En raison de l'apparition de résistances aux différents médicaments disponibles pour lutter contre le SIDA, il est nécessaire de développer de nouvelles stratégies pour inhiber la réplication du VIH-1. Nous présentons ici la synthèse d'une nouvelle famille d'inhibiteurs potentiellement mixtes de l'intégrase et de la fonction ribonucléase H de la transcriptase inverse du VIH-1, basée sur un motif 2-hydroxyisoquinoléine-1,3-dione. Nous avons ainsi construit soixante-quinze composés repartis en huit groupes différents: trois groupes de dérivés substitués en position 7 comportant de petites fonctions, des groupements phényles et amides variés, trois groupes de dérivés substitués en position 4 comportant des groupements alkyles/alkaryles, esters et amides ainsi que deux familles de composés disubstitués en positions 4 et 7 et en position 4. Parmi les composés testés, quarante trois présentent une activité inhibitrice enzymatique importante in vitro (CI50 < 10 µlM) sur au moins une des deux enzymes, et vingt ont une activité puissante in vitro (CI50 < 1 µM) sur intégrase. Les profils d'inhibition sont variables puisque certains inhibent les deux enzymes alors que d'autres se révèlent sélectifs. Quatorze sont également actifs sur cellules infectées MT-4. Nous avons également montré que ce type de composé était capable de complexer de manière forte les cations divalents magnésium, renforçant ainsi les hypothèses concernant le mode d'inhibition enzymatique de ces composés. / Due to the apparition of resistances against the commonly used anti-AIDS agents, it is a necessity to develop new strategies to inhibit the replication cycle of HIV-l. We herein present the synthesis of a new family of dual HIV-1 integrase and ribonuclease H inhibitors, based on a 2-hydroxyisoquinoline-1,3-dione scaffold. Seventy five compounds were synthesized, which can be divided into eight groups : three groups are derivatives substituted on position 7 with small functions, phenyle and amide groups, three groups are derivatives substituted on position 4 with alkyle, aryle, ester or amide groups and the two last ones include disubstituted compounds on position 4 or positions 4 and 7. Among the tested compounds, forty three inhibited at least one of the two enzymes with potent activities (IC50 < 10 µM). Twenty compounds were highly active in vitro inhibitors against integrase (IC50 < 1 µM). Various inhibition profiles were observed since sorne compounds inhibited both enzymes and others were selective inhibitors. Fourteen compounds showed antiviral activities against MT-4 infected cells. We have also showed that these compounds are able to strongly bind diva lent metallic cations like Mg2+, in accordance with their presumed enzymatic inhibitory mechanism.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les rétrovirus humains tels que HTLV-I (Human T-cell Leukemia Virus) et HIV-l (Human lmmunodefiency Virus Type-l) sont associés à des pathologies mortelles et sont largement répandus à travers le monde. Actuellement, aucun vaccin ni thérapie ne sont disponibles pour prévenir ou enrayer totalement l'infection par ces virus. Le but du présent projet est de développer une nouvelle approche anti-rétrovirale se basant sur l'altération de l'ADN viral intégré dans le génome de la cellule hôte. Nous avons utilisé comme modèle le rétrovirus de la leucémie murine (MuLV) Cas-Br-E. Ce virus induit des leucémies non B et non T et engendre une maladie neurologique spongiforme chez certaines souches de souris. La cible du traitement est l'intégrase (IN), une enzyme clé du cycle réplicatif. Elle catalyse l'intégration de l'ADN du virus dans le génome de la cellule de l'hôte et est également impliquée dans la transcription inverse, le transport de l'ADN viral dans le noyau et l'assemblage des particules virales. Les traitements, des ODN mutagènes de l'lN, sont conçus de manière à introduire une mutation au début de la séquence codante de l'IN, engendrant ainsi la production de particules virales défectives et non infectieuses. Les expérimentations se sont effectuées en deux volets: avec le traitement de cellules NIH NE-8 chroniquement infectées par Cas-Br-E et, ensuite, avec celui de cellules NIH 3T3, infectées par Cas-Br-E et traitées à différentes périodes post-infection. L'impact des traitements a été déterminé par titration des virus produits en immunofluorescence, dosage de la transcriptase inverse et séquençage des produits de PCR des ADN et ARN des cellules traitées. Les résultats obtenus avec les ODN mutagènes montrent une diminution de la production de virus infectieux en fonction du nombre de traitements, de la dose utilisée et du moment où les traitements ont été effectués. Une inhibition totale de la production virale est possible avec l'utilisation d'une seule dose massive de 4,0 µM ou d'une faible dose de 1,34 µM ciblée en début d'infection, soit dans les 4 premiers jours. Des mutations du génome ont été observées au niveau de l'ADN et de l'ARN des cellules traitées. En conclusion, la diminution de la production de virus infectieux, suite aux traitements, permet d'envisager l'utilisation de cette stratégie comme nouveIle thérapie contre les infections par HlV-I et HTLV-I, d'autant plus qu'une fois la production de virus infectieux enrayée totalement, l'inhibition se maintient dans le temps.

