Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Programa de Pós Graduação em Ciências e Tecnologias em Saúde, Laboratório de Interação Parasito-Hospedeiro, 2014. / Submitted by Larissa Stefane Vieira Rodrigues (larissarodrigues@bce.unb.br) on 2014-11-04T12:28:41Z No. of bitstreams: 1 2014_CamilaLasseSilva.pdf: 1435079 bytes, checksum: 0449d2829c5a9fa86a65062e5bbb9333 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2014-11-04T14:36:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_CamilaLasseSilva.pdf: 1435079 bytes, checksum: 0449d2829c5a9fa86a65062e5bbb9333 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-04T14:36:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_CamilaLasseSilva.pdf: 1435079 bytes, checksum: 0449d2829c5a9fa86a65062e5bbb9333 (MD5) / As leishmanioses representam um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e é endêmica em 98 países atingindo mais de 12 milhões de pessoas no mundo. O tratamento disponível para esta doença pode levar a sérios efeitos colaterais e, por se tratar de uma doença negligenciada, os incentivos para o desenvolvimento de novos medicamentos são insuficientes. Este cenário revela a necessidade de estudar a biologia do parasito focalizando na busca de fatores de virulência como alvos potenciais para novos fármacos. As proteases são enzimas que catalisam a hidrólise de ligações peptídicas e estão envolvidas em diversos processos fisiológicos, bem como na patogenia de doenças infecciosas e crônicas. Neste contexto, este trabalho de mestrado se concentrou nos estudos iniciais da prolil oligopeptidase de Leishmania chagasi, uma serino protease, por meio da sua caracterização bioquímica. Primeiramente, para expressar a proteína recombinante, o gene POPLc foi clonado no vetor pET15b e a proteína foi expressa em E. coli BL21-AI sob indução com 0,5 mM de IPTG e 0,2% de L-arabinose a 20 °C por 4 h. A rPOPLc foi expressa de forma solúvel e foi purificada por afinidade da sua cauda de 6 x His em coluna de Ni- Agarose. A partir da enzima purificada foram realizados testes cinéticos, onde a melhor atividade foi encontrada em tampão HEPES 25 mM, DTT 5 mM e NaCl 150 mM, pH 7,5, sendo estabelecido como o tampão ótimo para a atividade enzimática. A enzima apresentou Km de 58,56744 e Vmáx de 4.651,16 mFU/min a partir da hidrólise de Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-AMC, substrato que apresentou maior atividade dentre todos testados neste estudo. A rPOPLc foi inibida por TLCK e TPCK, mas não por ABESF, um inibidor de serino protease. Além do mais, a rPOPLc foi inibida por Z-Pro-Prolinal, um inibidor específico de POPs, com IC50 de 5,2 nM. De acordo com a imunocitolocalização, foi observado que a rPOPLc está presente na região citoplasmática do parasito. Este trabalho permitiu realizar uma primeira caracterização da POP de Leishmania chagasi e o entendimento do seu papel na biologia do parasito poderá contribuir para a busca de novos medicamentos alternativos para as leishmanioses. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Leishmaniasis represents a group of diseases caused by protozoa of the genus Leishmania and is endemic in 98 countries reaching more than 12 million people worldwide. The available treatment for this disease can lead to serious side effects and, since it is a neglected disease, the incentives for the development of new drugs are insufficient. This scenario shows the need to study the biology of the parasite focusing on the search for virulence factors as potential targets for new drugs. Proteases are enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds and are involved in many physiological processes, as well as in the pathogenesis of infectious and chronic diseases. In this context, this work focused on the initial studies of Leishmania chagasi prolyl oligopeptidase a serine protease, through its biochemical characterization. First, to express the recombinant protein, POPLc gene was cloned into pET15b vector and the protein was expressed in Escherichia coli BL21 -AI upon induction with 0.5 mM IPTG and 0.2 % L- arabinose at 20 ° C for 4 h. The rPOPLc was expressed soluble and purified by affinity chromatography in Ni - Agarose column. The kinetic tests show thatPOPLc the best activity was found in HEPES 25 mM, DTT 5 mM and NaCl 150 mM, pH 7.5, buffer set as the optimum one for all enzyme activity test. N-Suc - Gly - Pro - Leu - Gly - Pro - AMC substrate showed the highest activity among all tested in this study and rPOPLc presented a Km and Vmx values of 58,56744 and 4.651,16 mFU/min, respectively, using this substrate. The rPOPLc was inhibited by TPCK and TLCK, although it was insensible to AEBSF. Furthermore, the rPOPLc was inhibited by Z- Pro- prolinal, a specific inhibitor of POPs with IC50 of 5.2 nM. According to immunocitolocalization, it was observed that rPOPLc is present in the cytoplasmic region of the parasite. This work allowed for an initial characterization of Leishmania chagasi POP and the understanding of POPLc role in the biology of the parasite may contribute to the search of new alternative drugs for leishmaniasis.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-11-03T16:47:16Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2549416 bytes, checksum: 595aede818d8b74104e7ce24217b60d9 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-03T16:47:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2549416 bytes, checksum: 595aede818d8b74104e7ce24217b60d9 (MD5) Previous issue date: 2004-12-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Este trabalho mostrou que, apesar de se tornar metabolicamente mais oxidativa com o aumento do peso vivo ao abate, o músculo de rãs continua essencialmente constituído de fibras brancas; que o tipo de insensibilização, bem como a aplicação de estimulação elétrica, de rãs afeta as alterações bioquímicas post-mortem dos seus músculos e as características de qualidade da carne obtida, a qual se apresenta mais elevada quando os animais são sangrados; e que, com base no valor da enzima HADH, é possível se diferenciar carne de rã fresca daquelas previamente congeladas. Evidenciou-se efeito (P < 0,05) da etapa de sangria, mas não do tipo de insensibilização (P > 0,05), sobre o conteúdo total de pigmentos heme e sobre a proporção relativa de suas formas químicas na carne de rãs obtidas. Entretanto, rãs insensibilizadas por eletronarcose apresentam (P < 0,05) menor teor de mioglobina. Animais mais pesados e abatidos com a etapa de sangria apresentaram menor conteúdo de hemoglobina (P < 0,05) e carne mais clara. Os teores de O2Mb, Mb+ e MMb da carne de rãs apresentaram (P < 0,05) alta correlação com a luminosidade (L*), índice de vermelho (a*) e índice de amarelo (b*), respectivamente. Apesar de se manter essencialmente glicolítica, a carne de rãs