Orientadores: Eneida de Paula, Cleyton Crepaldi Domingues / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T17:11:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Casadei_BrunaRenata_M.pdf: 5692711 bytes, checksum: 9dcfea152b622eb3bd7d81b793794e3e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A visão atual sobre membranas biológicas abarca descrições cada vez mais complexas devido, principalmente, à descoberta de novos papéis atribuídos aos lipídios e sua heterogeneidade. Em particular a associação de esfingolipídios e colesterol, acrescida de proteínas específicas, constitui a base da formação de domínios membranares conhecidos como lipid rafts. Rafts são microdomínios funcionais de biomembranas e estão envolvidos em diversos processos biológicos como reconhecimento celular, endocitose, transdução de sinal, entre outros processos. Uma estratégia experimental para estudar esses domínios é a preparação de frações de membrana parcialmente resistentes ao tratamento com detergentes, a baixa temperatura (4°C). Neste trabalho demonstramos pela primeira vez o preparo e caracterização de frações resistentes a detergente (DRMs) extraídas de membranas de eritrócito humano, a partir do tratamento com os detergentes não iônicos polioxietileno 20-oleil éter (Brij 98) e polioxietileno 20-cetil éter (Brij 58), seguida de separação por ultracentrifugação em gradiente de sacarose. Essas DRMs foram obtidas a 4°C e 37°C, a partir de membranas intactas e com conteúdo reduzido de colesterol (após tratamento com metil-beta-ciclodextrina) e foram comparadas com DRMs de Triton X-100 (TX-100) em relação ao tamanho, conteúdo proteico e lipídico e grau de organização da bicamada. As frações de DRM de Brij mostraram-se enriquecidas em colesterol e fosfolipídios com ácidos graxos de cadeia saturada (em especial ácido lignocérico das esfingomielinas), características consistentes com lipid rafts. No entanto, DRMs de TX-100 apresentaram maior proporção de esfingomielinas/glicerofosfolipídios que as frações obtidas com Brij, além de menor proporção de fosfatidiletanolamina, um lipídio preferencial da monocamada interna da membrana de eritrócitos. Em relação à solubilização proteica, a membrana do eritrócito foi mais resistente ao tratamento com Brij 98 do que aos outros dois detergentes. Flotilina-2 e estomatina foram encontradas nas frações de DRMs de Brij 98 e Brij 58, porém a redução do conteúdo de colesterol da membrana eritrocitária resultou numa menor associação da flotilina-2 àquelas DRMs. Resultados de Ressonância Paramagnética Eletrônica, com uso de marcadores de spin do tipo doxil-estearato não acusaram variação significativa no grau de empacotamento dos lipídios nas bicamadas de DRMs de Brij 98 e Brij 58 em relação à membrana eritrocitária, diferentemente do observado em DRMs de TX-100 e do que seria esperado para domínios lipídicos na fase líquido-ordenada. Em conclusão, DRMs de eritrócitos humanos, com características compatíveis aos domínios funcionais de biomembranas (rafts), foram obtidas tanto a 4ºC quanto a 37ºC; essas frações resistentes aos Brij apresentaram tamanho, composição proteica e lipídica e grau de empacotamento da bicamada diferente das DRMs de TX-100, indicando um processo de extração diferencial dos componentes da membrana eritrocitária induzida por esses detergentes / Abstract: Depiction of biological membranes has been turning more and more complex lately due to the new roles assigned to their lipid components and their heterogeneity. The association between sphingolipids and cholesterol is the basis of lipid rafts formation. Rafts are functional microdomains of biological membranes which have been associated to different biological processes such as cellular recognition, endocytosis and signal transduction, among others. An useful experimental approach to study lipid rafts is the preparation of membrane fractions partially resistant to detergents under low temperature (4ºC). In this work we report the isolation of detergent resistant membranes (DRMs) from human erythrocytes treated with the non-ionic detergents polioxyethylene 20-oleoyl ether (Brij 98) and polioxyethylene 20-cetyl ether (Brij 58) followed by sucrose gradient ultracentrifugation. Such DRMs were obtained at 4°C and 37°C, from cholesterol-depleted (treated with methyl-beta-cyclodextrin) and intact erythrocyte membranes and they compared to DRMs obtained with Triton X-100 (TX-100) regarding the size, protein and lipid content and membrane fluidity. Brij DRMs were found to be enriched in cholesterol and phospholipids containing saturated fatty acids (especially those from sphingomyelin), features commonly associated to lipid rafts. Nevertheless, TX-100 DRMs presented higher sphingomyelin/phospholipid ratios and lower phosphatidylethanolamine content (a glycerophospholipid mainly present in the inner leaflet) than the Brij's. As for protein solubilization, erythrocyte membranes were more resistant to Brij 98 than to the other two detergents. Flotillin-2 and stomatin were found in both Brij 98 and Brij 8 DRMs. However, flotillin-2 was partially solubilized when DRMs were prepared from cholesterol-depleted erythrocyte membrane. Electron paramagnetic resonance experiments, with doxyl stearic acid spin labels incorporated in the DRMs showed no significant changes in the bilayer compactness of Brij 98 and 58 DRMs in comparison to intact membrane, a unexpected result for lipid domains existing in a liquid-ordered phase, and in contrast to results previously observed with TX-100 DRMs. Altogether, these results show the isolation of DRMs from human erythrocytes treated with Brij 98 and Brij 58 at low (4°C) and physiological temperature (37°C). These detergent-resistant membrane fractions, obtained with Brij 98 and 58 presented some lipid rafts features, although with differences in protein and lipid contents, size and membrane fluidity in comparison to TX-100 DRMs. Besides, these results suggest that TX-100, Brij 98 and Brij 58 induced a different solubilization process on the erythrocyte membrane / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-03-25 / As membranas biológicas são formadas por uma mistura de várias classes de lipídeos, cujo empacotamento preferencial entre esfingolipídeos e esteróis formam junto com proteínas específicas, esta complexa organização conhecida como microdomínios de membrana. Com o intuito de verificar a presença de microdomínios de membrana em leveduras de fungos patogênicos como Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma capsulatum, as leveduras desses dois fungos foram lisadas com pérolas de vidro e incubadas com Brij 98 a 4°C. As frações de microdomínios de membrana foram separadas por ultracentrifugação em gradiente de sacarose e, seus componentes analisados por HPTLC, SDS-PAGE e “Western blotting”. As análises dos lipídeos de membrana mostram que aproximadamente 40% do ergosterol das duas espécies de leveduras analisadas estão presentes nos microdomínios de membrana. Enquanto as porcentagens de glicoesfingolipídeos presentes nessas frações correspondem a 42% e 25%, em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. Em conjunto com as análises lipídicas, verificou-se nas duas espécies, um enriquecimento protéico nas frações de microdomínios de membrana, entre estas proteínas podemos citar a Pma1p, uma proteína marcadora de microdomínios de fungos, e uma proteína de 30 kDa, capaz de se ligar a laminina. Para determinar a importância do ergosterol na manutenção da integridade dos microdomínios de membrana utilizou-se metil-beta-ciclodextrina (mβCD), que é capaz de complexar e retirar o ergosterol. Após o tratamento das leveduras com mβCD verificou-se a extração dos esteróis numa proporção de 80% e 70% para P. brasiliensis e H. capsulatum, respectivamente. No entanto, o perfil de distribuição dos glicoesfingolipídeos e fosfolipídeos, analisados por HPTLC, não apresentou mudanças significativas após o tratamento com a mβCD. As análises protéicas demonstraram o deslocamento de algumas proteínas para frações solúveis do gradiente de sacarose como Pma1p e uma proteína de 30 kDa. Por outro lado, a marcação com o anticorpo anti-α5-integrina mostra a presença de uma proteína de 50 kDa nos microdomínios de membrana, mesmo após o tratamento com a mβCD, sugerindo a existência de uma população de microdomínios de membrana que não depende do ergosterol para manutenção de sua integridade. A importância desses microdomínios de membrana foi testada na infectividade de macrófagos alveolares, onde uma redução de 53% na infectividade de macrófagos foi verificada após o tratamento das leveduras de H. capsulatum com mβCD. Os resultados apresentados nessa tese demonstram a existência de microdomínios de membrana em leveduras de P. brasiliensis e H. capsulatum, bem como sua importância para a interação levedura-macrófago. / Biological membranes are constituted by a mixture of several classes of lipids. In this enviroment, sphingolipids and sterols pack tightly to form together with specific proteins a complex membrane organization known as membrane microdomains. In order to detect the presence of membrane microdomains in yeast forms of pathogenic fungi, such as Paracoccidioides brasiliensis and Histoplasma capsulatum, yeast forms of both fungi were lysed by vortexing with glass beads and then incubated with Brij 98 at 4ºC. Fractions containing membrane microdomains were isolated by ultracentrifugation on sucrose gradient, and their components were analyzed by HPTLC, SDSPAGE and Western blotting. Analysis of membrane lipids showed that about 40% of ergosterol from both P. brasiliensis and H. capsulatum was present in the membrane microdomains, whereas the percentage of glycosphingolipids present in P. brasiliensis and H. capsulatum was 42% and 25%, respectively. Analysis by SDS-PAGE and Western blotting clearly showed a protein enrichment in the membrane microdomains fraction of both fungi. It is noteworthy the presence of Pma1p, a fungal microdomain marker, and also the presence of a 30 kDa (glyco)protein which binds to laminin. To investigate the requirement of ergosterol to mantain the integrity of membrane microdomains, it was used methylbeta- cyclodextrin (mβCD) an agent able to efficiently extract membrane sterols. After treatment of yeasts using mβCD, it was observed the removal of 80% and 70% of ergosterol in P. brasiliensis and H. capsulatum, respectively. After treatment with mβCD it was observed a shift of 25% of the glycosphingolipids from the insoluble to the soluble fraction, conversely the distribution profile of phospholipids remained unmodified after treatment with mβCD. The protein analysis showed the displacement of a few proteins to soluble fractions of the sucrose gradient, such as Pma1p and the (glyco)protein of 30 kDa. On the other hand, using an anti-α5-integrin antibody it was detected, even after the mβCD treatment, the presence of a 50 kDa protein in membrane microdomains, suggesting the existence of microdomains that do not depend on ergosterol for their integrity. These data strongly suggest the existence of two population of microdomains: i) dependent of ergosterol for integrity maintenance of microdomains and ii) microdomains non-dependent of ergosterol for the maintenance of their functional role. Furthermore, the biological importance of membrane microdomains was clearly demonstrated by a 53% reduction of infectivity of alveolar macrophage infectivity when yeast forms of H. capsulatum were treated with mβCD. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por perda da memória e das demais funções cognitivas. Sua patogenia envolve a produção do peptídeo β-amiloide (Aβ), através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) por β- e γ-secretases (amiloidogênese), e a posterior agregação do Aβ em oligômeros e/ou fibrilas. A toxicidade do Aβ tem sido associada a diversos mecanismos, a incluir desde seu efeito oxidante e inflamatório, até sua propriedade de induzir necrose por ruptura das membranas neurais, ou apoptose via ativação de cascatas sinalizatórias. Como etapa comum a estes mecanismos de toxicidade, a interação do peptídeo com membranas neurais, em particular com o gangliosídio GM1 (constituinte dos rafts), parece ser indispensável ao dano neural associado ao peptídeo, bem como à ativação da cascata amiloide que caracteriza o ciclo patológico Aβ-amiloidogênese. O GM1 é um gangliosídio de membrana que, quando administrado exogenamente, apresenta propriedades neurotróficas e neuroprotetoras, inclusive em modelos de DA. Os mecanismos envolvidos nesta neuroproteção, no entanto, ainda precisam ser melhor elucidados. Com isto, o objetivo da presente tese foi avaliar o potencial efeito neuroprotetor do GM1 em modelo in vivo e in vitro de toxicidade do Aβ1-42 fibrilado, e propor mecanismos para esta neuroproteção. Inicialmente, demonstramos que o GM1 (0,30 mg/kg), quando co-administrado (icv) com Aβ (2 nmol) previne o déficit cognitivo induzido pelo peptídeo (teste de reconhecimento de objetos), bem como a redução na atividade da Na+,K+-ATPase (enzima envolvida na regulação da transmissão sináptica) no hipocampo de ratos Wistar machos. Demonstrou-se, além disso, que este efeito neuroprotetor do GM1 é acompanhado de aumento nas defesas antioxidantes, em córtex e hipocampo (TRAP). Como a toxicidade do Aβ e a modulação da amiloidogênese parecem ser dependentes de alterações na estrutura dos microdomínios de membrana (rafts), investigamos o efeito da injeção (icv) de Aβ e do tratamento (icv) com GM1 sobre a integridade dos rafts e sobre a distribuição das proteínas APP e BACE1 (β-secretase) nestes microdomínios. Observamos que o Aβ promoveu um desmonte parcial nos rafts, acompanhado de um aumento na distribuição de APP e BACE1 nestes microdomínios, efeitos estes que foram prevenidos pelo tratamento com GM1. Em virtude de os rafts modularem diversas funções neurais, e de a co-localização de APP e BACE1 nos rafts ser um evento necessário a amiloidogênese, os resultados aqui obtidos, reforçam a ideia de que o GM1 exerça sua função neuroprotetora ao preservar a arquitetura das membranas e que o mesmo poderia frear a ativação da amiloidogênese induzida pelo Aβ, ao prevenir a redistribuição das proteínas APP e BACE1 aos rafts lipídicos. A fim de avaliar a atividade neuroprotetora do GM1 em modelo in vitro da DA, e de investigar a sua propriedade de interagir com o Aβ impedindo a interação deste às membranas neurais, avaliamos o efeito da incubação de GM1 (10, 20 e 30μM) frente à toxicidade do Aβ (0,5μM) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como, verificamos o efeito de uma prévia incubação Aβ-GM1 (in vitro) sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo. Como resultado, observamos que o GM1 promoveu neuroproteção nas três concentrações testadas e que esta neuroproteção foi, pelo menos parcialmente, mediada por sua capacidade de interagir in vitro com o Aβ. Nossos dados, em conjunto, reforçam as evidências que apontam o GM1 como uma potencial droga neuroprotetora em modelos de DA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of memory and impairment of other cognitive functions. Its pathogenesis involves the production of β-amyloid peptide (Aβ) by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases (amyloidogenesis) and the subsequent aggregation of Aβ into oligomers and/or fibrils. Aβ toxicity has been associated with several mechanisms, ranging from its oxidant and inflammatory effects until their property to induce necrosis by neural membrane rupture, or apoptosis via activation of signaling cascades. As a common step to these toxicity mechanisms, the peptide interaction with neural membranes, particularly with GM1 ganglioside (component of membrane rafts), seems to be pivotal to the peptide induced neural damage, as well as the amyloid cascade activation that characterizes the pathological vicious cycle Aβ- amyloidogenesis. GM1 is a membrane ganglioside provided of neurotrophic and neuroprotective properties in AD models, when exogenously administered. The mechanisms of neuroprotection, however, need to be further elucidated. By this way, the aim of this PhD thesis was to evaluate the potential neuroprotective effect of GM1 in in vivo and in vitro models of fibrilar Aβ1-42 toxicity, and to propose mechanisms for this neuroprotection. Initially, we demonstrated that GM1 (0.30 mg/kg.), when co-administered (icv) with Aβ (2nmol), prevents the peptide induced cognitive deficit (object recognition task), as well as Aβ induced reduction in Na+,K+-ATPase activity (a enzyme involved in synaptic transmission regulation) in the hippocampus from male Wistar rats. We have shown, furthermore, that this neuroprotective effect of GM1 is accompanied by an increase in antioxidant defenses in the cortex and hippocampus (TRAP). As Aβ toxicity, as well as the modulation of amyloidogenesis, appear to be dependent on changes in the structure of membrane microdomains (rafts), we have investigated the effect of Aβ icv injection and GM1icv treatment on raft integrity and on the distribution of APP and BACE1 (β- secretase) proteins in these microdomains. As result, Aβ promoted a partial raft disassemble, accompanied by an increase in the distribution of APP and BACE1 to these microdomains, effects that were prevented by GM1 treatment. Considering that rafts modulate several neural functions, and that APP and BACE1 co-localization into lipid rafts is pivotal to amyloidogenesis, our results reinforce the idea that GM1 neuroprotection is mediated by membrane architecture preservation, and that GM1 treatment could slow down the Aβ induced activation of amyloidogenesis, by prevention of APP and BACE1 redistribution into lipid rafts. In order to evaluate the GM1 neuroprotective activity in an in vitro AD model, and to investigate GM1 property of interacting with Aβ and preventing its interaction with neuronal membranes, we evaluated GM1 (10, 20 and 30μM) effect against Aβ (0,5 μM)-induced toxicity in SHSY5Y human neuroblastoma cells, as well as, we verified the effect of a Aβ-GM1 in vitro preincubation on the peptide-induced toxicity. As our results indicate, the three tested GM1 concentrations promoted neuroprotection and this effect was, at least partially, mediated by its ability to in vitro interact with Aβ peptide. Our data, when taken together, reinforce the evidence suggesting GM1 as a potential neuroprotective drug in AD models.