L'intégrase (IN) rétrovirale est responsable de l’intégration de l'ADN viral du VIH-1dans l’ADN cellulaire, processus indispensable à la réplication virale. Ce processus se déroule en deux étapes indépendantes, le 3’-processing et le transfert de brins, catalysées par l’IN. La compréhension des interactions entre l’IN et l’ADN viral et de la cinétique de formation des complexes pré-intégratifs a permis l’identification du raltégravir (RAL) et de l’elvitégravir (ELV) qui se sont avérés être des inhibiteurs très efficaces de la réplication virale. Le RAL, auparavant désigné sous le code MK-0518, est un nouveau médicament anti-VIH qui a obtenu son autorisation de commercialisation aux Etats-Unis sous le nom de IsentressTM le 12 octobre 2007. Le ELV est toujours en essais cliniques. Toutefois, comme on l'observe pour d'autres antirétroviraux, ces composés n’échappent cependant pas aux phénomènes de résistance. Des mutations de résistance spécifiques au RAL ont ainsi été identifiées chez des patients. À ce jour, aucune donnée expérimentale caractérisant la structure de l’IN du VIH-1, la structure au RAL et/ou les interactions du RAL avec sa cible n'a été rapporté.Premièrement, nous avons caractérisé les propriétés structurales et conformationnelles du RAL dans des états différents, en phase gazeuse, en solution dans l'eau et à l'état solide. Une etude détaillée a permis de caracteriser la reconnaissance du RAL par des cibles virals, l’IN et l’ADN viral avant et après la réaction de 3’-processing. Nous avons trouvé que le RAL adopte un large spectre de conformations et configurations dans des états isolés et/ou liés avec le(s) cible(s). Les meilleures score et poses de docking confirment que le modèle représentant le complexe IN•vADN est la cible biologiquement pertinente du RAL. Ce résultat est cohérent avec le mécanisme d'inhibition du RAL communément admise. Nous avons suggéré que le processus d'inhibition peut comprendre dans un premier temps la reconnaissance du RAL par l'ADN viral clivé et lié à un état intermédiaire de l’IN. Le RAL couplé à l’ADN viral montre une orientation à l'extérieur de tous les atomes d'oxygène, d'excellents agents putatifs pour capturer de cations Mg2+, ce qui pourrait faciliter l'insertion du RAL dans le site actif. La flexibilité conformationnelle du RAL permet l'adaptation de l'inhibiteur dans une poche relativement grande de du complexe IN•vADN, permettant la production de diverses conformations du RAL. Nous croyons que cette diversité des conformations du RAL contribue à la reconnaissance de résidus enzymatiques et peut influer sur le choix des voies alternatives de résistance au RAL observées cliniquement.Nous avons étudié également la reconnaissance par l’IN des inhibiteurs du VIH appartenant à différents souches, B et CRF02_AG. Nous avons montré que la structure de l’IN des deux souches est quasi-identique. Le docking du RAL et de deux autres inhibiteurs de transfert de brins (ELV et L731_988) sur chaque modèle montre que leur reconnaissance par deux différentes souches cibles est identique.Notre analyse des effets moléculaires et structuraux des mutations de résistance sur la structure de l’IN a montré que les structures de l’enzyme sauvage et mutante sont aussi quasiidentique.Par contre, les mutations modifient considérablement la spécificité de reconnaissance de l'ADN par l'IN.Nous avons effectué la simulation de dynamique moléculaire (MD) de l’IN sauvage et mutant, avec une mutation ponctuelle R228A localisée dans le domaine C-terminale. Notre étude de la flexibilité de l’IN et du complexe IN•ADN par la dynamique