Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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KplE1 est l’un des dix prophages présents sur le chromosome de la souche Escherichia coli K12. Nous avons montré in vivo que ce prophage est compétant pour s’exciser du chromosome bactérien bien qu’il soit incapable de former des particules virales et de lyser son hôte. Au laboratoire, nous avons identifié les protéines IntS (intégrase) et TorI (RDF), codées sur le prophage KplE1, et la protéine IHF (NBP) de l’hôte comme seules impliquées dans le mécanisme de recombinaison spécifique de site (RSS). Nous avons cartographié sur les régions attL et attR, les sites de fixations des protéines de recombinaison permettant l’assemblage de l’intasome, le complexe nucléoprotéique compétant pour la RSS. L’ensemble de ces sites ainsi que les gènes intS et torI qui chevauchent respectivement les régions attL et attR, ont permis de définir un module de recombinaison de type KplE1. Ce module est très conservé et se retrouve chez des phages infectant différentes souches d’E. coli et de shigella. Le modèle en terme de RSS est celui décrit pour les bactériophages de type λ. Cependant, le nombre et l’organisation des sites de recombinaison suggèrent que l’architecture de l’intasome de type KplE1 diffère de celle de λ. Nos résultats renforcent ainsi l’idée que l’assemblage de l’intasome est spécifique du module de RSS considéré même si, in fine, la réaction catalysée demeure similaire.En ce qui concerne l’expression des gènes intS et torI, le fait que ces gènes soient localisés à chacune des extrémités du prophage, rend ainsi impossible leur couplage transcriptionnel à partir d’un promoteur commun au moment de la commutation lyse/lysogénie, tel qu’il est connu pour les phages lambdoïdes. De part son orientation atypique sur attL, la présence de sites de fixations des protéines IntS et TorI au niveau du promoteur du gène intS, nous ont logiquement amené à étudier sa régulation. Nous avons ainsi montré que le gène intS est négativement régulé par son propre produit ainsi que par la protéine RDF TorI. Nos résultats in vivo et in vitro indiquent que l’efficacité de la réaction de recombinaison excisive est intimement liée à la quantité d’intégrase présente, pouvant alors justifier la raison d’être de ce contrôle strict de l’expression du gène intS. En parallèle, une approche in silico a révélé que cette orientation atypique du gène codant pour l’intégrase est largement répandue sur les génomes des prophages, nous amenant à généraliser ce mécanisme atypique de régulation négative de l’intégrase. / KplE1 is one of the 10 prophage region present on the Escherichia coli K12 chromosome. We showed in vivo that this prophage is fully competent to excise from the bacterial chromosome, although it is unable to form viral particles and lyse its host. In the laboratory, we have identified Ints (integrase) and TorI (RDF) proteins, encoded on the KplE1 prophage, and the host protein IHF (NBP) only involved in the mechanism of site-specific recombination (SSR). We have mapped on attL and attR regions, the binding sites of recombinant proteins for the assembly of the intasome, the nucleoprotein complex competent for SSR. All of these sites as well as intS and torI genes that overlap respectively attL and attR regions, have permit to define a KplE1 recombination module. This module is highly conserved and is found among phages infecting different E. coli and shigella strains. The model in terms of RSS is that described for λ bacteriophage. However, the number and organization of recombination sites suggests that the architecture of the KplE1 intasome differs from that of λ. Our findings reinforce the idea that the intasome assembly is specific to the SSR module considered even if ultimately the catalyzed reaction is similar.Regarding the intS and torI gene expressions, the fact that these genes are located at each end of the prophage, prevented the transcriptional coupling of these genes from a common promoter when the lysis/lysogeny switch occurs. Because of its atypical orientation on attL, and the presence of IntS and TorI protein binding sites that overlap its promoter region, we have logically studied the regulation of the intS gene. We have shown that intS is negatively regulated by both IntS and TorI proteins. Our in vivo and in vitro results suggest that the efficiency of the excision recombination reaction is closely related to the amount of this integrase, which can justify the strict control of the intS gene expression. In parallel, an in silico approach has revealed that the atypical orientation of the integrase gene is widespread in prophage genomes, leading us to generalize this atypical mechanism of negative regulation of integrase