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por perda da memória e das demais funções cognitivas. Sua patogenia envolve a produção do peptídeo β-amiloide (Aβ), através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) por β- e γ-secretases (amiloidogênese), e a posterior agregação do Aβ em oligômeros e/ou fibrilas. A toxicidade do Aβ tem sido associada a diversos mecanismos, a incluir desde seu efeito oxidante e inflamatório, até sua propriedade de induzir necrose por ruptura das membranas neurais, ou apoptose via ativação de cascatas sinalizatórias. Como etapa comum a estes mecanismos de toxicidade, a interação do peptídeo com membranas neurais, em particular com o gangliosídio GM1 (constituinte dos rafts), parece ser indispensável ao dano neural associado ao peptídeo, bem como à ativação da cascata amiloide que caracteriza o ciclo patológico Aβ-amiloidogênese. O GM1 é um gangliosídio de membrana que, quando administrado exogenamente, apresenta propriedades neurotróficas e neuroprotetoras, inclusive em modelos de DA. Os mecanismos envolvidos nesta neuroproteção, no entanto, ainda precisam ser melhor elucidados. Com isto, o objetivo da presente tese foi avaliar o potencial efeito neuroprotetor do GM1 em modelo in vivo e in vitro de toxicidade do Aβ1-42 fibrilado, e propor mecanismos para esta neuroproteção. Inicialmente, demonstramos que o GM1 (0,30 mg/kg), quando co-administrado (icv) com Aβ (2 nmol) previne o déficit cognitivo induzido pelo peptídeo (teste de reconhecimento de objetos), bem como a redução na atividade da Na+,K+-ATPase (enzima envolvida na regulação da transmissão sináptica) no hipocampo de ratos Wistar machos. Demonstrou-se, além disso, que este efeito neuroprotetor do GM1 é acompanhado de aumento nas defesas antioxidantes, em córtex e hipocampo (TRAP). Como a toxicidade do Aβ e a modulação da amiloidogênese parecem ser dependentes de alterações na estrutura dos microdomínios de membrana (rafts), investigamos o efeito da injeção (icv) de Aβ e do tratamento (icv) com GM1 sobre a integridade dos rafts e sobre a distribuição das proteínas APP e BACE1 (β-secretase) nestes microdomínios. Observamos que o Aβ promoveu um desmonte parcial nos rafts, acompanhado de um aumento na distribuição de APP e BACE1 nestes microdomínios, efeitos estes que foram prevenidos pelo tratamento com GM1. Em virtude de os rafts modularem diversas funções neurais, e de a co-localização de APP e BACE1 nos rafts ser um evento necessário a amiloidogênese, os resultados aqui obtidos, reforçam a ideia de que o GM1 exerça sua função neuroprotetora ao preservar a arquitetura das membranas e que o mesmo poderia frear a ativação da amiloidogênese induzida pelo Aβ, ao prevenir a redistribuição das proteínas APP e BACE1 aos rafts lipídicos. A fim de avaliar a atividade neuroprotetora do GM1 em modelo in vitro da DA, e de investigar a sua propriedade de interagir com o Aβ impedindo a interação deste às membranas neurais, avaliamos o efeito da incubação de GM1 (10, 20 e 30μM) frente à toxicidade do Aβ (0,5μM) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como, verificamos o efeito de uma prévia incubação Aβ-GM1 (in vitro) sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo. Como resultado, observamos que o GM1 promoveu neuroproteção nas três concentrações testadas e que esta neuroproteção foi, pelo menos parcialmente, mediada por sua capacidade de interagir in vitro com o Aβ. Nossos dados, em conjunto, reforçam as evidências que apontam o GM1 como uma potencial droga neuroprotetora em modelos de DA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of memory and impairment of other cognitive functions. Its pathogenesis involves the production of β-amyloid peptide (Aβ) by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases (amyloidogenesis) and the subsequent aggregation of Aβ into oligomers and/or fibrils. Aβ toxicity has been associated with several mechanisms, ranging from its oxidant and inflammatory effects until their property to induce necrosis by neural membrane rupture, or apoptosis via activation of signaling cascades. As a common step to these toxicity mechanisms, the peptide interaction with neural membranes, particularly with GM1 ganglioside (component of membrane rafts), seems to be pivotal to the peptide induced neural damage, as well as the amyloid cascade activation that characterizes the pathological vicious cycle Aβ- amyloidogenesis. GM1 is a membrane ganglioside provided of neurotrophic and neuroprotective properties in AD models, when exogenously administered. The mechanisms of neuroprotection, however, need to be further elucidated. By this way, the aim of this PhD thesis was to evaluate the potential neuroprotective effect of GM1 in in vivo and in vitro models of fibrilar Aβ1-42 toxicity, and to propose mechanisms for this neuroprotection. Initially, we demonstrated that GM1 (0.30 mg/kg.), when co-administered (icv) with Aβ (2nmol), prevents the peptide induced cognitive deficit (object recognition task), as well as Aβ induced reduction in Na+,K+-ATPase activity (a enzyme involved in synaptic transmission regulation) in the hippocampus from male Wistar rats. We have shown, furthermore, that this neuroprotective effect of GM1 is accompanied by an increase in antioxidant defenses in the cortex and hippocampus (TRAP). As Aβ toxicity, as well as the modulation of amyloidogenesis, appear to be dependent on changes in the structure of membrane microdomains (rafts), we have investigated the effect of Aβ icv injection and GM1icv treatment on raft integrity and on the distribution of APP and BACE1 (β- secretase) proteins in these microdomains. As result, Aβ promoted a partial raft disassemble, accompanied by an increase in the distribution of APP and BACE1 to these microdomains, effects that were prevented by GM1 treatment. Considering that rafts modulate several neural functions, and that APP and BACE1 co-localization into lipid rafts is pivotal to amyloidogenesis, our