moléculaire ouvre une voie très prometteuse non seulement sur le plan de la recherche fondamentale mais aussi pour l'application de nos concepts au développement de nouvelles générations d'inhibiteurs ciblant l'IN. / The HIV-1 integrase catalyzes the integration of HIV-1 viral DNA (vDNA) into the host cell chromosome in a process, which is essential for viral replication through two independent reactions, 3’-processing (3’-P) and strand transfer (ST), catalyzed by IN. Deciphering the structural determinants of the interaction between integrase and its substrates and the kinetics of this interaction sheds light on the importance of inhibitors targeting the pre-integration IN•vDNA complex. This approach led to the identification of raltegravir (RAL) and elvitegravir (ELV), which turned out to be highly efficient inhibitors of ST. RAL, formerly known under the code MK-0518, is a new anti-HIV drug that obtained clinical approval in the United States under the name IsentressTM on October 12, 2007. ELV is still in clinical trials. However, these compounds nevertheless encounter resistance phenomenon. To date, no experimental data characterizing the RAL structure, structure of the HIV-1 IN and/or interactions of RAL with its targets, has been reported.First, we characterized the structural and conformational properties of RAL in different states ‒ the gas phase, in water solution and the solid state. Second, a detailed study allowed characterisation the RAL recognition by the viral targets ‒ IN and the vDNA, before and after the 3'-P. We found that RAL shows a broad spectrum of conformations and configurations in isolated state and/or associated with the target(s). The best docking poses and scores confirmed that the model representing IN•vDNA complex is a biologically relevant target of RAL. This result is consistent with the commonly accepted mechanism of RAL inhibition.Based on the docking results we suggested that the inhibition process may include, as a first step, the RAL recognition by the processed vDNA bound to a transient intermediate IN state. RAL coupled to vDNA shows an outside orientation of all oxygen atoms, excellent putative chelating agents of Mg2+ cations, which could facilitate the insertion of RAL into the active site. The conformational flexibility of RAL further allows the accommodation/adaptation of the inhibitor in a relatively large binding pocket of IN•vDNA pre-integration complex thus producing various RAL conformation. We believe that such variety of the RAL conformations contributing alternatively to the enzyme residue recognition may impact the selection of the clinically observed alternative resistance pathways to the drug.We also studied the recognition of the HIV-1 IN inhibitors from two different strains, B and CRF02_AG. Our in silico study showed that the sequence variations between CRF02_AG and B strains did not lead to any notable difference in the structural features of the enzyme and did not impact the susceptibility to the IN inhibitors. Our analysis of the resistance mutations effects showed that structure of the wild-type enzyme and mutants is almost identical. However, the resistance mutations significantly altered the specificity of the viral DNA recognition by IN.We performed molecular dynamics simulations of the native and mutated IN with a point mutation R228A localized in the C-terminal domain. The study of targets flexibility opens a very promising way, not only in terms of fundamental research, but also for the application of our concepts to the development of new generations of inhibitors targeting IN.

