produziram baixos teores de biomassa (P. aurantiogriseum e P. corilophyllum), a partir de 15%. Nos ensaios de fitotoxicidade, os resíduos da biodegradação por A. tamarii e por P. griseofulvum, causaram menor impacto às sementes de Brassica oleracea var. capitata (repolho roxo) até a concentração de 12%, obtendo-se 62,6% e 83,6% para o índice de germinação, respectivamente, embora todas as sementes tenham germinado. Para os resíduos degradados por C. lunata, P. aurantiogriseum e P. corilophyllum, as sementes não cresceram apenas germinaram, indicando toxicidade dos produtos da degradação. Os experimentos de bioestímulo realizados com A. tamarii e P. griseofulvum, mostraram maior degradação dos hidrocarbonetos alifáticos do querosene no meio de BH 1 para A. tamarii, enquanto que para P. griseofulvum a melhor composição de meio foi em BH 3. Os resultados obtidos destacam A. tamarii (UFPEDA 870) e P.griseofulvum (UFPEDA 880) como microrganismos promissores na biorremediação de ambientes impactados por querosene

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. Texto parcialmente liberado pelo autor. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-05-09T17:56:06Z No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-15T13:24:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-15T13:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PedroRibeiroFontes_Parcial.pdf: 289992 bytes, checksum: 90578d0d5608bf48ab3a0559a067b009 (MD5) / O ergosterol tem papel fundamental na estrutura e função da membrana plasmática de fungos. Ele tem sido utilizado como marcador da biomassa fúngica, pois sua variação no tempo está associada à variação de biomassa. Diversos métodos de extração de ergosterol são reportados na literatura. Vários autores têm reportado o uso de delineamentos experimentais para otimizar procedimentos relacionados ao ergosterol, como a extração, cultivo de fungos ou a seleção de substratos para cultivo. Este trabalho teve por objetivo desenvolver e otimizar um método de extração assistida por micro-ondas de ergosterol de Aspergillus tamarii cultivado na presença de casca da maracujá-amarelo (CMA) como fonte de carbono (FC) e determinar o perfil de crescimento de A. tamarii pela quantificação do ergosterol. A massa de ergosterol extraído dividida pela massa inicial de amostra (µg/mg) foi usada como resposta nos experimentos de otimização. A triagem de variáveis da extração indicou que tempo de irradiação, volume de pentano e massa de amostra afetaram a resposta significativamente Um planejamento fatorial 23 foi modelado pela Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) para maximizar a quantidade de ergosterol obtida. Os valores ótimos encontrados foram de 45 s de irradiação, 50 mg de amostra e 10 mL + 5 mL de pentano. A análise de ergosterol por HPLC-DAD apresentou tempo de retenção de 2,8 minutos e não foi observada co-eluição. O método apresentou boa linearidade (r2>0,999; 0,01 – 200,00 µg/mL) e precisão (CV<8.77%) em todas as análises. O ergosterol apresentou uma forte correlação com a biomassa de A. tamarii, além de aparentar ter alguma associação com a biomassa fúngica e a atividade de pectinase em função do tempo de crescimento. / Ergosterol plays an important role to the structure and function of the membrane. It has been used in many studies as a marker of fungal biomass. Several methods of ergosterol extraction are found in literature. Authors have also reported the use of experimental designs to optimize procedures related to ergosterol, such as extraction, fungi cultivation or selection of different substrates. In this work, we aimed to develop and optimize a microwave-assisted extraction method of ergosterol from Aspergillus tamarii grown in the presence of passion fruit peel as carbon source and use the ergosterol production profile to determine the growth curve of A. tamarii. Ergosterol mass divided by initial sample mass (µg/mg) was used as response in optimization experiments. Preliminary selection of variables indicated that irradiation time, pentane volume and sample mass significantly affected the response. The data from a 23 factorial design were used to maximize the amount of ergosterol obtained in the extraction by Response Surface modeling. Ergosterol separation was achieved at 2.8 minutes and no co-elution was observed. The method has showed a good linearity (r2 >0.999, 0.01 – 200.00 µg/mL) and precision (CV<8.77%) to all analyses. Ergosterol showed to be strongly correlated to both pure fungal biomass and sample mass with residual lignocellulosic carbon source, and it appears to have some degree of correlation to the fungal biomass and pectinase activity along the growth time.