results reinforce the idea that GM1 neuroprotection is mediated by membrane architecture preservation, and that GM1 treatment could slow down the Aβ induced activation of amyloidogenesis, by prevention of APP and BACE1 redistribution into lipid rafts. In order to evaluate the GM1 neuroprotective activity in an in vitro AD model, and to investigate GM1 property of interacting with Aβ and preventing its interaction with neuronal membranes, we evaluated GM1 (10, 20 and 30μM) effect against Aβ (0,5 μM)-induced toxicity in SHSY5Y human neuroblastoma cells, as well as, we verified the effect of a Aβ-GM1 in vitro preincubation on the peptide-induced toxicity. As our results indicate, the three tested GM1 concentrations promoted neuroprotection and this effect was, at least partially, mediated by its ability to in vitro interact with Aβ peptide. Our data, when taken together, reinforce the evidence suggesting GM1 as a potential neuroprotective drug in AD models.

A doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por perda da memória e das demais funções cognitivas. Sua patogenia envolve a produção do peptídeo β-amiloide (Aβ), através da clivagem da proteína precursora amiloide (APP) por β- e γ-secretases (amiloidogênese), e a posterior agregação do Aβ em oligômeros e/ou fibrilas. A toxicidade do Aβ tem sido associada a diversos mecanismos, a incluir desde seu efeito oxidante e inflamatório, até sua propriedade de induzir necrose por ruptura das membranas neurais, ou apoptose via ativação de cascatas sinalizatórias. Como etapa comum a estes mecanismos de toxicidade, a interação do peptídeo com membranas neurais, em particular com o gangliosídio GM1 (constituinte dos rafts), parece ser indispensável ao dano neural associado ao peptídeo, bem como à ativação da cascata amiloide que caracteriza o ciclo patológico Aβ-amiloidogênese. O GM1 é um gangliosídio de membrana que, quando administrado exogenamente, apresenta propriedades neurotróficas e neuroprotetoras, inclusive em modelos de DA. Os mecanismos envolvidos nesta neuroproteção, no entanto, ainda precisam ser melhor elucidados. Com isto, o objetivo da presente tese foi avaliar o potencial efeito neuroprotetor do GM1 em modelo in vivo e in vitro de toxicidade do Aβ1-42 fibrilado, e propor mecanismos para esta neuroproteção. Inicialmente, demonstramos que o GM1 (0,30 mg/kg), quando co-administrado (icv) com Aβ (2 nmol) previne o déficit cognitivo induzido pelo peptídeo (teste de reconhecimento de objetos), bem como a redução na atividade da Na+,K+-ATPase (enzima envolvida na regulação da transmissão sináptica) no hipocampo de ratos Wistar machos. Demonstrou-se, além disso, que este efeito neuroprotetor do GM1 é acompanhado de aumento nas defesas antioxidantes, em córtex e hipocampo (TRAP). Como a toxicidade do Aβ e a modulação da amiloidogênese parecem ser dependentes de alterações na estrutura dos microdomínios de membrana (rafts), investigamos o efeito da injeção (icv) de Aβ e do tratamento (icv) com GM1 sobre a integridade dos rafts e sobre a distribuição das proteínas APP e BACE1 (β-secretase) nestes microdomínios. Observamos que o Aβ promoveu um desmonte parcial nos rafts, acompanhado de um aumento na distribuição de APP e BACE1 nestes microdomínios, efeitos estes que foram prevenidos pelo tratamento com GM1. Em virtude de os rafts modularem diversas funções neurais, e de a co-localização de APP e BACE1 nos rafts ser um evento necessário a amiloidogênese, os resultados aqui obtidos, reforçam a ideia de que o GM1 exerça sua função neuroprotetora ao preservar a arquitetura das membranas e que o mesmo poderia frear a ativação da amiloidogênese induzida pelo Aβ, ao prevenir a redistribuição das proteínas APP e BACE1 aos rafts lipídicos. A fim de avaliar a atividade neuroprotetora do GM1 em modelo in vitro da DA, e de investigar a sua propriedade de interagir com o Aβ impedindo a interação deste às membranas neurais, avaliamos o efeito da incubação de GM1 (10, 20 e 30μM) frente à toxicidade do Aβ (0,5μM) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como, verificamos o efeito de uma prévia incubação Aβ-GM1 (in vitro) sobre a toxicidade induzida pelo peptídeo. Como resultado, observamos que o GM1 promoveu neuroproteção nas três concentrações testadas e que esta neuroproteção foi, pelo menos parcialmente, mediada por sua capacidade de interagir in vitro com o Aβ. Nossos dados, em conjunto, reforçam as evidências que apontam o GM1 como uma potencial droga neuroprotetora em modelos de DA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a loss of memory and impairment of other cognitive functions. Its pathogenesis involves the production of β-amyloid peptide (Aβ) by cleavage of the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretases (amyloidogenesis) and the subsequent aggregation of Aβ into oligomers and/or fibrils. Aβ toxicity has been associated with several mechanisms, ranging from its oxidant and inflammatory effects until their property to induce necrosis by neural membrane rupture, or apoptosis via activation of signaling cascades. As a common step to these toxicity mechanisms, the peptide interaction with neural membranes, particularly with GM1 ganglioside (component of membrane rafts), seems to be pivotal to the peptide induced neural damage, as well as the amyloid cascade activation that characterizes the pathological vicious cycle Aβ- amyloidogenesis. GM1 is a membrane ganglioside provided of neurotrophic and neuroprotective properties in AD models, when exogenously administered. The mechanisms of neuroprotection, however, need to be further elucidated. By this way, the aim of this PhD thesis was to evaluate the potential neuroprotective effect of GM1 in in vivo and in vitro models of fibrilar Aβ1-42 toxicity, and to propose mechanisms for this neuroprotection. Initially, we demonstrated that GM1 (0.30 mg/kg.), when co-administered (icv) with Aβ (2nmol), prevents the peptide induced cognitive deficit (object recognition task), as well as Aβ induced reduction in Na+,K+-ATPase activity (a enzyme involved in synaptic transmission regulation) in