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'étude des virus d'archaea, la manière dont ils sont capables d'infecter leurs hôtes et éventuellement de réaliser le transfert de certains gènes est d'intérêt pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui ont permis le brassage de l'information génétique dans le phylum des archaea. Notre modèle d'étude est le fusellovirus SSV1 qui infecte certaines souches du genre Sulfolobus, dont Sulfolobus shibatae et Sulfolobus solfataricus. Le cycle viral de SSV1 est actuellement très peu connu, mais comprend l'intégration du génome viral dans celui de l'hôte à un site spécifique et la production de particules virales, sans lyse cellulaire, lors d'irradiation UV des cultures infectées. Nous avons initié l'étude de ce virus en analysant les propriétés biochimiques de son intégrase. Nous avons ainsi montré que l'intégrase virale était un membre à part entière de la famille des tyrosine recombinases, une classe de recombinases spécifiques de site que l'on trouve chez les procaryotes eubactériens mais également chez les eucaryotes. L'étude biochimique de l'intégrase de SSV1 nous a permis de mettre en évidence le caractère hybride du mécanisme de recombinaison spécifique de site chez les archaea. En effet, si l'organisation des sites de recombinaison est similaire à celle de systèmes phagiques eubactériens, celle du site actif de la recombinase est de type eucaryote, puisqu'il est assemblé à l'interface de deux protomères fournissant chacun des résidus intervenant dans la catalyse. Nous continuerons l'étude de l'organisation spatiale de ce système mosaïque en cristallisant l'intégrase sur un site synthétique. Une autre originalité du système archaéen est que le gène de l'intégrase est disrupté lors de l'intégration du génome viral dans celui de son hôte. Cette particularité, conservée chez tous les fusellovirus séquencés à ce jour, ouvre de nombreuses hypothèses quant au rôle de la recombinaison spécifique de site dans leur cycle réplicatif. La compréhension du mode de réplication, du maintien et de la mobilisation de ces virus lors de signaux environnementaux tels que l'irradiation UV est essentielle non seulement pour évaluer leur rôle dans la plasticité des génomes d'archaea, mais également pour leur utilisation future comme outils génétique chez leurs hôtes naturels, les Sulfolobales.<br />Nous exploiterons les résultats obtenus in vitro pour évaluer le rôle de l'intégration dans le maintien du virus sous forme stable, en replaçant des mutations inactivant soit l'intégrase soit le site viral de recombinaison dans le génome de SSV1. Le devenir de ces virus recombinants réintroduits dans Sulfolobus solfataricus sera évalué et nous permettra de déterminer si l'intégration du génome viral dans celui de son hôte est essentiel au maintien et à l'amplification du virus. Une analyse biochimique réciproque consistera à déterminer si une forme tronquée de l'intégrase (correspondant au produit de la disruption intégrative) est fonctionnelle pour le processus d'excision. La directionalité des évènements d'intégration et d'excision peut reposer soit sur la forme active de la recombinase (tronquée ou non) soit, et de manière non exclusive, par l'intervention de protéines accessoires fournies soit par l'hôte soit par le virus. L'identification de ces partenaires éventuels sera réalisée en utilisant des approches biochimiques classiques (co-immunoprécipitation, affinité, séquence peptidique) dans différentes conditions de croissance induisant ou non la production virale. Les résultats seront confrontés aux informations obtenues par les analyses transcriptomiques des effets des radiations réalisées sur Sulfolobus mais également Thermococcus ou Pyrococcus. L'analyse du pool de gènes induits lors d'une irradiation devrait contribuer à l'identification des facteurs de l'hôte intervenant dans la production virale en réponse au stress.