As endo-1,4-?-xilanases (EC 3.2.1.8) formam o maior grupo de enzimas hidrolíticas envolvido na degradação da xilana, visto que catalisam a hidrólise aleatória de ligações glicosídicas do tipo ?-1,4 no interior da sua cadeia principal, produzindo xilooligossacarídeos de diferentes tamanhos. Na natureza, essas enzimas estão intimamente relacionadas ao fornecimento de energia para o desenvolvimento dos organismos que as produzem. Em geral, as xilanases são isoladas preferencialmente de bactérias e fungos, e têm demonstrado grande potencial na produção de pães, ração animal, alimentos, bebidas, xilitol e bioetanol. O presente trabalho propôs o isolamento de uma nova endo-1,4-?-xilanase por meio de técnicas de produção e purificação acessíveis que pudessem viabilizar economicamente a integração desse biocatalisador aos processos industriais. O fungo Aspergillus tamarii Kita, oriundo de uma amostra de solo da Mata Atlântica, mostrou-se um bom produtor de xilanases em meio de cultura Adams suplementado com bagaço de cevada, um subproduto das indústrias cervejeiras. Após a otimização do processo de fermentação submersa, o extrato enzimático exibiu duas xilanases em gel de atividade para proteínas nativas, identificadas por espectrometria de massas como glicosil hidrolases pertencentes às famílias 10 e 11. A sacarificação enzimática de três resíduos agroindustriais, com base em um delineamento experimental de misturas, demonstrou que a combinação ternária desses componentes, em iguais proporções, possui considerável relevância para a produção de açúcares fermentáveis, tais como glicose e xilose. Em ensaios de imobilização, a xilanase GH11 foi satisfatoriamente estabilizada em matrizes de caráter iônico e covalente. A imobilização por ligação covalente multipontual em glioxil-agarose elevou a temperatura ótima de atividade de 60 para 65 °C e ofertou um considerável ganho de termoestabilidade ao derivado, que apresentou meia vida de 60 minutos a 80 °C. Além disso, a estabilização da enzima nesse suporte permitiu a produção dos seguintes xilooligossacarídeos: xilobiose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose. A purificação da xilanase GH11 foi realizada por meio de uma única etapa cromatográfica de troca catiônica, com rendimento final de 36,72% e um fator de purificação de 7,43 vezes. A massa molecular da enzima foi estimada em 19,5 kDa. Ademais, a sua estrutura tridimensional foi predita por modelagem comparativa, exibindo como modelo final uma arquitetura do tipo ?-jelly roll, comum às xilanases da família 11. Em ensaios de caracterização, a xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 e manteve atividade residual superior a 80% na faixa de pH compreendida entre 4,0 e 9,0, durante 24 horas. Em relação à temperatura, a sua atividade ótima foi observada a 60 °C, contudo, a sua termoestabilidade foi mais expressiva a 50 °C, retendo cerca de 70% da sua atividade inicial por 480 minutos. Para a xilana beechwood, os valores de velocidade máxima e constante de dissociação aparente foram iguais a 1.330,20 µmol/min/mg e 8,13 mg/mL, respectivamente. Na concentração de 5 mM, os metais pesados Co2+, Hg+, Pb2+ e Zn2+ apresentaram um ponderável efeito de inibição sobre a xilanase GH11, enquanto que os íons Ba2+ e Ni2+, assim como os compostos ?-mercaptoetanol e DTT, exibiram um aumento superior a 20% em sua atividade. Por fim, a análise em tempo real da atividade xilanásica revelou que o substrato xilopentaose corresponde ao menor xilooligossacarídeo capaz de ser eficientemente hidrolisado. Sendo assim, a nova endo-xilanase GH11 isolada do fungo A. tamarii Kita exibe uma série de propriedades físico-químicas favoráveis a sua aplicabilidade em escala industrial. / The endo-1,4-?-xylanases (EC 3.2.1.8) form the largest group of hydrolytic enzymes involved in the degradation of xylan, since they catalyze the random hydrolysis of ?-1,4 glycosidic bonds within the main chain of this polysaccharide, producing xylooligosaccharides of different sizes. In nature, these enzymes are closely related to supplying energy for the development of the organisms that produce them. In general, xylanases are preferentially isolated from bacteria and fungi, which show great potential in industries as brewing, animal feed, food, beverage, xylitol and bioethanol. The present work proposed the isolation of a new endo-1,4-?