Ce mémoire de thèse présente mes travaux sur la détermination de la susceptibilité et de la résistance des intégrases (INs) du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) aux inhibiteurs de transfert de brins de l'IN (INSTIs) ainsi que le développement de fragments d’anticorps simple-chaîne (sdAbs) ciblant l’IN du VIH. Tout d’abord, car les études antérieures ont suggéré que les variations significatives de l’IN de souche CRF02_AG pourrait avoir des effets consécutifs sur l'interaction entre l'inhibiteur et l’IN, la susceptibilité de l’IN de souche CRF02_AG du VIH-1 aux dernières INSTIs a été déterminée. Accord avec l'étude in silico, nous avons mis en évidence que l’activité de 3’-processing et de transfert de brin des INs de souche B et de souche CRF02_AG sont comparables. La susceptibilité des INs recombinantes de souche CRF02_AG aux INSTIs utilisés (Raltégravir-RAL, Elevitégravir-EVG et L-731, 988) est similaire à celle de l’IN de souche B, malgré les variations naturelles qui se produisent dans les INs de souche CRF02_AG. Le polymorphisme de l’IN de CRF02_AG n’a pas d’effet significatif sur la susceptibilité aux INSTIs. Dans un second temps, la résistance de l’IN du VIH-2 au RAL, l’unique INSTI approuvé, a été confirmée in vitro avec des enzymes mutées portant des mutations de résistance. Les mutations aux positions 155 et 148 jouent un rôle similaire pour les VIH-1 et VIH-2, en rendant l'IN résistante au RAL. La mutation G140S confère peu de résistance, mais compense le défaut catalytique dû à la mutation Q148R. À l'inverse, Y143C seule ne confère pas de résistance au RAL excepté si la mutation E92Q est également présente. De plus, l'introduction de la mutation Y143C dans le mutant résistant N155H baisse le niveau de résistance de l’enzyme contenant la mutation N155H, ce qui pourrait expliquer l'absence de détection de ces deux mutations ensemble dans un seul génome. Enfin, des anti-VIH sdAbs avec nombreuses propriétés intéressantes ont été sélectionnés pour développer des agents antirétroviraux. Après la sélection de sdAb ciblant l’IN du VIH, nous avons obtenu des qui sdAbs qui reconnaissent spécifiquement une vaste gamme d’INs in vitro, y compris le mutant G140S/Q148R résistant aux INSTIs. Néanmoins, l'activité inhibitrice des sdAbs n'a pas été observée. Les sdAbs ciblant l’IN du VIH peuvent être utilisés pour d'autres applications, telles que des réactifs ciblant des nanocapteurs. À l'avenir, en raison des avantages uniques des sdAbs, le développement de sdAbs anti-IN du VIH qui bloquent la réplication du VIH reste attractive pour l'obtenir des inhibiteurs efficaces de l’IN. / This thesis presents the determination of susceptibility and resistance of HIV integrases (INs) to IN strand transfer inhibitors (INSTIs) and the development of single domain antibody (sdAb) targeting HIV IN. Firstly, the susceptibility of HIV-1 subtype CRF02_AG INs to the latest INSTIs was determined, since previous studies suggested that the significant variations of CRF02_AG IN may have consequential effects on the interaction between the inhibitor and IN. Consistent with in silico study, we found that 3’-processing and strand transfer activity of both HIV-1 subtype B IN and subtype CRF02_AG IN are comparable. The susceptibility of recombinant CRF02_AG INs to employed INSTIs (Raltegravir-RAL, Elevitegravir-EVG and L-731, 988) is similar to that of HIV-1 B IN. Hence, the polymorphism of CRF02_AG IN cannot significantly effect on the susceptibility to INSTIs. Secondly, the resistance of HIV-2 IN to RAL, the unique approved INSTI, has been confirmed in vitro with mutated enzymes harboring resistance mutations. Mutations at positions 155 and 148 played a similar role in HIV-1 and HIV-2, rendering the IN resistant to RAL. The G140S mutation conferred little resistance, but compensated for the catalytic defect due to the Q148R mutation. Conversely, Y143C alone did not confer resistance to RAL unless E92Q is also present. Furthermore, the introduction of the Y143C mutation into the N155H resistant background decreased the resistance level of enzyme containing the N155H mutation, possibly accounting for the lack of detection of these two mutations together in a single genome. Finally, anti-HIV IN sdAb that is endowed with many attractive properties was selected for developing antiretroviral agents. After the selections, we have obtained some sdAbs that specifically recognize a broad range of INs in vitro, including INSTI-resistance mutant G140S/Q148R. However, the inhibition activity of anti-HIV IN sdAbs has not been observed yet. Anti-HIV IN sdAbs can be applied for other application, such as targeting reagents for nanosensor. In future, development of anti-HIV IN sdAbs which are able to block HIV replication remains attractive for obtaining efficient inhibitor of IN.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