<br />Outre le rôle de l'intégration dans le cycle viral, nous évaluerons dans une approche plus globale le rôle des différentes protéines codées par le virus. En effet, sur les 34 protéines potentiellement produites par SSV1 seules 4 ont une fonction identifiée. Par ailleurs, l'analyse comparative des différents génomes de fusellovirus montre que seules 18 ORFs (dont l'intégrase) sont communes à tous ces virus, suggérant que les protéines correspondantes assurent les fonctions minimales essentielles au développement viral. Chacune de ces ORFs sera délétée par LI-PCR. Cette stratégie devrait nous permettre de nous affranchir d'effets secondaires transcriptionnels liés à l'organisation polycistronique du génome viral. L'effet de l'inactivation de chaque ORF sera évalué en prenant en compte différentes étapes du développement viral (stabilité du génome dans la cellule hôte, production de particules virales, infectivité...). Nous espérons ainsi définir la fonction de ces protéines qui n'ont pour l'heure aucun homologue dans le vivant.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Chez les procaryotes, la réplication du chromosome peut entraîner la dimérisation des deux nouveaux chromosomes par recombinaison homologue. La fréquence de ce phénomène est particulièrement élevée dans la région du terminus de réplication du chromosome de E. coli, notamment aux sites Hot et TTiZ. Si le dimère chromosomique n'est pas résolu avant la partition dans les cellules-filles, il y aura filamentation cellulaire et aberration chromosomique. Pour contrer ce phénomène, E. coli a mis en place un système de résolution de dimères, soit le système de recombinaison spécifique de site Xer. Chez E. coli, ce système comprend les recombinases XerC et XerD et le site chromosomique dif situé dans la région du terminus de réplication. Les recombinases s'arriment d'abord aux sites dif des chromosomes formant le dimère, puis il y a coupure et échange des brins libérant ainsi les chromosomes à leurs formes monomères. La répartition de ce système de résolution de dimères est assez bien documentée parmi les bactéries Gram négatives. Cependant, peu d'études se sont penchées sur les bactéries Gram positives. Le but de notre étude est de détecter la présence de ce système chez treize espèces de bactéries Gram positives du groupe des bactéries lactiques, certaines étant très importantes dans l'industrie alimentaire. Plusieurs techniques ont été employées, dont l'hybridation Southern, l'amplification génique avec amorces dégénérées issues des séquences des recombinases déjà connues, l'amplification génique dite "inverse", ainsi que le séquençage. Nous avons également utilisé un programme informatique afin de dégager la phylogénie et les ressemblances entre les recombinases de Gram positives et entre celles-ci et les recombinases déjà connues des bactéries Gram négatives. Par hybridation Southern, nous avons réussi à démontrer la présence d'un site analogue au site dif de E. coli chez Lactobacillus casei. De plus, l'amplification génique avec amorces dégénérées a montré que cette dernière espèce ainsi que les espèces Lactobacillus plantarum souche 8014, Lactobacillus plantarum souche 14917 et Lactobacillus bulgaricus 737 possèdent toutes au moins une recombinase de type Xer. Nous n'avons pas obtenu de séquences pour les autres espèces de bactéries, peut-être à cause d'un manque d'homologie entre les amorces et l'ADN ciblé. Les régions amplifiées de ces quatre souches, correspondant à environ 430 pb du bout C-terminal de la recombinase, ont été séquencées, puis des amorces ont été fabriquées à partir de la séquence de L. casei. Ces amorces devaient amplifier les régions flanquant la séquence connue (amplification "inverse"), permettant ainsi d'obtenir une séquence complète du gène. Nous n'avons pas obtenu de résultats avec cette technique, peut-être à cause de la formation de boucles C-G dans l'ADN simple-brin lors de certains cycles de l'amplification. Les quatre séquences ont ensuite été comparées et une phylogénie a été établie. Nous avons trouvé que ces séquences formaient un groupe phylogénique fortement apparenté et qu'elles ressemblaient le plus aux séquences XerD des bactéries Gram négatives, ces dernières ressemblances surpassant même celles avec la recombinase XerD de la bactérie Gram positive B. subtilis. Ces derniers résultats suggèrent la possibilité d'une évolution différente des recombinases XerD à l'intérieur du groupe des Gram positives que nous avons examiné.