torna-se (P < 0,05) mais oxidativa (menor relação LDH/CS) e apresenta (P < 0,05) maior concentração de pigmentos totais com o aumento do peso ao abate. Evidenciou-se, ainda, uma maior taxa metabólica em rãs insensibilizadas por eletronarcose, que apresentaram um rigor mais precoce que rãs insensibilizadas por termonarcose. Ainda assim, devido ao seu elevado pH (6,40) muscular e de níveis elevados de ATP (cerca de 4 μmol/g) e fosfocreatina (cerca de 2 μmol/g), o rigor parece ser oriundo do fenômeno de encolhimento pelo frio. Tanto em rãs insensibilizadas por termo e eletronarcose, os níveis de glicogênio se mantiveram estáveis, enquanto os de glicose apresentaram constante elevação post-mortem, atingindo valores finais duas vezes superiores aos iniciais. Durante o período de estocagem avaliado, as rãs insensibilizadas por eletronarcose apresentaram níveis de lactato superiores (P < 0,05) e valores de pH inferiores que aquelas insensibilizadas por termonarcose. Para rãs insensibilizadas por eletronarcose, mas não nas insensibilizadas por termonarcose, a aplicação de estimulação elétrica de baixa voltagem (60 V, 60 Hz por 60 segundos) de carcaças acelera o metabolismo muscular, produzindo uma antecipação (e aumento na taxa) da queda de pH e de aumento de valor R, antecipando o desenvolvimento do rigor. Este resultado aponta para uma possível necessidade do uso de altas voltagens para a estimulação de animais insensibilizados por termonarcose. Após 24 horas, a EE induziu (P < 0,05) um aumento na proporção relativa de pigmentos heme reduzidos (Hb+ e Mb+) e redução na proporção relativa das demais formas químicas (O2Mb, O2Hb, MMb e MHb), além de induzir (P < 0,05) aumento no valor de a* e diminuição do valor de h*, gerando uma carne de coloração mais avermelhada. O índice de amarelo (b*) não foi afetado pela estimulação, mas exerceu uma importante participação relativa na cor da carne de rã, apresentando (P < 0,05) correlação negativa com a %Mb+ e positiva com a %MbO2 e %MMb. Embora sem diferir quanto ao comprimento do sarcômero, os músculos estimulados de rãs-touro insensibilizadas por eletronarcose apresentaram (P < 0,05) menor pH24, maior força de cisalhamento e textura mais firme do que os demais tratamentos. Por fim, evidenciou-se que o método de insensibilização não afeta (P > 0,05) a atividade da enzima HADH, e que, embora esta atividade se eleve (P < 0,05) com o tempo de estocagem congelada, independente do tempo de estocagem refrigerada, é possível obter uma elevada acuidade (96,5% de acerto) na distinção entre carne fresca de rãs (HADH < 65) e carne de rãs congeladas (HADH > 69). / This research showed that, despite turning metabolically more oxidative with increasing live weight, frog muscles are still mostly constituted of white fibers; that the type of frog stunning, as well as the use of electrical stimulation, affect the muscle postmortem biochemical changes and the quality of its meat, which is enhanced by animal bleeding; and, finally, that by using the activity of the HADH enzyme it is possible to distinguish refrigerated frog meat from frozen frog meat. It was shown that bleeding (P < 0.05), but not stunning type (P > 0.05), affected the frog meat total heme pigment content and the relative proportions of its chemical forms. However, electrically stunned frogs presented (P < 0.05) lower myoglobin content. Heavier and bled frogs presented a lighter meat having lower (P < 0.05) hemoglobin content. The levels of O2Mb, Mb+ and MMb were, respectively, highly correlated with lightness (L*), redness (a*) and yellowness (b*) scores. It was demonstrated that, despite maintaining itself essentially glycolytic, frog meat becomes (P < 0.05) more oxidative (lower LDH/CS ratio) and present (P < 0.05) higher total heme pigment content with increasing frog live weight. In the third chapter it was shown a higher metabolic rate in electrically stunned frogs that had a hastened rigor compared to those thermally stunned. Still, due to its high muscle pH (6.40) and high ATP (~ 4 μmol/g) and phosphocreatine (~ 2 μmol/g) content, the rigor seems to be cold induced. Both in electrically, as well in thermally, stunned frogs muscular glycogen content remained unchanged while their glucose levels raised constantly postmortem, reaching final values about twice those of the initial ones. In every storage time, compared to thermally stunned frogs, lactate levels were higher (P < 0.05) and pH values were lower in electrically stunned frogs. It was shown that for electrically stunned frogs, but not for thermally stunned frogs, the use of low voltage carcass electrical stimulation (60 V, 60 Hz for 60 seconds) hastens muscle metabolism accelerating pH fall and R value increase as well as the rate of their change inducing a faster rigor development. This result points to a possible need of using high voltages if electrical stimulation (EE) of thermally stunned frogs is to be effectively used. After 24 hours EE induced (P < 0.05) an increase in the relative proportion of reduced heme pigments (Hb+ e Mb+) an a decrease in the relative proportion of the other pigment chemical forms (O2Mb, O2Hb, MMb e MHb). It also induced (P < 0.05) an increase in a* value and a decrease in hue angle (h*), yielding a more reddish colored frog meat. Though b* value was not affected by EE it had an important contribution to the frog meat color, showing (P < 0.05) a negative correlation with Mb+ content and a positive correlation with MbO2 and MMb content. Though not differing as to their sarcomere length the stimulated muscles of electrically stunned frogs showed (P < 0.05) lower pH24, higher shear force and firmer texture than those of the other treatments. Finally, it was shown that the stunning method does not affect (P < 0.05) the activity of the HADH enzyme and that, though this activity increases (P < 0.05) with time of frozen storage, it is possible, regardless the time of refrigerated storage, to obtain a high level of success (96.5% of correct identifications) in distinguishing fresh (HADH < 65) from frozen (HADH > 69) frog meat.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-12-01T17:51:58Z No. of bitstreams: 1 2015_ElisianeFuhrmann.pdf: 1300468 bytes, checksum: 1b79310f5001c21749aa2034a648ca09 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-13T21:26:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ElisianeFuhrmann.pdf: 1300468 bytes, checksum: 1b79310f5001c21749aa2034a648ca09 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-13T21:26:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ElisianeFuhrmann.pdf: 1300468 bytes, checksum: 1b79310f5001c21749aa2034a648ca09 (MD5) / A mandioca (Manihot esculenta Crantz) é considerada uma espécie relevante como fonte alimentícia para a população mundial, principalmente para os países subdesenvolvidos e emergentes. A mandioca é fornecedora de energia a partir do amido acumulado em suas raízes de reserva, mas é também importante destacar a presença dos carotenóides com atividade antioxidante. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar, por meio de descritores morfológicos, agronômicos e bioquímicos, clones elite de mandioca de mesa de polpa aparelhada e rosada do programa de melhoramento genético de mandioca da Embrapa Cerrados. Foram caracterizados durante duas safras, 13 clones de mandioca de mesa com polpa amarelada e 8 clones com polpa rosada, em comparação com a variedade testemunha IAC 576-70 (BGMC 753). Para avaliar as características morfológicas foram obtidos 40 descritores qualitativos para cada clone. Tanto nos clones de polpas amarelada quanto naqueles de raízes de polpas rosada, houve diferenças morfológicas, demostrando que nenhum clone apresentou 100% de similaridade. O fator ano/safra não influenciou a expressão fenotípica dos caracteres aferidos. Com base no coeficiente cofenético, verificou-se elevado ajuste entre a representação gráfica via dendrograma de r = 0,80 nas raízes de polpa amarelada e r = 0,92 na rosada e a matriz de dissimilaridade genética. Entre os caracteres aferidos, os que apresentaram maior entropia nas raízes amarelada foram, a coloração da epiderme externa, forma do lóbulo central da folha e cor do córtex da raiz, ao passo que na rosada foi à cor do disco, forma do lóbulo central e cor do pecíolo. Foi realizada também a caracterização com base na altura da planta, altura da primeira ramificação, peso da parte aérea sem a cepa, produtividade em raízes, índices de amido nas raízes determinados por meio do método da balança hidrostática, tempo para a cocção e teor de ácido cianídrico nas raízes. Com base nos caracteres avaliados, os clones que se destacaram com polpa amarelada e rosada respectivamente, no caractere altura da primeira ramificação (273/08 e 259/08) e (390/08, 345/08 e a testemunha IAC 576-70), altura da planta (90/08, 272/08, 273/08, 497/08, 259/08 e 450/08) e (390/08, 345/08 e 378/08), peso da parte aérea sem a cepa (94/08 e 272/08) e (390/08, 406/08, 390/08, 378/08 e 341/08), porcentagem de amido nas raízes (26/08, 272/08, 259/08 e 450/08) e (378/08, 413/08, 390/08 e a testemunha IAC 576-70), produtividade de raízes (215/08) e (testemunha IAC 576-70, 341/08, 406/08, 390/08 e 387/08). Com relação ao tempo de cocção na safra 2011/2012, todos os clones necessitaram de tempo inferior a 30 minutos. Em relação ao teor de carotenóides totais nas raízes os clones de amarelada que se destacaram foram 91/08, 94/08, 215/08, 246/08, 272/08 e 497/08, e, naqueles de raízes rosada, os clones 406/08 e 341/08. Em relação ao teor de proteínas nas raízes amarelada, os clones 26/08, 90/08 e 91/08, foram os melhores enquanto nas raízes rosada se destacaram os clones 406/08 e a testemunha IAC 576-70. Os teores de HCN nas raízes de reserva de mandioca foram inferiores a 100 mg kg-1 em todos os clones avaliados. Diferenças significativas entre clones de mandioca de polpas amarelada e rosada foram verificadas para todas as características agronômicas, morfológicas e bioquímicas avaliadas. Os clones tiveram bom desempenho nas avaliações para o cultivo comercial na região do Cerrado e, alguns destes, têm potencial para utilização no melhoramento visando o incremento de carotenóides. / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is considered a relevant species as a food source for the world's population, particularly for developing and emerging countries. The cassava is a provider of energy from starch accumulated in their reserve roots, but it is also important to highlight the presence of carotenoids with antioxidant activity. In this context, this study aimed to characterize, using morphological, agronomic and biochemical, descriptors elite clones from sweet cassava of yellowish and pinkish pulps from the cassava breeding program at Embrapa Cerrados. They were characterized for two crops, 13 edible cassava clones with yellowish pulp and 8 clones with pinkish pulp, compared with the control variety IAC 576-70 (BGMC 753). To evaluate the morphological characteristics were obtained 40 qualitative descriptors for each clone. Both clones the yellowish pulp as those the roots the pinkish pulp, there was morphological differences among clones, showing that no clone showed 100% similarity. The year / crop factor did not influence the phenotypic expression of measured characters. Based on cofenetic coefficient, was found high fit between the graphical representation via dendrogram of r = 0.80 in the roots of yellowish pulp and r = 0.92 in the pinkish of genetic dissimilarity matrix. Among the measured characters, those with the highest entropy in the yellowish roots were, the color of the outer epidermis, the central lobe shape of the leaf and root cortex color, whereas the pinkish was the color to disc, central lobe shape and petiole color. We also performed the characterization based on plant height, the first branch point, and shoot weight without strain, productivity in roots, and index of starch in the roots determines by the method of hydrostatic balance, time for cooking and acid cyanide content in the roots. Based on the evaluated characters, clones stood out with pulps yellowish and pinkish respectively, characters height of the first branch (273/08 and 259/08) and (390/08, 345/08 and the witness IAC 576-70), plant height (90 / 08, 272/08, 273/08, 497/08, 259/08 and 450/08) and (390/08, 345/08 and 378/08), shoot weight without strain (94/08 and 272/08) and (390/08, 406/08, 390/08, 378/08 and 341/08), percentage of starch in the roots (26/08, 272/08, 259/08 and 450/08) and (378/08, 413/08, 390/08 and the witness IAC 576-70), roots of productivity (215/08) and (witnesses IAC 576-70, 341/08, 406/08, 390/08 and 387/08). Regarding the cooking time in the 2011/2012 harvest, all clones showed time less than 30 minutes. Regarding the total carotenoid content in the pulps clones of yellowish roots that stood out were 91/08, 94/08, 215/08, 246/08, 272/08 and 497/08, and, those the clones with pulp pinkish 406/08 and 341/08. Regarding the protein content in yellowish roots the clones 26/08, 90/08 and 91/08, was the best while the pinkish roots highlight clones 406/08 and witness IAC 576-70. The levels of HCN in reserve roots of cassava were less than 100 mg kg-1em all evaluated clones. Significant differences between yellowish and pinkish of pulps cassava clones were checked for all agronomic, morphological and biochemical characteristics evaluated. The clones had well in the ratings for commercial cultivation in the Cerrado region and some of these, clones has potential for use in breeding aimed at increase of carotenoids.