the hippocampus from male Wistar rats. We have shown, furthermore, that this neuroprotective effect of GM1 is accompanied by an increase in antioxidant defenses in the cortex and hippocampus (TRAP). As Aβ toxicity, as well as the modulation of amyloidogenesis, appear to be dependent on changes in the structure of membrane microdomains (rafts), we have investigated the effect of Aβ icv injection and GM1icv treatment on raft integrity and on the distribution of APP and BACE1 (β- secretase) proteins in these microdomains. As result, Aβ promoted a partial raft disassemble, accompanied by an increase in the distribution of APP and BACE1 to these microdomains, effects that were prevented by GM1 treatment. Considering that rafts modulate several neural functions, and that APP and BACE1 co-localization into lipid rafts is pivotal to amyloidogenesis, our results reinforce the idea that GM1 neuroprotection is mediated by membrane architecture preservation, and that GM1 treatment could slow down the Aβ induced activation of amyloidogenesis, by prevention of APP and BACE1 redistribution into lipid rafts. In order to evaluate the GM1 neuroprotective activity in an in vitro AD model, and to investigate GM1 property of interacting with Aβ and preventing its interaction with neuronal membranes, we evaluated GM1 (10, 20 and 30μM) effect against Aβ (0,5 μM)-induced toxicity in SHSY5Y human neuroblastoma cells, as well as, we verified the effect of a Aβ-GM1 in vitro preincubation on the peptide-induced toxicity. As our results indicate, the three tested GM1 concentrations promoted neuroprotection and this effect was, at least partially, mediated by its ability to in vitro interact with Aβ peptide. Our data, when taken together, reinforce the evidence suggesting GM1 as a potential neuroprotective drug in AD models.

A superexpressão de receptores HER-2 é anormalidade celular de grande relevância clínica no câncer de mama. Ela ocorre em aproximadamente 30% de carcinomas de mama incluindo lesões pré-neoplásicas e malignas, e está associada a prognóstico desfavorável. A hiperativação dos receptores HER-2, consequência natural de sua superexpressão, promove proliferação celular aberrante e tumorigênese. Admite-se que a ativação e envio de sinais via HER-2 possa acontecer quando estes receptores se encontram em compartimentos específicos da membrana celular, os lipid rafts. Assim, um número maior de HER-2 poderia implicar em maior quantidade de lipis rafts. Para testar essa hipótese, usamos modelo de transformação oncogênica que nos permitiu avaliar, especificamente, os efeitos da superexpressão de HER-2 e identificar a quantidade de lipid rafts. Para isso utilizamos a linhagem celular HB4a, derivada de célula epitelial luminal do tecido mamário humano normal com baixa expressão de HER-2; e a linhagem HB4aC5.2, um clone derivado da HB4a, que superexpressa receptores HER-2. Nas células HB4aC5.2, a superexpressão de HER-2 foi acompanhada pelo aumento dos lipid rafts na membrana celular, bem como, hiperativação de sinais de sobrevivência, proliferação (aumento da ativação de proteínas Akt e Erk1/2, respectivamente), e taxa de proliferação celular duas vezes mais rápida que a linhagem normal HB4a. Adicionalmente, a superexpressão de HER-2 foi associada com aumento da lipogênese celular (fenótipo lipogênico), dependente do aumento de ativação da enzima FASN e da superexpressão de DEPTOR. A FASN é responsável pela síntese de palmitato, utilizado para formação de lipid rafts. A superexpressão de DEPTOR, por modular a atividade transcricional de PPAR?, pode evitar a lipotoxicidade do excesso de palmitato. Além disso, DEPTOR, por sua capacidade em reduzir atividade do complexo mTORC1, contribui para sobrevivência celular dependente da proteína Akt. Em continuidade, consideramos, como segunda hipótese, que a desestruturação de lipid rafts poderia influenciar negativamente a ativação dos receptores HER-2. Para isso tratamos, as mesmas linhagens celulares anteriormente descritas, com ácido docosaexaenoico (DHA), um tipo de ácido graxo ômega-3. Nossos resultados mostraram que, nas células HB4aC5.2, o tratamento com DHA desestruturou os lipid rafts, inibiu a sinalização iniciada pelos receptores HER-2 ( diminuição da ativação das proteínas Akt, Erk1/2, FASN, atividade transcricional de PPAR? e expressão de DEPTOR) e reverteu o fenótipo lipogênico. Adiciona-se que essas modificações celulares e moleculares foram acompanhadas por indução significativa de morte e apoptose. As mesmas alterações não foram observadas nas células normais HB4a. Em conclusão, o presente estudo reforça a associação entre a presença de HER-2 e lipid rafts. Adicionalmente aponta que a desestruturação de lipid rafts por DHA reduz a sinalização de HER-2. Por fim, sugere que distúrbios em lipid rafts, induzidos por DHA, possam representar ferramenta útil no controle da sinalização aberrante deflagrada pelos receptores HER-2, e aponta potencial terapêutico na suplementação de DHA para quimioprevenção e tratamento do câncer de mama HER-2 positivo. / HER-2 receptor overexpression is a cellular abnormality of great clinical significance in breast cancer. It is described in approximately 30% of breast carcinomas, including preneoplasic and malignant lesions, and is associated with poor prognosis. Hyperactivation of HER-2 receptors, a natural consequence of its overexpression, promotes aberrant cell proliferation and tumorigenesis. For signal activation and transduction to occur, HER-2 must be localized in specific compartments in the cell membrane: the lipid rafts. Therefore, we hypothesize that a greater number of HER-2 receptors could indicate a greater quantity of lipid rafts. To test this, we used an oncogenic transformation model that specifically allowed assessment of the effects of HER-2 overexpression and identification of the quantity of lipid rafts: an HB4a cell line derived from normal human breast tissue luminal epithelial cells with low HER-2 expression, and an HB4aC5.2 cell line, a clone derived from HB4a that overexpresses HER-2 receptors. In the HB4aC5.2 cells, HER-2 overexpression