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer. / The Xer recombination system is involved in the monomerisation of bacterial replicons, such as plasmids and chromosomes, in a wide variety of bacteria. This system is a site-specific recombination system comprised of two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which act in concert to convert dimeric chromosomes to monomers by acting at a specific site near the terminus of replication called the dif site. Xer genes and their site of action have been identified in many gram positive and gram negative bacteria. Staphylococcus aureus represents a gram positive bacterium containing a XerCD/dif system. It is a bacteria implicated in many human diseases, such as skin infections, gastroenteritis and toxic shock syndrome, to name a few. Although the genes encoding the XerC and XerD proteins have been identified, not much is known about their mode of action on the dif site. Mutations in xerC have been obtained, but none in xerD, suggesting that this gene may be essential for this organism. The work presented in this paper has allowed us to better understand the XerD protein of S. aureus, not only in the sequencing of the xerD gene but also in the performing of DNA binding assays. It has been shown that XerD binds to the dif site of E. coli, not only alone but also in cooperativity with E. coli XerC. S. aureus XerD is also capable of complementing the mutated XerD protein in E. coli when it comes to chromosomal recombination. However, it does not demonstrate this same ability to complement XerD regarding recombination at the plasmidic cer sites.

Le système de recombinaison Xer est impliqué dans la monomerisation des réplicons bactériens, comme les plasmides et les chromosomes, dans une grande variété de bactéries. Ce système est un système de recombinaison site-spécifique composé de deux tyrosine recombinases, soit XerC et XerD. Ils agissent ensemble afin de convertir les chromosomes dimériques en monomères en agissant à un site spécifique près du terminus de la réplication, appelé le site dif. Les gènes Xer et leur site d’action sont identifiés dans plusieurs bactéries gram positives et gram négatives. Staphylococcus aureus représente une bactérie gram positive qui contient un système XerCD/dif. Elle est impliqué dans plusieurs maladies humaines, tels que des infections cutanées, des gastroentérites, et le syndrome de choc toxique, pour en nommer quelques unes. Bien que les gènes codant les protéines XerC et XerD ont été identifiés, il y a beaucoup d’inconnu sur leur mode d’action au site dif. Des mutations dans XerC ont été obtenues, mais aucune dans XerD, suggérant que ce gène pourrait être essentiel pour cet organisme. Les études présentées dans ce mémoire ont permis de commencer à mieux caractériser XerD de S. aureus, en séquençant le gène et en faisant des tests de liaison à l’ADN. Elles ont montré que la recombinase XerD se lie au site dif d’Eschericia coli seul et de façon coopérative avec la recombinase XerC d’E. coli. XerD de S. aureus est, aussi, efficace dans la complémentation de XerD muté d’E. coli dans la réaction de recombinaison chromosomique. Cependant, elle ne démontre pas cette même capacité de complémentation lors de la recombinaison plasmidique aux sites cer. / The Xer recombination system is involved in the monomerisation of bacterial replicons, such as plasmids and chromosomes, in a wide variety of bacteria. This system is a site-specific recombination system comprised of two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which act in concert to convert dimeric chromosomes to monomers by acting at a specific site near the terminus of replication called the dif site. Xer genes and their site of action have been identified in many gram positive and gram negative bacteria. Staphylococcus aureus represents a gram positive bacterium containing a XerCD/dif system. It is a bacteria implicated in many human diseases, such as skin infections, gastroenteritis and toxic shock syndrome, to name a few. Although the genes encoding the XerC and XerD proteins have been identified, not much is known about their mode of action on the dif site. Mutations in xerC have been obtained, but none in xerD, suggesting that this gene may be essential for this organism. The work presented in this paper has allowed us to better understand the XerD protein of S. aureus, not only in the sequencing of the xerD gene but also in the performing of DNA binding assays. It has been shown that XerD binds to the dif site of E. coli, not only alone but also in cooperativity with E. coli XerC. S. aureus XerD is also capable of complementing the mutated XerD protein in E. coli when it comes to chromosomal recombination. However, it does not demonstrate this same ability to complement XerD regarding recombination at the plasmidic cer sites.