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5244_1.pdf: 1285875 bytes, checksum: 5de402e10c4ec2c9f263508fa2280a1d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos foram realizados com treze linhagens de Chromobacterium violaceum avaliando as características bioquímicas, a variabilidade genética e a produção de polihidroxialcanoato. Os isolados demonstraram maior crescimento no meio Luria Bertani, suplementado com glicose. Todos os isolados foram negativos para os testes de uréia, manitol, lactose e indol, e positivos para frutose, lisina, sacarose, glicose, catalase, gelatinase, motilidade e oxidase. Todas as linhagens demonstraram resistência aos antimicrobianos ampicilina e cefalotina. Observouse ainda, resistência para gentamicina e amicacina (UCP 1035-Ceará) e para imipenen, cloranfenicol e amicacina (UCP 1489-Pernambuco), evidenciando características fenotípicas distintas entre as treze linhagens. A variabilidade genética das linhagens de C. violaceum foi avaliada pelo índice de similaridade de Jaccard, utilizando-se o método UPGMA nas análises de agrupamento. Os índices de similaridade variaram de 0,17 a 0,35 para onze isolados, enquanto que, os isolados UCP 1462 e UCP 1463 apresentaram 100% de similaridade. O perfil de RAPD foi característico para cada linhagem, permitindo a formação de dois grupos indicando a variabilidade genética dos isolados analisados. A detecção da produção de polihidroxialcanoato foi realizada utilizando os corantes Nilo blue e verde malaquita, destacando-se a linhagem de C. violaceum UCP 1467, como maior produtora do biopolímero

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2018-04-25T12:12:13Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-25T12:12:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1655662 bytes, checksum: c2460b038388046dbed898dded1a7531 (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos nematófagos são controladores naturais de nematoides parasitos de plantas e animais. São amplamente usados no controle biológico de nematoides parasitos gastrintestinais (NPG) de ruminantes por reduzir formas de vida livre nas pastagens. O processo de captura de nematoides segue uma ordem de eventos que envolve atração, adesão, penetração e degradação da cutícula do nematoide. As fases de penetração e degradação, envolvem a produção e secreção de enzimas extracelulares capazes de hidrolisar a cutícula dos nematoides, causando sua morte. Proteases de Arthrobotrys cladodes (CG719) foram purificadas por cromatografia de troca aniônica (Mono Q) e gel filtração em coluna Protein-Pak em sistema HPLC. A atividade nematicida das proteases foi testada em larvas infectantes (L 3 ) de nematoides parasitos gastrintestinais de ruminantes. O efeito sobre a bainha e cutícula das larvas foi observado por microscopia eletrônica de varredura e transmissão. As proteases purificadas chamadas de proteases de Arthrobotrys cladodes I (AcPI) e proteases de Arthrobotrys cladodes II (AcPII), têm massa molecular estimada de 56 e 39 kDa, respectivamente. A atividade enzimática dessas proteases foi maior em pH neutro a alcalino (7-8) e em temperaturas de 55 a 60°C. Ambas foram inativadas pelo inibidor fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) sugerindo pertencerem ao grupo das serina proteases. As proteases apresentaram maior atividade enzimática na presença do íon metálico Ca +2 . A fração de protease, purificada por cromatografia de troca aniônica, apresentou atividade larvicida provocando a morte de 53% das L 3 de NPG após 24 h de exposição. As AcPI e AcPII causaram mortalidade de 31 e 27% das L 3 , respectivamente, após 24 h, sugerindo ação aditiva na degradação da cutícula dos nematoides. Na microscopia eletrônica de varredura e transmissão, foram observadas alterações morfológicas, descamações, danos na camada basal, epicutícula, “annulis”, “furrows”, “alae”, hipoderme, e musculatura. Em algumas regiões, a camada cortical foi inteiramente destruída. Lesões provocaram extravasamento de líquido intracelular e perda de tecido. Proteases extracelulares secretadas por A. cladodes foram eficientes na penetração e degradação da cutícula de nematoides. Estas enzimas romperam a integridade física e fisiológica da dupla cutícula de L 3 de NPG. Isto pode permitir o desenvolvimento de fármacos para agir, diretamente, sobre helmintos ou, de forma sinérgica, com medicamentos comerciais. / Nematophagous fungi are natural enemies of parasitic nematodes of plants and animals. They are widely used in biological control of gastrointestinal nematodes (GIN) of ruminants by reducing free-living forms in pastures. The nematode capture process follows an order of events that involves attraction, adhesion, penetration and degradation of nematode cuticle. The phases of penetration and degradation, involve the production and secretion of extracellular enzymes capable of hydrolyzing the cuticle of the nematodes, causing their death. Proteases from Arthrobotrys cladodes (CG719) were purified by anion exchange chromatography (Mono Q) and gel filtration on a Protein-Pak column by HPLC system. The nematicidal activity of the proteases was tested in infective larvae (L3) of gastrointestinal parasitic nematodes of ruminants. The effect on the sheath and cuticle of the larvae were observed by scanning and transmission electron microscopy. The purified proteases called Proteases from Arthrobotrys cladodes I (AcPI) and Proteases from Arthrobotrys cladodes II (AcPII), have an estimated molecular mass of 56 and 39 kDa, respectively. The enzymatic activity of these proteases was higher at neutral to alkaline (7-8) pH and at temperatures of 55 to 60°C. Both were inactivated by the phenylmethylsulfonyl fluoride inhibitor (PMSF) suggesting that they belong to the serine proteases group. The proteases showed higher enzymatic activity in the presence of the Ca +2 metal ion. The protease fraction, purified by anion exchange chromatography, showed larvicidal activity causing the death of 53% of L 3 from GINs after 24 h of exposure. AcPI and AcPII caused mortality of 31 and 27% of L 3 , respectively, after 24 h, suggesting additive action in the degradation of the nematode cuticle. In scanning and transmission electron microscopy morphological changes, peeling, basal layer, epicuticle, annulis, furrows, alae, hypodermis, and musculature were observed. In some regions the cortical layer was entirely destroyed. Lesions caused extravasation of intracellular fluid and loss of tissue. Extracellular proteases secreted by A. cladodes were efficient in penetration and degradation of the nematode cuticle. These enzymes disrupted the physical and physiological integrity L 3 of GIN double cuticle. This may allow the development of drugs to act directly on helminths or, synergistically, with commercial drugs.