KplE1 est l’un des dix prophages présents sur le chromosome de la souche Escherichia coli K12. Nous avons montré in vivo que ce prophage est compétant pour s’exciser du chromosome bactérien bien qu’il soit incapable de former des particules virales et de lyser son hôte. Au laboratoire, nous avons identifié les protéines IntS (intégrase) et TorI (RDF), codées sur le prophage KplE1, et la protéine IHF (NBP) de l’hôte comme seules impliquées dans le mécanisme de recombinaison spécifique de site (RSS). Nous avons cartographié sur les régions attL et attR, les sites de fixations des protéines de recombinaison permettant l’assemblage de l’intasome, le complexe nucléoprotéique compétant pour la RSS. L’ensemble de ces sites ainsi que les gènes intS et torI qui chevauchent respectivement les régions attL et attR, ont permis de définir un module de recombinaison de type KplE1. Ce module est très conservé et se retrouve chez des phages infectant différentes souches d’E. coli et de shigella. Le modèle en terme de RSS est celui décrit pour les bactériophages de type λ. Cependant, le nombre et l’organisation des sites de recombinaison suggèrent que l’architecture de l’intasome de type KplE1 diffère de celle de λ. Nos résultats renforcent ainsi l’idée que l’assemblage de l’intasome est spécifique du module de RSS considéré même si, in fine, la réaction catalysée demeure similaire.En ce qui concerne l’expression des gènes intS et torI, le fait que ces gènes soient localisés à chacune des extrémités du prophage, rend ainsi impossible leur couplage transcriptionnel à partir d’un promoteur commun au moment de la commutation lyse/lysogénie, tel qu’il est connu pour les phages lambdoïdes. De part son orientation atypique sur attL, la présence de sites de fixations des protéines IntS et TorI au niveau du promoteur du gène intS, nous ont logiquement amené à étudier sa régulation. Nous avons ainsi montré que le gène intS est négativement régulé par son propre produit ainsi que par la protéine RDF TorI. Nos résultats in vivo et in vitro indiquent que l’efficacité de la réaction de recombinaison excisive est intimement liée à la quantité d’intégrase présente, pouvant alors justifier la raison d’être de ce contrôle strict de l’expression du gène intS. En parallèle, une approche in silico a révélé que cette orientation atypique du gène codant pour l’intégrase est largement répandue sur les génomes des prophages, nous amenant à généraliser ce mécanisme atypique de régulation négative de l’intégrase. / KplE1 is one of the 10 prophage region present on the Escherichia coli K12 chromosome. We showed in vivo that this prophage is fully competent to excise from the bacterial chromosome, although it is unable to form viral particles and lyse its host. In the laboratory, we have identified Ints (integrase) and TorI (RDF) proteins, encoded on the KplE1 prophage, and the host protein IHF (NBP) only involved in the mechanism of site-specific recombination (SSR). We have mapped on attL and attR regions, the binding sites of recombinant proteins for the assembly of the intasome, the nucleoprotein complex competent for SSR. All of these sites as well as intS and torI genes that overlap respectively attL and attR regions, have permit to define a KplE1 recombination module. This module is highly conserved and is found among phages infecting different E. coli and shigella strains. The model in terms of RSS is that described for λ bacteriophage. However, the number and organization of recombination sites suggests that the architecture of the KplE1 intasome differs from that of λ. Our findings reinforce the idea that the intasome assembly is specific to the SSR module considered even if ultimately the catalyzed reaction is similar.Regarding the intS and torI gene expressions, the fact that these genes are located at each end of the prophage, prevented the transcriptional coupling of these genes from a common promoter when the lysis/lysogeny switch occurs. Because of its atypical orientation on attL, and the presence of IntS and TorI protein binding sites that overlap its promoter region, we have logically studied the regulation of the intS gene. We have shown that intS is negatively regulated by both IntS and TorI proteins. Our in vivo and in vitro results suggest that the efficiency of the excision recombination reaction is closely related to the amount of this integrase, which can justify the strict control of the intS gene expression. In parallel, an in silico approach has revealed that the atypical orientation of the integrase gene is widespread in prophage genomes, leading us to generalize this atypical mechanism of negative regulation of integrase

Il existe un certain nombre de situations au cours desquelles l'intégrité du génome cellulaire est mise en danger. Ceci se produit notamment lors de mouvements de gènes (translocation, éléments mobiles), lors d'infections virales parfois intégratives (AAV, HBV, HPV) ou lors d'infections rétrovirales. En effet, le cycle de réplication des rétrovirus nécessite une étape d'intégration du génome viral dans l'ADN génomique de la cellule infectée. Malgré les nombreuses études menées sur les infections par le VIH, les cancers viro-induits ou non et les thérapies géniques basées sur les rétrovirus, aucune donnée n'est actuellement disponible sur les modifications cellulaires induites par de telles perturbations chromosomiques. L'objectif du projet était d'identifier des mécanismes cellulaires induits par des atteintes à l'intégrité du génome, plus précisément par l'insertion de molécules d'ADN non cellulaire dans les chromosomes. L'intégration de matériel génétique additionnel a été induite par des vecteurs lentiviraux dérivés du VIH-1. Les modifications cellulaires uniquement dues