was accompanied by an increase in lipid rafts in cell membranes as well as hyperactivation of survival signals, proliferation (increased activation of the proteins Akt and ERK1/2, respectively), and an increased rate of proliferation, compared to the normal HB4a line. In addition, HER-2 overexpression was associated with increased cellular lipogenesis (lipogenic phenotype), dependent on the increased activation of the FASN enzyme and the overexpression of DEPTOR. FASN is responsible for the synthesis of palmitate, used to synthesize lipid rafts. Overexpression of DEPTOR by modulating PPAR? transcriptional activity, may avoid lipotoxicity from excess palmitate. Moreover, DEPTOR, with its ability to reduce mTORC1 complex activity, contributes to cell survival dependent on Akt. To continue, we considered as a second hypothesis that the disruption of lipid rafts could negatively influence HER-2 receptor activation. For this, we treated the same cell lines described above with docosahexaenoic acid (DHA), a omega-3 fatty acid. Our results showed that in HB4aC5.2 cells DHA treatment disrupted the lipid rafts, inhibited signaling initiated by HER-2 receptors (reduced activation of Akt, ERK1/2, and FASN proteins, PPAR? transcriptional activity, and DEPTOR expression) and reversed the lipogenic phenotype. In addition, these cellular and molecular changes were accompanied by a significant induction of apoptosis and death. The same changes were not observed in normal HB4a cells. In conclusion, the present study reinforces the association between HER-2 presence and lipid rafts. It also indicates that the disruption of lipid rafts by DHA reduces HER-2 signaling. Finally, it suggests that DHA-induced disturbances in lipid rafts may represent a useful tool in controlling aberrant signaling triggered by HER-2 receptors, and indicate therapeutic potential in DHA supplementation for chemoprevention and treatment of HER-2 positive breast cancer.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-30. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:36Z : No. of bitstreams: 1 Publico-Tese%20Paloma%20Korehiza%20Maza%20versao%20final.pdf: 1568579 bytes, checksum: 8a94eab5c79046acd8162d9a949d2c36 (MD5) / Muitos patógenos são capazes de manipular a sinalização de células do hospedeiro para facilitar sua infecção. Nesta tese, demonstramos que o fungo Paracoccidioides brasiliensis promove um aumento na ativação de ERK1/2 e SFKs em células epiteliais A549 (de pulmão humano), de aproximadamente 6 e 7 vezes, respectivamente, em relação aos níveis basais. Utilizando PP2, inibidor da atividade de SFKs, e PD98059, inibidor da ativação da via ERK1/2, verificamos que a ativação de ERK1/2 é parcialmente dependente de SFKs ativadas e que provavelmente outras quinases também estão envolvidas neste evento. Além da modulação da sinalização de células do hospedeiro, diversos estudos têm demonstrado que patógenos seqüestram domínios presentes nas membranas da célula hospedeira denominados “membrane rafts”, os quais são enriquecidos em esfingolipídeos e colesterol e estão envolvidos em diversos eventos celulares, incluindo a sinalização celular. Por diferentes metodologias, como a desorganização de “membrane rafts” por drogas que extraem (metil-β- ciclodextrina, MβCD) ou que se ligam (nistatina) ao colesterol, e a localização do gangliosídeo GM1, um marcador de “membrane rafts”, utilizando a subunidade B da toxina da cólera (CTB), mostramos o envolvimento destes domínios de membranas de células epiteliais na adesão de P. brasiliensis. A partir do isolamento de membranas resistentes a detergente (DRMs) de células epiteliais após incubação com o fungo, mostramos a ativação e o deslocamento de SFKs para as frações que contêm os “membrane rafts”. Além disso, verificamos que a depleção do colesterol com MβCD inibe completamente a ativação de SFKs, corroborando a importância dos domínios de membranas para a ativação destas quinases. Os resultados apresentados nesta tese demonstram, pela primeira vez, que fungos patogênicos modulam a organização e a atividade de “membrane rafts” de células hospedeiras para o estabelecimento da infecção. / Many pathogens are able to manipulate host cell signaling in order to facilitate infection. In this thesis, we demonstrated that the fungus Paracoccidioides brasiliensis promotes an increase of ERK12 and SFK activation in A549 epithelial cells (human lung cells), by approximately 6- and 7-fold over basal levels, respectively. By using PP2, inhibitor for SFK activity, and PD98059, inhibitor for ERK1/2 activation, we verified that ERK1/2 activation is partially dependent of activated SFKs and probably other kinases are involved in this event. Besides modulation of host cell signaling, several studies have been demonstrated that pathogens hijack domains that are present in host cell membranes called membrane rafts, which are cholesterol- and sphingolipidenriched domains, that are involved in several cell events, including cell signaling. By using several approaches, such as membrane rafts disruption with cholesterolextractor (methyl-β-cyclodextrin, MβCD) or –binding (nystatin) drugs, and the localization of ganglioside GM1, a membrane raft marker, by using cholera toxin subunit B (CTB), we showed the involvement of these epithelial cell membrane domains in P. brasiliensis adhesion. By isolating detergent-resistant membrane (DRM) from epithelial cells after incubation with this fungus, we showed the activation and the dislodgment of SFKs to fractions which contain membrane rafts. Moreover, we verified that cholesteroldepletion with MβCD completely inhibits SFK activation, corroborating the importance of membrane domains in activation of these kinases.The results presented in this thesis demonstrate for the first time that pathogenic fungi may modulate the organization and activity of host cell membrane rafts for infection establishment. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