Chez les bactéries à chromosomes circulaires, le crossing-over introduit par la recombinaison homologue peut conduire à des échanges de chromatides soeurs. Des nombres impairs de ces échanges aboutissent à la dimérisation des deux chromatides nouvellement répliquées compromettant ainsi leur ségrégation. Par conséquent, la plupart des bactéries utilisent le système de recombinaison spécifique de site Xer pour convertir les dimères de chromosomes et de plasmides en monomères stables. Ce système comporte deux recombinases de la famille Tyrosine recombinase, XerC et XerD, agissant sur le site dif. Cependant, quelques ε-protéobactéries n’ont besoin que d'une seule recombinase XerH agissant sur un site difH. Il parait intéressant d’étudier le système de recombinaison XerH de Campylobacter jejuni, surtout que l'augmentation spectaculaire de l'incidence de campylobactériose est alarmante. Cette étude vise à mieux comprendre comment la protéine XerH catalyse la réaction de recombinaison au niveau du site difH en mettant en évidence les séquences indispensables pour la liaison et le clivage. Grâce à ces expériences, nous avons pu confirmer que XerH est capable de se lier à la séquence entière difH; XerH est capable de cliver les deux brins supérieurs et inférieurs de difH avec une réaction plus efficace au niveau du brin inférieur; les nucléotides conservés du site de liaison sont indispensables pour la réaction de liaison; la modification de la longueur de l’espaceur améliore la réaction de liaison et de clivage et les modifications apportées au site de clivage prédit ont aboli la réaction de liaison et affecté la réaction de clivage au niveau du brin supérieur et inférieur du site difH. Ces expériences aideront à comprendre comment la recombinase XerH/difH contrôle la résolution des dimères chromosomiques chez Campylobacter jejuni en identifiant les séquences et les facteurs indispensables pour qu’un certain système soit fiable. Notre étude représente un pas vers l’avant pour comprendre un mécanisme important chez un agent pathogène ayant un grand impact sur la santé publique. / In bacteria with circular chromosomes, cross-over induced by homologous recombination can lead to sister chromatid exchanges, odd numbers of these exchanges result in dimerization of the two newly replicated chromatids compromising their segregation. Therefore, most bacteria use the Xer site-specific recombination system to convert chromosomal and plasmid dimers into stable monomers. This system involves two recombinases of the Tyrosine recombinase family, XerC and XerD, acting at the dif site. However, some ε-proteobacteria require only one XerH recombinase acting on a difH site. It seems interesting to study the XerH recombination system of Campylobacter jejuni, especially since the dramatic increase in the incidence of campylobacteriosis is alarming. This study aims to better understand how the XerH protein catalyzes the recombination reaction at the difH site by identifying the sequences required for binding as well as the factors regulating this reaction. As a result of these experiments, we were able to confirm that XerH is able to bind to the entire difH sequence; it is able to cleave both the top and bottom strands of difH with a more efficient reaction at the bottom strand; The conserved nucleotides in the binding site are essential for the binding reaction, modification of the spacer length improves the binding and cleavage reaction, and modifications in the predicted cleavage site abolished the binding reaction and affected the cleavage reaction at both the top and bottom strands of the difH site.. These experiments will help to understand how the XerH/difH recombinase controls the resolution of chromosomal dimers in Campylobacter jejuni by identifying the essential sequences and factors required for a certain system to be reliable. Our study represents a step forward in understanding an important mechanism in a pathogen with great impact on public health.