à l'intégration ont été isolées par comparaison de vecteurs intégratif et non intégratif. Des cellules primaires du derme humain ont été sélectionnées pour l'étude. Les temps post infection et les doses virales les plus adéquates ont été sélectionnés grâce à des expériences de cinétiques d'intégration couplées à une quantification des ADN viraux intégrés. L'analyse des modifications cellulaires induites par l'intégration de l'ADN étranger a portée sur l'ensemble du transcriptome et sur l'ensemble du protéome cellulaire. Dans le but d'effectuer une analyse transcriptomique, des puces à ADN, représentant le génome humain complet, ont été utilisées. Cette étude a démontré une forte répression transcriptionnelle induite par l'intégration. De plus, toutes les fonctions cellulaires sont perturbées par le processus. Finalement, une classification par interactions et fonctions biologiques a mis en évidence cinq processus cellulaires majoritairement affectés par l'intégration de l'ADN étranger, qui correspondent au cycle et à la mort cellulaire, au remodelage et à la réparation de la chromatine et à la réponse immunitaire ou au stress. Dans le but de compléter cette analyse transcriptomique, une étude protéomique a été réalisée. Les protéines cellulaires ont été séparées sur des gels bi-dimensionnels. Parmi les neuf protéines identifiées en spectrométrie de masse, certaines appartiennent au cytosquelette et d'autres aux mécanismes de réponse au stress. L'intégration d'un ADN étranger au sein du génome provoque donc bien des perturbations cellulaires. L'intégration de matériel génétique additionnel ne concernant pas seulement les rétrovirus, les données obtenues lors de cette étude pourront permettre (i) de développer des stratégies de défenses contre les rétrovirus ou contre les autres maladies caractérisées par des atteintes à l'intégrité du génome, (ii) d'évaluer les risques encourus par l'intégration d'un vecteur thérapeutique dans le génome cellulaire lors des thérapies géniques ou des expériences de transfert de gènes.

L’intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé du cycle viral du VIH-1 puisque celle-ci catalyse l’insertion stable du génome viral dans celui de la cellule infectée. D’autre part, l’IN participe également à de nombreuses étapes du cycle viral (transcription inverse, import du complexe de préintégration, bourgeonnement…). L’étape d’intégration elle-même fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et viraux interagissant avec l’IN. Certains sont connus et étudiés (LEDGF/P75, TNPO3…), mais il est très probable qu’un très grand nombre de ces partenaires soient encore méconnus malgré leur importance. Depuis quelque année, le rôle des modifications post-traductionnelles de l’IN a commencé à être étudié. En effet plusieurs études montrent que la régulation de l’activité de l’IN pourrait se faire via de telles modifications. Mon travail de thèse s’est orienté sur trois questions autour de ces deux aspects. -Nous avons identifié plusieurs phosphorylations de l’IN par spectrométrie de masse et mis en évidence le rôle essentiel de la phopshorylation de la sérine 24 pour l’infection virale. -Le rôle de la kinase cellulaire GCN2 a été étudié. Nous avons pu montrer un effet restrictif de la protéine sur le cycle viral amenant à un arrêt de la traduction à un temps court après l’infection au VIH-1. L’interaction entre GCN2 et l’IN a été mise en évidence. L’étude du domaine d’interaction entre l’IN et GCN2 a permis la caractérisation d’un résidu essentiel de l’IN, le E85. -L’impact du facteur de réparation RAD51 sur la réplication virale a été étudié. Nous avons montré un effet inhibiteur de cette protéine. Ce travail a permis l’identification d’une molécule chimique RS-1 capable d’inhiber l’intégration dans les cellules infectées via la stimulation de RAD51. / The integrase (IN) of HIV-1 is a key enzyme of the viral cycle of HIV-1 since it catalyzes the stable integration of the viral genome into that of the infected cell. Furthermore, the IN also participates in many steps of the viral cycle (reverse transcription, import of preintegration complex, budding ...). The integration step itself involves many cellular and viral partners interacting with IN. Some of them are studied (LEDGF/p75, TNPO3 ...) but it is very likely that many of these partners are still unknown despite their importance. Recently, the role of post-translational modifications of the IN began to be studied. In fact several studies show that the regulation of the activity of IN could be done through such modifications.My thesis work focused on three issues: -We identified several phosphorylations of IN by mass spectrometry and identified the crucial role of serine 24 to viral infection. -The role of GCN2 cellular kinase was studied. We have shown a restrictive effect of the protein on the viral cycle leading to a translation stop in first hours following infection with HIV-1. The study of the interaction domain between IN and GCN2 allowed the characterization of a critical residue of IN, the E85. -The impact of RAD51 repair factor on viral replication was investigated. We have shown an inhibitory effect of this protein. This work allowed the identification of a chemical molecule RS-1 able to inhibit integration in infected cells through RAD51 stimulation.