Muitas doenças parasitárias, consideradas negligenciadas devido à falta de investimentos para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento por parte dos setores público e privado, constituem um grave problema de saúde pública mundial e um obstáculo ao desenvolvimento sócio-econômico de países pobres e emergentes. A esquistossomose, em especial, é uma parasitose causada por platelmintos trematódeos do gênero Schistosoma que afeta 78 países e aproximadamente 249 milhões de pessoas. No Brasil, o S. mansoni é o agente etiológico causador da esquistossomose, chega a atingir 19 estados e aproximadamente 6 milhões de indivíduos. Embora atualmente o fármaco praziquantel seja utilizado para o tratamento da esquistossomose, há a necessidade de busca por novas opções terapêuticas, uma vez que este possui eficácia restrita ao estágio adulto do parasita, efeitos colaterais que dificultam a adesão do paciente ao tratamento e, dada a massiva administração do medicamento, a resistência do parasita ao medicamento pode se tornar um sério problema de saúde pública. Dentro deste contexto, existe um grande interesse em buscar novos alvos macromoleculares e em particular investigar o potencial da enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) como possível alvo terapêutico para o desenvolvimento de terapias eficazes e seguras para o tratamento da esquistossomose. A enzima DHODH participa da quarta etapa enzimática da via de biossíntese de nucleotídeos pirimidínicos, e estudos recentes demonstram que a inibição específica desta enzima compromete a produção de nucleotídeos, e consequentemente a proliferação celular. Na verdade a enzima DHODH já é alvo validado para o tratamento de doenças como o câncer, a artrite reumatoide e doenças parasitárias como a malária. Como primeira etapa para a avaliação do potencial terapêutico da enzima DHODH no tratamento da esquistossomose, este projeto propõe a caracterização bioquímica e biofísica da DHODH de Schistosoma mansoni, bem como a identificação de inibidores para esta enzima. Os resultados obtidos até o presente momento consistem no desenvolvimento de um protocolo de expressão e purificação que permitiram a obtenção de proteína pura e com rendimento de 40 miligramas de proteína por litro de meio de cultura. Nossos estudos demonstraram que a proteína se mostra mais estável na presença de detergente, alta concentração de sal e glicerol. Ensaios de espalhamento dinâmico de luz realizados a partir de amostras de SmDHODH purificadas a partir da associação de cromatografia por afinidade com cromatografia por exclusão molecular foram utilizados para a caracterização de uma população homogênea de diâmetro aproximado de 90 Å. Ensaios de atividade enzimática e de inibição foram realizados para SmDHODH, como também para a proteína homóloga humana, HsDHODH, de forma a permitir estudos comparativos. Os resultados sugerem que o pH ótimo da reação para ambas as enzimas se encontra na faixa entre 8,0 e 8,5. O protocolo de caracterização cinética desenvolvido para estas enzimas permitiu a obtenção dos parâmetros KM e kcat, assim como dar início à realização de ensaios de inibição na presença de bancos de ligantes de origem sintética e natural. Os resultados cinéticos obtidos sugerem que a SmDHODH e a HsDHODH seguem o mecanismo ii Ping-Pong, de acordo com o que já foi descrito para as outras DHODHs, com os seguintes valores de KM e kcat: KDHO= 174 ± 18 ?M; KQo= 159 ± 18 ?M; e kcat= 27 ± 1 s-1 para a SmDHODH e KDHO= 286 ± 31 ?M; KQo= 354 ± 38 ?M; e kcat= 78 ± 4 s-1 para a HsDHODH. Foram identificados compostos químicos com potencial inibitório na faixa de 794 ? 3 ?M a 19,1 ? 0,1 nM para a SmDHODH e de 33,9 ? 0,1 ?M a 37,2 ? 0,1 nM para a HsDHODH. Os resultados deste trabalho aliado aos estudos estruturais em desenvolvimento pelo nosso laboratório serão utilizados não só para a completa caracterização da enzima, mas também para o futuro planejamento de ligantes específicos baseados na estrutura e função protéica, como uma importante ferramenta no combate à esquistossomose. / Many parasitic diseases, considered neglected due to lack of investment from the public and private sectors in the development of new strategies for prevention and treatment, are a serious global public health problem and a hindrance to the development of poor and emergent countries. Schistosomiasis, in particular, is a parasitic disease caused by trematode plathelmintes of the genus Schistosoma that affects 78 countries and approximately 249 million people. In Brazil, S. mansoni, the endemic etiologic agent of schistosomiasis, is found in 19 states and affects approximately 6 million people. Although the drug praziquantel is currently used for the treatment of schistosomiasis, this drug has limited effectiveness in the adult stage of the parasite, many side effects hamper the adherence to the patient´s treatment and, given the intense drug usage, resistant parasites can, very soon, become a serious public health problem. Thus, there is a real need for the search of new therapeutic options. Within this context, there is a great interest in the search for new macromolecular targets against Schistosoma mansoni and in particular, to investigate the enzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) as new therapeutic target for the treatment of schistosomiasis. DHODH catalyzes the conversion of dihydroorotate (DHO) to orotate (ORO) in the fourth step of the pyrimidine nucleotides pathway. Recent studies show that specific inhibition of this enzyme commits nucleotides biosynthesis and, consequently, cell proliferation. DHODH is, in fact, a validated target for the treatment of diseases such as cancer, rheumatoid arthritis and malaria. As a first step towards the evaluation of the therapeutic potential of DHODH from S. mansoni (SmDHODH) for the treatment of schistosomiasis, this project proposed the biochemical and biophysical characterization, as well as the identification of inhibitors for this enzyme. The results obtained so far included the development of an expression and purification protocol that allowed us to obtain pure protein with a good yield. In addition, our findings reveals that for SmDHODH stabilization the enzyme requires a buffer containing detergent, glycerol and high salt concentration. Dynamic light scattering studies performed with SmDHODH protein samples purified by a combination of both affinity chromatography and size exclusion chromatography allowed the characterization of a homogeneous population with approximately 90 Å diameter. In order to allow comparative studies, enzymatic and inhibitory assays were performed for SmDHODH as well as for the human homologous enzyme (HsDHODH). The results suggest that for both enzymes the optimum pH for the enzymatic reaction is found in the range of 8.0 and 8.5. The enzymatic assay developed for this class of enzymes allowed the characterization of the kinetic parameters KM and kcat for both enzymes, as well as the performance of inhibitory assays in the presence of synthetic and natural ligands. The inhibition tests allowed us the identification of chemical compounds that inhibit SmDHODH in the range of 794 ? 3 ?M to 19.1 ? 0.1 nM and HsDHODH in the range of 33.9 ? 0.1 ?M a 37.2 ? 0.1 nM. The results of this work, together with structural studies currently in progress in our laboratory will be exploited for the complete characterization of the iv enzyme, as well as for the development of specific inhibitors of SmDHODH, as an important tool in the fight against schistosomiasis.