-xylanase by available techniques of production and purification that can economically make feasible the integration of this biocatalyst to industrial processes. The fungus Aspergillus tamarii Kita, obtained from a soil sample of the Atlantic Forest, showed to be a good xylanase producer in Adams culture medium supplemented with barley bagasse, a byproduct of breweries. After the optimization of the submerged fermentation process, the crude enzymatic extract exhibited two xylanases in activity gel for native proteins, identified by mass spectrometry as glycosyl hydrolases belonging to families 10 and 11. The enzymatic saccharification of three agroindustrial residues, based on an experimental mixture design, showed that the ternary combination of these components, in equal proportions, has considerable relevance for the production of fermentable sugars, such as glucose and xylose. The xylanase GH11 was satisfactorily stabilized on matrices of ionic and covalent character in immobilization assays. Covalent multipoint immobilization on glyoxyl agarose raised its optimum temperature of activity from 60 to 65 °C and offered a considerable gain in thermostability to the derivative, which presented a half-life of 60 minutes at 80 °C. In addition, enzyme stabilization on this support allowed the production of the following xylooligosaccharides: xylobiose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose. Xylanase GH11 purification was carried out by means of a single cation exchange chromatographic step, with final yield of 36.72% and purification factor of 7.43 times. The molecular mass of this xylanase was estimated as 19.5 kDa. Moreover, its three-dimensional structure was predicted by comparative modeling, exhibiting a ?-jelly roll type folding as a final model, common to xylanases of family 11. In characterization tests, xylanase presented better activity at pH 5.5 and was considerably stable in the pH range of 4.0 to 9.0. Regarding temperature, its optimum activity was observed at 60 °C, however, its thermostability was more expressive at 50 °C, retaining about 70% of its initial activity for 480 minutes. In the presence of beechwood xylan, the values of maximum velocity and the constant of apparent dissociation were 1,330.20 µmol/min/mg and 8.13 mg/mL, respectively. At concentrations of 5 mM, the heavy metals Co2+, Hg+, Pb2+ and Zn2+showed an inhibition effect on the xylanase, whereas Ba2+ and Ni2+ ions, as well as ?-mercaptoethanol and DTT, exhibited an increase of more than 20% in their activity. Finally, the real-time analysis of xylanase activity revealed that the xylopentose substrate corresponds to the lowest xylooligosaccharide capable of being hydrolyzed. Thus, the new endo-xylanase GH11 isolated from the fungus A. tamarii Kita exhibits a series of physicochemical properties favorable to its applicability on an industrial scale.

As endo-1,4-?-xilanases (EC 3.2.1.8) formam o maior grupo de enzimas hidrolíticas envolvido na degradação da xilana, visto que catalisam a hidrólise aleatória de ligações glicosídicas do tipo ?-1,4 no interior da sua cadeia principal, produzindo xilooligossacarídeos de diferentes tamanhos. Na natureza, essas enzimas estão intimamente relacionadas ao fornecimento de energia para o desenvolvimento dos organismos que as produzem. Em geral, as xilanases são isoladas preferencialmente de bactérias e fungos, e têm demonstrado grande potencial na produção de pães, ração animal, alimentos, bebidas, xilitol e bioetanol. O presente trabalho propôs o isolamento de uma nova endo-1,4-?-xilanase por meio de técnicas de produção e purificação acessíveis que pudessem viabilizar economicamente a integração desse biocatalisador aos processos industriais. O fungo Aspergillus tamarii Kita, oriundo de uma amostra de solo da Mata Atlântica, mostrou-se um bom produtor de xilanases em meio de cultura Adams suplementado com bagaço de cevada, um subproduto das indústrias cervejeiras. Após a otimização do processo de fermentação submersa, o extrato enzimático exibiu duas xilanases em gel de atividade para proteínas nativas, identificadas por espectrometria de massas como glicosil hidrolases pertencentes às famílias 10 e 11. A sacarificação enzimática de três resíduos agroindustriais, com base em um delineamento experimental de misturas, demonstrou que a combinação ternária desses componentes, em iguais proporções, possui considerável relevância para a produção de açúcares fermentáveis, tais como glicose e xilose. Em ensaios de imobilização, a xilanase GH11 foi satisfatoriamente estabilizada em matrizes de caráter iônico e covalente. A imobilização por ligação covalente multipontual em glioxil-agarose elevou a temperatura ótima de atividade de 60 para 65 °C e ofertou um considerável ganho de termoestabilidade ao derivado, que apresentou meia vida de 60 minutos a 80 °C. Além disso, a estabilização da enzima nesse suporte permitiu a produção dos seguintes xilooligossacarídeos: xilobiose, xilotriose, xilotetraose e xilopentaose. A purificação da xilanase GH11 foi realizada por meio de uma única etapa cromatográfica de troca catiônica, com rendimento final de 36,72% e um fator de purificação de 7,43 vezes. A massa molecular da enzima foi estimada em 19,5 kDa. Ademais, a sua estrutura tridimensional foi predita por modelagem comparativa, exibindo como modelo final uma arquitetura do tipo ?