Les rétrotransposons LTR sont des éléments transposables très répandus chez les eucaryotes. Comme les rétrovirus, ils se répliquent par transcription inverse de leur ARN en ADNc, qui est intégré dans le génome hôte par leur propre intégrase (IN). Des études de séquençage à haut débit ont clairement établi que l'intégration ne se fait pas de façon aléatoire dans l'ensemble du génome de la cellule hôte. Des connaissances approfondies sur la biologie rétrovirale ont été acquises grâce à leur étude sur la levure utilisant le Ty1 LTR-retrotransposon comme modèle de travail. Le rétrotransposon Ty1 de la levure Saccharomyces cerevisiae intègre en amont des gènes de classe III, les gènes transcrits par l'ARN polymérase III (Pol III). Des données récentes ont révélé l'importance de l'AC40, une sous-unité de Pol III dans ce ciblage. Une interaction entre le Ty1 IN et l'AC40 est nécessaire pour le choix du site d'intégration des gènes Pol III. Néanmoins, le mécanisme moléculaire reste largement inconnu. Afin d'obtenir une vision globale de l'ensemble du phénomène qui se produit sur le site d'intégration, nous aimerions déterminer de manière exhaustive les protéines qui interagissent avec Ty1 IN et analyser leur rôle dans l'intégration de Ty1 et la transcription de l'ARN Pol III. Pour atteindre cet objectif, nous avons développé des approches protéomiques pour identifier de nouveaux partenaires cellulaires Ty1 intégraux. Nous avons identifié plusieurs nouveaux partenaires Ty1 IN qui semblent intéressants et leur rôle moléculaire dans la rétrotransposition de Ty1 sera étudié. Cependant, dans le cadre de mon doctorat, j'ai particulièrement travaillé à déchiffrer le rôle moléculaire de la protéine caséine kinase II dans la rétrotransposition de Ty1. / LTR-retrotransposons are widespread transposable elements in eukaryotes. Like retroviruses, they replicate by reverse transcription of their RNA into cDNA, which is integrated into the host genome by their own integrase (IN). High-throughput sequencing studies clearly established that integration does not occur randomly throughout the host-cell genome. Deep insights on retroviral biology have been gained by their study in yeast using the Ty1 LTR-retrotransposon as a working model. The Ty1 retrotransposon of the yeast Saccharomyces cerevisiae integrates upstream of class III genes, the genes transcribed by RNA polymerase III (Pol III). Recent data revealed the importance of AC40, a Pol III subunit in this targeting. An interaction between the Ty1 IN and AC40 is necessary for integration site choice at the Pol III genes. Nevertheless, the molecular mechanism remains largely unknown. To obtain a global view of the entire phenomenon that occurs on the integration site we would like to exhaustively determine the proteins that interact with Ty1 IN and analyze their role in both Ty1 integration and RNA Pol III transcription. To achieve this goal, we have developed proteomic approaches to identify new Ty1 integrase cellular partners. We have identified several novel Ty1 IN partners that seem interesting and their molecular role in Ty1 retrotransposition will be studied. However, in the tenure of my PhD, I have particularly worked to decipher the molecular role of the casein kinase II protein in Ty1 retrotransposition.