Muitas doenças parasitárias, consideradas negligenciadas devido à falta de investimentos para o desenvolvimento de novas estratégias de prevenção e tratamento por parte dos setores público e privado, constituem um grave problema de saúde pública mundial e um obstáculo ao desenvolvimento sócio-econômico de países pobres e emergentes. A esquistossomose, em especial, é uma parasitose causada por platelmintos trematódeos do gênero Schistosoma que afeta 78 países e aproximadamente 249 milhões de pessoas. No Brasil, o S. mansoni é o agente etiológico causador da esquistossomose, chega a atingir 19 estados e aproximadamente 6 milhões de indivíduos. Embora atualmente o fármaco praziquantel seja utilizado para o tratamento da esquistossomose, há a necessidade de busca por novas opções terapêuticas, uma vez que este possui eficácia restrita ao estágio adulto do parasita, efeitos colaterais que dificultam a adesão do paciente ao tratamento e, dada a massiva administração do medicamento, a resistência do parasita ao medicamento pode se tornar um sério problema de saúde pública. Dentro deste contexto, existe um grande interesse em buscar novos alvos macromoleculares e em particular investigar o potencial da enzima diidroorotato desidrogenase (DHODH) como possível alvo terapêutico para o desenvolvimento de terapias eficazes e seguras para o tratamento da esquistossomose. A enzima DHODH participa da quarta etapa enzimática da via de biossíntese de nucleotídeos pirimidínicos, e estudos recentes demonstram que a inibição específica desta enzima compromete a produção de nucleotídeos, e consequentemente a proliferação celular. Na verdade a enzima DHODH já é alvo validado para o tratamento de doenças como o câncer, a artrite reumatoide e doenças parasitárias como a malária. Como primeira etapa para a avaliação do potencial terapêutico da enzima DHODH no tratamento da esquistossomose, este projeto propõe a caracterização bioquímica e biofísica da DHODH de Schistosoma mansoni, bem como a identificação de inibidores para esta enzima. Os resultados obtidos até o presente momento consistem no desenvolvimento de um protocolo de expressão e purificação que permitiram a obtenção de proteína pura e com rendimento de 40 miligramas de proteína por litro de meio de cultura. Nossos estudos demonstraram que a proteína se mostra mais estável na presença de detergente, alta concentração de sal e glicerol. Ensaios de espalhamento dinâmico de luz realizados a partir de amostras de SmDHODH purificadas a partir da associação de cromatografia por afinidade com cromatografia por exclusão molecular foram utilizados para a caracterização de uma população homogênea de diâmetro aproximado de 90 Å. Ensaios de atividade enzimática e de inibição foram realizados para SmDHODH, como também para a proteína homóloga humana, HsDHODH, de forma a permitir estudos comparativos. Os resultados sugerem que o pH ótimo da reação para ambas as enzimas se encontra na faixa entre 8,0 e 8,5. O protocolo de caracterização cinética desenvolvido para estas enzimas permitiu a obtenção dos parâmetros KM e kcat, assim como dar início à realização de ensaios de inibição na presença de bancos de ligantes de origem sintética e natural. Os resultados cinéticos obtidos sugerem que a SmDHODH e a HsDHODH seguem o mecanismo ii Ping-Pong, de acordo com o que já foi descrito para as outras DHODHs, com os seguintes valores de KM e kcat: KDHO= 174 ± 18 ?M; KQo= 159 ± 18 ?M; e kcat= 27 ± 1 s-1 para a SmDHODH e KDHO= 286 ± 31 ?M; KQo= 354 ± 38 ?M; e kcat= 78 ± 4 s-1 para a HsDHODH. Foram identificados compostos químicos com potencial inibitório na faixa de 794 ? 3 ?M a 19,1 ? 0,1 nM para a SmDHODH e de 33,9 ? 0,1 ?M a 37,2 ? 0,1 nM para a HsDHODH. Os resultados deste trabalho aliado aos estudos estruturais em desenvolvimento pelo nosso laboratório serão utilizados não só para a completa caracterização da enzima, mas também para o futuro planejamento de ligantes específicos baseados na estrutura e função protéica, como uma importante ferramenta no combate à esquistossomose. / Many parasitic diseases, considered neglected due to lack of investment from the public and private sectors in the development of new strategies for prevention and treatment, are a serious global public health problem and a hindrance to the development of poor and emergent countries. Schistosomiasis, in particular, is a parasitic disease caused by trematode plathelmintes of the genus Schistosoma that affects 78 countries and approximately 249 million people. In Brazil, S. mansoni, the endemic etiologic agent of schistosomiasis, is found in 19 states and affects approximately 6 million people. Although the drug praziquantel is currently used for the treatment of schistosomiasis, this drug has limited effectiveness in the adult stage of the parasite, many side effects hamper the adherence to the patient´s treatment and, given the intense drug usage, resistant parasites can, very soon, become a serious public health problem. Thus, there is a real need for the search of new therapeutic options. Within this context, there is a great interest in the search for new macromolecular targets against Schistosoma mansoni and in particular, to investigate the enzyme dihydroorotate dehydrogenase (DHODH) as new therapeutic target for the treatment of schistosomiasis. DHODH catalyzes the conversion of dihydroorotate (DHO) to orotate (ORO) in the fourth step of the pyrimidine nucleotides pathway. Recent studies show that specific inhibition of this enzyme commits nucleotides biosynthesis and, consequently, cell proliferation. DHODH is, in fact, a validated target for the treatment of diseases such as cancer, rheumatoid arthritis and malaria. As a first step towards the evaluation of the therapeutic potential of DHODH from S. mansoni (SmDHODH) for the treatment of schistosomiasis, this project proposed the biochemical and biophysical characterization, as well as the identification of inhibitors for this enzyme. The results obtained so far included the development of an expression and purification protocol that allowed us to obtain pure protein with a good yield. In addition, our findings reveals that for SmDHODH stabilization the enzyme requires a buffer containing detergent, glycerol and high salt concentration. Dynamic light scattering studies performed with SmDHODH protein samples purified by a combination of both affinity chromatography and size exclusion chromatography allowed the characterization of a homogeneous population with approximately 90 Å diameter. In order to allow comparative studies, enzymatic and inhibitory assays were performed for SmDHODH as well as for the human homologous enzyme (HsDHODH). The results suggest that for both enzymes the optimum pH for the enzymatic reaction is found in the range of 8.0 and 8.5. The enzymatic assay developed for this class of enzymes allowed the characterization of the kinetic parameters KM and kcat for both enzymes, as well as the performance of inhibitory assays in the presence of synthetic and natural ligands. The inhibition tests allowed us the identification of chemical compounds that inhibit SmDHODH in the range of 794 ? 