-jelly roll, comum às xilanases da família 11. Em ensaios de caracterização, a xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 e manteve atividade residual superior a 80% na faixa de pH compreendida entre 4,0 e 9,0, durante 24 horas. Em relação à temperatura, a sua atividade ótima foi observada a 60 °C, contudo, a sua termoestabilidade foi mais expressiva a 50 °C, retendo cerca de 70% da sua atividade inicial por 480 minutos. Para a xilana beechwood, os valores de velocidade máxima e constante de dissociação aparente foram iguais a 1.330,20 µmol/min/mg e 8,13 mg/mL, respectivamente. Na concentração de 5 mM, os metais pesados Co2+, Hg+, Pb2+ e Zn2+ apresentaram um ponderável efeito de inibição sobre a xilanase GH11, enquanto que os íons Ba2+ e Ni2+, assim como os compostos ?-mercaptoetanol e DTT, exibiram um aumento superior a 20% em sua atividade. Por fim, a análise em tempo real da atividade xilanásica revelou que o substrato xilopentaose corresponde ao menor xilooligossacarídeo capaz de ser eficientemente hidrolisado. Sendo assim, a nova endo-xilanase GH11 isolada do fungo A. tamarii Kita exibe uma série de propriedades físico-químicas favoráveis a sua aplicabilidade em escala industrial. / The endo-1,4-?-xylanases (EC 3.2.1.8) form the largest group of hydrolytic enzymes involved in the degradation of xylan, since they catalyze the random hydrolysis of ?-1,4 glycosidic bonds within the main chain of this polysaccharide, producing xylooligosaccharides of different sizes. In nature, these enzymes are closely related to supplying energy for the development of the organisms that produce them. In general, xylanases are preferentially isolated from bacteria and fungi, which show great potential in industries as brewing, animal feed, food, beverage, xylitol and bioethanol. The present work proposed the isolation of a new endo-1,4-?-xylanase by available techniques of production and purification that can economically make feasible the integration of this biocatalyst to industrial processes. The fungus Aspergillus tamarii Kita, obtained from a soil sample of the Atlantic Forest, showed to be a good xylanase producer in Adams culture medium supplemented with barley bagasse, a byproduct of breweries. After the optimization of the submerged fermentation process, the crude enzymatic extract exhibited two xylanases in activity gel for native proteins, identified by mass spectrometry as glycosyl hydrolases belonging to families 10 and 11. The enzymatic saccharification of three agroindustrial residues, based on an experimental mixture design, showed that the ternary combination of these components, in equal proportions, has considerable relevance for the production of fermentable sugars, such as glucose and xylose. The xylanase GH11 was satisfactorily stabilized on matrices of ionic and covalent character in immobilization assays. Covalent multipoint immobilization on glyoxyl agarose raised its optimum temperature of activity from 60 to 65 °C and offered a considerable gain in thermostability to the derivative, which presented a half-life of 60 minutes at 80 °C. In addition, enzyme stabilization on this support allowed the production of the following xylooligosaccharides: xylobiose, xylotriose, xylotetraose and xylopentaose. Xylanase GH11 purification was carried out by means of a single cation exchange chromatographic step, with final yield of 36.72% and purification factor of 7.43 times. The molecular mass of this xylanase was estimated as 19.5 kDa. Moreover, its three-dimensional structure was predicted by comparative modeling, exhibiting a ?-jelly roll type folding as a final model, common to xylanases of family 11. In characterization tests, xylanase presented better activity at pH 5.5 and was considerably stable in the pH range of 4.0 to 9.0. Regarding temperature, its optimum activity was observed at 60 °C, however, its thermostability was more expressive at 50 °C, retaining about 70% of its initial activity for 480 minutes. In the presence of beechwood xylan, the values of maximum velocity and the constant of apparent dissociation were 1,330.20 µmol/min/mg and 8.13 mg/mL, respectively. At concentrations of 5 mM, the heavy metals Co2+, Hg+, Pb2+ and Zn2+showed an inhibition effect on the xylanase, whereas Ba2+ and Ni2+ ions, as well as ?-mercaptoethanol and DTT, exhibited an increase of more than 20% in their activity. Finally, the real-time analysis of xylanase activity revealed that the xylopentose substrate corresponds to the lowest xylooligosaccharide capable of being hydrolyzed. Thus, the new endo-xylanase GH11 isolated from the fungus A. tamarii Kita exhibits a series of physicochemical properties favorable to its applicability on an industrial scale.