A superexpressão de receptores HER-2 é anormalidade celular de grande relevância clínica no câncer de mama. Ela ocorre em aproximadamente 30% de carcinomas de mama incluindo lesões pré-neoplásicas e malignas, e está associada a prognóstico desfavorável. A hiperativação dos receptores HER-2, consequência natural de sua superexpressão, promove proliferação celular aberrante e tumorigênese. Admite-se que a ativação e envio de sinais via HER-2 possa acontecer quando estes receptores se encontram em compartimentos específicos da membrana celular, os lipid rafts. Assim, um número maior de HER-2 poderia implicar em maior quantidade de lipis rafts. Para testar essa hipótese, usamos modelo de transformação oncogênica que nos permitiu avaliar, especificamente, os efeitos da superexpressão de HER-2 e identificar a quantidade de lipid rafts. Para isso utilizamos a linhagem celular HB4a, derivada de célula epitelial luminal do tecido mamário humano normal com baixa expressão de HER-2; e a linhagem HB4aC5.2, um clone derivado da HB4a, que superexpressa receptores HER-2. Nas células HB4aC5.2, a superexpressão de HER-2 foi acompanhada pelo aumento dos lipid rafts na membrana celular, bem como, hiperativação de sinais de sobrevivência, proliferação (aumento da ativação de proteínas Akt e Erk1/2, respectivamente), e taxa de proliferação celular duas vezes mais rápida que a linhagem normal HB4a. Adicionalmente, a superexpressão de HER-2 foi associada com aumento da lipogênese celular (fenótipo lipogênico), dependente do aumento de ativação da enzima FASN e da superexpressão de DEPTOR. A FASN é responsável pela síntese de palmitato, utilizado para formação de lipid rafts. A superexpressão de DEPTOR, por modular a atividade transcricional de PPAR?, pode evitar a lipotoxicidade do excesso de palmitato. Além disso, DEPTOR, por sua capacidade em reduzir atividade do complexo mTORC1, contribui para sobrevivência celular dependente da proteína Akt. Em continuidade, consideramos, como segunda hipótese, que a desestruturação de lipid rafts poderia influenciar negativamente a ativação dos receptores HER-2. Para isso tratamos, as mesmas linhagens celulares anteriormente descritas, com ácido docosaexaenoico (DHA), um tipo de ácido graxo ômega-3. Nossos resultados mostraram que, nas células HB4aC5.2, o tratamento com DHA desestruturou os lipid rafts, inibiu a sinalização iniciada pelos receptores HER-2 ( diminuição da ativação das proteínas Akt, Erk1/2, FASN, atividade transcricional de PPAR? e expressão de DEPTOR) e reverteu o fenótipo lipogênico. Adiciona-se que essas modificações celulares e moleculares foram acompanhadas por indução significativa de morte e apoptose. As mesmas alterações não foram observadas nas células normais HB4a. Em conclusão, o presente estudo reforça a associação entre a presença de HER-2 e lipid rafts. Adicionalmente aponta que a desestruturação de lipid rafts por DHA reduz a sinalização de HER-2. Por fim, sugere que distúrbios em lipid rafts, induzidos por DHA, possam representar ferramenta útil no controle da sinalização aberrante deflagrada pelos receptores HER-2, e aponta potencial terapêutico na suplementação de DHA para quimioprevenção e tratamento do câncer de mama HER-2 positivo. / HER-2 receptor overexpression is a cellular abnormality of great clinical significance in breast cancer. It is described in approximately 30% of breast carcinomas, including preneoplasic and malignant lesions, and is associated with poor prognosis. Hyperactivation of HER-2 receptors, a natural consequence of its overexpression, promotes aberrant cell proliferation and tumorigenesis. For signal activation and transduction to occur, HER-2 must be localized in specific compartments in the cell membrane: the lipid rafts. Therefore, we hypothesize that a greater number of HER-2 receptors could indicate a greater quantity of lipid rafts. To test this, we used an oncogenic transformation model that specifically allowed assessment of the effects of HER-2 overexpression and identification of the quantity of lipid rafts: an HB4a cell line derived from normal human breast tissue luminal epithelial cells with low HER-2 expression, and an HB4aC5.2 cell line, a clone derived from HB4a that overexpresses HER-2 receptors. In the HB4aC5.2 cells, HER-2 overexpression was accompanied by an increase in lipid rafts in cell membranes as well as hyperactivation of survival signals, proliferation (increased activation of the proteins Akt and ERK1/2, respectively), and an increased rate of proliferation, compared to the normal HB4a line. In addition, HER-2 overexpression was associated with increased cellular lipogenesis (lipogenic phenotype), dependent on the increased activation of the FASN enzyme and the overexpression of DEPTOR. FASN is responsible for the synthesis of palmitate, used to synthesize lipid rafts. Overexpression of DEPTOR by modulating PPAR? transcriptional activity, may avoid lipotoxicity from excess palmitate. Moreover, DEPTOR, with its ability to reduce mTORC1 complex activity, contributes to cell survival dependent on Akt. To continue, we considered as a second hypothesis that the disruption of lipid rafts could negatively influence HER-2 receptor activation. For this, we treated the same cell lines described above with docosahexaenoic acid (DHA), a omega-3 fatty acid. Our results showed that in HB4aC5.2 cells DHA treatment disrupted the lipid rafts, inhibited signaling initiated by HER-2 receptors (reduced activation of Akt, ERK1/2, and FASN proteins, PPAR? transcriptional activity, and DEPTOR expression) and reversed the lipogenic phenotype. In addition, these cellular and molecular changes were accompanied by a significant induction of apoptosis and death. The same changes were not observed in normal HB4a cells. In conclusion, the present study reinforces the association between HER-2 presence and lipid rafts. It also indicates that the disruption of lipid rafts by DHA reduces HER-2 signaling. Finally, it suggests that DHA-induced disturbances in lipid rafts may represent a useful tool in controlling aberrant signaling triggered by HER-2 receptors, and indicate therapeutic potential in DHA supplementation for chemoprevention and treatment of HER-2 positive breast cancer.