3 ?M to 19.1 ? 0.1 nM and HsDHODH in the range of 33.9 ? 0.1 ?M a 37.2 ? 0.1 nM. The results of this work, together with structural studies currently in progress in our laboratory will be exploited for the complete characterization of the iv enzyme, as well as for the development of specific inhibitors of SmDHODH, as an important tool in the fight against schistosomiasis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T18:50:37Z : No. of bitstreams: 1 merheb_cw_me_sjrp.pdf: 779308 bytes, checksum: 56b2af8c47fcea8212c7f1e3701d897d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Proteases constituem um dos grupos mais importantes de enzimas industriais, sendo o setor alimentício um dos que mais as utilizam, pois atuam sobre proteínas. Este trabalho teve como objetivo produzir, purificar e caracterizar a protease do fungo termofílico Thermoascus aurantiacus. A produção foi em fermentação em estado sólido e o extrato enzimático bruto foi caracterizado. A atividade de protease, no extrato enzimático bruto, foi inibida por ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (60,61%) e por fluoreto fenimetilsulfonil (PMSF) (56,37%) e foi levemente estimulada por Ca2+. Seu padrão de ação hidrolítico sobre a caseína foi estudado por UREA-PAGE, mostrando diferença significativa em relação a uma renina microbiana recombinante. O extrato enzimático bruto foi purificado através de precipitação com álcool a 72% seguido de cromatografias em resinas Sephadex G75 e Sephacryl S100. Apresentou rendimento de 0,4% e um fator de purificação de 80 vezes. A massa molecular de 24,5 KDa foi estimada por SDS-PAGE. A protease pura apresentou inibição somente por EDTA (96,70%) e ativação por sulfato ferroso, revelando-se uma metaloprotease ativada por ferro. O pH ótimo foi 5,5; a temperatura ótima foi 75°C e foi termoestável a 65°C por 1 hora retendo mais de 70% de atividade original. Apresentou aumento de 151,0% de atividade na presença de Tween-20 e, através dos estudos de cinética enzimática, hidrolisou melhor a caseína do que a azocaseína. / Proteases are a very important group of industrial enzymes, and are most employed in the food segment due to their action on proteins. This work had the aim to produce, purify and characterize the protease from the thermophilic Thermoascus aurantiacus. The production was carried out in solid state fermentation and the crude enzymatic extract was characterized. The proteolytic activity, in the crude extract, was inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) (60.61%) and by phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF) (56.37%) and was slightly stimulated by Ca2+. Its hydrolytic action profile on casein was studied by UREA-PAGE, showing significant difference when compared to a recombinant microbial rennet. The crude enzymatic extract was purified through precipitation with ethanol at 72% followed by cromatographies in columns of Sephadex G75 and Sephacryl S100. It was purified 80-fold and exhibited recovery of total activity of 0.4%. SDS-PAGE analysis indicated an estimated molecular mass of 24.5 KDa. The purified protease was only inhibited by EDTA (96.70%) and stimulated by Fe2+ revealing to be a metalloprotease activated by iron. The optimum pH was 5.5, optimum temperature was 75°C and it was thermostable at 65°C for 1 hour maintaining more then 70% of original activity. It showed increase of 151.0% in activity in the presence of Tween-20 and, through enzyme kinetics studies, better hydrolyzed casein than azocasein.

LUTIF, Camila Castro. Caracterização bioquímica e avaliação das atividades citotóxica e alergênica de uma proteína transferidora de lipídeos isolada de sementes de Morinda citrifolia L. (Rubiaceae). 2015. 121 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-18T20:44:02Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_cclutif.pdf: 2310338 bytes, checksum: 8a82cd88a2632e2362b0397b8d7fb306 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-04-28T20:36:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_cclutif.pdf: 2310338 bytes, checksum: 8a82cd88a2632e2362b0397b8d7fb306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:36:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_cclutif.pdf: 2310338 bytes, checksum: 8a82cd88a2632e2362b0397b8d7fb306 (MD5) Previous issue date: 2015 / This work reports the biochemical characterization, cytotoxic and allergenic effects of a lipid transfer protein isolated from M. citrifolia seeds (McLTP1), with trypsin and alpha-amylase inhibition properties. McLTP1 was purified with a procedure involving trichloroacetic acid precipitation and gel filtration chromatography. This protein showed significant inhibitory activities against trypsin (767,10 ± 8,36 TIU/mgP), chymotrypsin (25,36 ± 0,86 IU/mgP), papain (65,419 ± 0,152 IU/mgP) and alpha-amylase (24,40%). Atomic force microscopy displayed that McLTP1 oligomerized in tetramers showing a central channel. Fluorescence and CD assays revealed that the McLTP1 structure is highly stable, regardless of pH and temperature levels. In vitro, McLTP1 presented a selective cytotoxic effect to human ovarian cancer cells (OVCAR-8; IC50 of 16,6 μg/mL) and demonstrated hemolytic effect against fresh rabbit red blood cels. Similarly to other non-specific lipid transfer protein reported, McLTP1 showed allergenic properties in mice, being considered as a true food allergen since it was able to sensitize the animals via the gastrointestinal tract. / Morinda citrifolia L. é uma espécie nativa do Sudeste da Ásia intensamente investigada em função de suas propriedades terapêuticas reportadas há mais de 2.000 anos. Recentemente, uma proteína transferidora de lipídeos denominada McLTP1 (UniProt Accession Number: C0HJH5) foi isolada de sementes de noni pelo nosso grupo de pesquisa. McLTP1 é uma proteína termoestável de massa molecular 9,4 kDa, resistente à proteólise e dotada de atividades moduladoras da inflamação e da dor pela via oral, promissoras e inéditas para esse grupo de moléculas. Este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente McLTP1, bem como avaliar o seu potencial alergênico em camundongos, como etapas básicas para o seu uso racional e seguro do ponto de vista farmacológico. Em adição, as propriedades terapêuticas de McLTP1 foram também ampliadas, através da investigação de seu efeito citotóxico em diferentes linhagens de células tumorais. A proteína em estudo foi isolada utilizando o protocolo já estabelecido, envolvendo as etapas de precipitação seletiva de proteínas do extrato total das sementes de noni com ácido tricloroacético 2,5% e cromatografia de exclusão molecular. O ensaio de alergenicidade in vivo foi conduzido após prévia aprovação pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da Universidade Federal do Ceará e utilizou fêmeas nulíparas com massa corporal entre 25 e 30 g. McLTP1 apresentou in vitro atividades inibitórias de tripsina (767,10 ± 8,36 UIT/mgP), quimotripsina (25,36 ± 0,86 UI/mgP), papaína (65,419 ± 0,152 UI/mgP) e alfa-amilase (24,40%). A atividade inibitória de tripsina de McLTP1 foi reduzida significativamente em temperaturas superiores a 37 ºC, apresentando atividade residual de apenas 5,91% quando aquecida a 100 ºC por 30 min. Essa atividade foi também influenciada pelo pH, sendo de apenas 30,13% e 39,05% quando a proteína foi incubada em tampões de pH 3,0 e 12,0. O padrão de oligomerização de McLTP1 demonstrou a formação de agregados diméricos/tetraméricos delimitando um canal central de diâmetro de 4,4 nm. As análises espectroscópicas mostraram que McLTP1 apresenta espectro de CD similar àquele apresentado por outras proteínas transferidoras de lipídeos e característico de proteínas ricas em alfa-hélice. Espectro de CD de McLTP1 não mostrou alterações significativas em diferentes temperaturas e pHs, corroborando com os dados de estabilidade obtidos anteriormente. Diferentemente, em condições redutoras (DTT 1 mM) o espectro de CD mostrou alteração na estrutura secundária da proteína e os mínimos e máximos de elipticidade molar foram também alterados na presença de micelas iônicas de SDS (10 mM). McLTP1 apresentou atividade citotóxica seletiva contra células de câncer de ovário (Ovcar-8; CI50: 16,6 μg/mL), não sendo citotóxica para as células tumorais de cólon humano (HCT-116), leucemia humano (HL-60) e glioblastoma humano (SF-295) testadas. McLTP1 foi capaz de promover hemólise significativa em hemácias de coelho a partir da concentração de 0,005 mgP/mL. McLTP1 apresentou potencial efeito alergênico in silico e em camundongos imunizados pela via oral, induzindo a síntese de anticorpos IgG e IgG1. Tal como descrito na literatura para outras LTPs, anticorpos anti-McLTP1 produzidos em coelho foram também capazes de reconhecer proteínas presentes em extratos de Rosaceae, Cucurbitaceae e na polpa do fruto de noni. Os dados obtidos permitiram caracterizar parcialmente a proteína em estudo, bem como avaliar o seu potencial imunogênico após administração oral. Novos testes serão conduzidos objetivando avaliar a importância clínica dessas respostas, uma vez que testes de toxicidade demonstraram que McLTP1 não foi capaz de promover reações adversas em camundongos, mesmo após administração da dose de 8 mg/kg por 28 dias.

Dissertação(mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande, Programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, Escola de Química e Alimentos, 2010. / Submitted by Caroline Silva (krol_bilhar@hotmail.com) on 2012-08-19T20:54:12Z No. of bitstreams: 1 dissertao -fernanda pagnussatt.pdf: 1418590 bytes, checksum: 8967b30d06e7a8e26859db843f84ec54 (MD5) / Approved for entry into archive by Bruna Vieira(bruninha_vieira@ibest.com.br) on 2012-12-06T18:47:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertao -fernanda pagnussatt.pdf: 1418590 bytes, checksum: 8967b30d06e7a8e26859db843f84ec54 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-06T18:47:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertao -fernanda pagnussatt.pdf: 1418590 bytes, checksum: 8967b30d06e7a8e26859db843f84ec54 (MD5) Previous issue date: 2010 / Os cereais são fontes de inibidores enzimáticos que agem sobre a α-amilase, alterando a disponibilidade do amido e podem representar uma ferramenta útil para a resistência dos vegetais ao ataque de patógenos. O objetivo do trabalho foi estudar a presença de inibidores enzimáticos em cereais e avaliar sua relação com a susceptibilidade à contaminação fúngica. Amostras de grãos de aveia (UPFA 20 Teixeirinha, UPFA 22 Temprana e UPFA Pampa), trigo (Safira, Ônix e Pampeano) e arroz (BR 410, BR 417 e BR 424) foram moídas,peneiradas e caracterizadas físico-quimicamente. A melhor condição para a extração de inibidores enzimáticos da aveia e trigo foi obtida ao utilizar o sistema de extração etanol 70 % e 12 horas de agitação, com inibição da amilase fúngica em torno de 90 %. Nas cultivares de arroz, o extrato bruto inibiu 96 % da ação da enzima amilase em ensaios in vitro, quando se empregou como extrator etanol 95 % e 7 h de extração. A enzima Fungamyl®, com atividade específica de 20 mg de amido hidrolisado mL-1 mg proteína-1 foi caracterizada bioquimicamente para fornecer os parâmetros necessários para avaliação da presença de inibidores nos extratos. As propriedades antifúngicas desses extratos inibidores foram testadas pelo método de ágar diluído, utilizando como resposta o teor de glucosamina dos fungos. Durante os 14 dias de incubação do Fusarium graminearum as maiores inibições de crescimento fúngico foram alcançadas em presença dos extratos de aveia e de trigo. A próxima etapa será a purificação dos inibidores nas cultivares mais promissoras para aplicar o conhecimento em programas genéticos capazes de aumentar a resistência desses grãos a determinados fungos ou extraí-los para a preservação em conservação de alimentos. / Cereals are sources of enzymatic inhibitors which act upon alpha-amylase disturbing starch availability, generating a higher resistance to the attack of pathogens. This work aim was to study the presence of enzymatic inhibitors in cereals and evaluate its relation with fungi contamination susceptibility. Samples of oat (UPFA 20 Teixeirinha, UPFA 22 Temprana e UPFA Pampa), wheat (Safira, Ônix e Pampeano) and rice (BR 410, BR 417 e BR 424) were milled, homogenized and then its physicochemical properties were analyzed. The best conditions for extraction enzymatic inhibitors of wheat and oat was ethanol 70%, 12 hours of agitation which obtained an inhibition of fungal amylase of 90%. Rice crude extract varieties obtained a 96% of enzymatic amylase inhibition during in vitro tests, when extraction contained 95% of ethanol and 7 h agitation. The enzyme Fungamyl®, which specific activity of 20 mg protein mL-1 mg-1 of hydrolyzed starch, was biochemically characterized to establish the necessary parameters to research inhibitors activity. Antifungal properties from the extracts were analyzed utilizing the diluted agar method, the response was measure through the level of glucosamine produce by the fungi. During 14 days of incubation Fusarium graminearum inhibition was greater in the oat and wheat extracts presence. The next stage it’s to purify of the inhibitors on the cultivars most promising to apply this knowledge to genetic databases that are capable to enhance the resistence of grains to certain species of fungi or extract them for preservation in foods.