The progress of neuroscience is limited by the instrumentation available to it for studying the brain. At present, there is a serious instrumentation gap between functional Magnetic Resonance Imaging (fMRI) of whole brains and the microscopic scale functional imaging possible with today’s optical microscopes and electrophysiology techniques, such as patch clamping of individual neurons. This thesis describes the development of a new extension to optical microscopy that enables refocusing within 25 microseconds rather than the large fraction of a second possible by moving the sample or objective. The system is capable of refocusing a laser beam that is monitoring activity in 3D samples of live brain tissue 300 times faster than previously possible. This will make practical a new type of optical functional imaging for studying small sub-networks of neurons containing up to about 30,000 neurons at up to 30,000 sub micrometre sized monitored points of interest per second. The thesis describes the development of a detailed design for a new type of 3D scanner that uses Acousto-Optic Deflectors (AODs) to diffractively deflect and focus an intense laser beam beneath a conventional microscope objective. The fluorescence of calcium sensitive dyes in live neurons is used to monitor action potentials conveying signals between neurons. The optical and systems engineering problems and design trade-offs involved are discussed in detail. The results of extensive computer modelling are described and innovative solutions to several key optical physics based engineering problems are explained. The practical problems found in building a prototype machine incorporating these innovations are described and the encouraging first operational results from the machine reported.

Las Candidas forman uno de los grupos con mayor n´umero de hongos pat´ogenos en humanos. La relaci ´on que tienen desde un punto de vista filogen´etico demuestra que la capacidad de infectar humanos ha surgido varias veces de forma independiente en este clado. El complejo de Candida parapsilosis es ideal para investigar la aparici´on de virulencia puesto que contiene tres especies cercanas que muestran diferentes grados de virulencia y de importancia: C. parapsilosis, C. orthopsilosis y C. metapsilosis. En esta tesis presento la secuenciaci´on y posterior an´alisis de quince cepas de origen cl´ınico y medioambiental que forman parte de este clado. Cabe remarcar que los genomas de C. orthopsilosis tipo 1 y de C. metapsilosis no se hab´ıan secuenciado previamente. Nuestros resultados muestran evidencia gen´omica de la existencia de recombinaci´on, apareamiento e hibridaci´on en este clado, que previamente se habia considerado asexual. Proponemos que las cepas cl´ınicas emergieron de forma independiente en linajes de cepas encontradas en el medioambiente y una posible relaci ´on entre la hibridaci´on y la adquisici´on de caracter´ısticas relevantes para la virulencia. Finalmente, para estudiar la aparici´on de virulencia en este clado, hemos comparado, por primera vez, los genomas de las tres especies que se encuentran dentro del complejo de Candida parapsilosis. Hemos encontrado expansiones de familias g´enicas previamente implicadas en virulencia, como es el caso de las adhesinas, transportadores de membrana y enzimas extracelulares. Tambi´en hemos observado expansiones de familias de genes que hasta el momento no han estado relacionadas con virulencia. En resumen, nuestros resultados aportan una base para poder elaborar numerosas hip´ otesis sobre la aparici´on de virulencia en las especies de Candida y para que estas hip´ otesis puedan ser comprobadas posteriormente en el laboratorio. / Candida species constitute one of the most prevalent groups of fungal pathogens. From their phylogenetic relationships it is clear that virulence to humans has emerged in this clade several, independent times. The Candida parapsilosis complex is particularly suitable to investigate the emergence of virulence, with three closely-related species of varying degree of pathogenicity and of growing relevance: C. parapsilosis, C. orthopsilosis and C. metapsilosis. In this thesis I present the genome sequencing and analysis of fifteen strains from this clade, sampled from clinical and environmental sources. Notably, genomes of C. orthopsilosis Type 1 and C. metapsilosis were sequenced for the first time. Our results show for the first time the genomic evidence for the existence of recombination, mating and hybridization in this clade, previously considered asexual. We propose the independent emergence of clinical isolates from environmental lineages and a possible role of hybridization in the acquisition of relevant traits for pathogenesis. Finally, in order to gain insight into the emergence of virulence in this clade, we have compared the genomes of all three species of C. parapsilosis complex. We have found expansions in gene families known to be involved in virulence, like adhesins, membrane transporters and extracellular enzymes, as well as expansions in gene families not implicated in virulence so far. Altogether, our findings provide the grounds for numerous hypotheses about the emergence of virulence in Candida spp. and for their future experimental testing. 1

Antecedentes: La infección por el virus del papiloma humano de alto riesgo HPV (HR) es un factor necesario para las lesiones cervicales (SIL) y el cáncer cervical invasivo (ICC). En las mujeres infectadas por el HIV, la infección por HPV es más frecuente y hay un mayor riesgo de ICC. Los objetivos de este estudio son: estimar la prevalencia de HPV (HR) y de lesiones cervicales, describir la distribución de los diferentes genotipos, conocer las características clínico-epidemiológicas y de la historia de cribado de las mujeres coinfectadas por el HIV y el HPV (HR) e identificar los factores asociados a la infección por HPV (HR) y a las alteraciones citológicas en mujeres HIV positivas de Cataluña. Métodos: 479 mujeres HIV positivas provenientes de la cohorte PISCIS participaron en el estudio. Las participantes se sometieron a una exploración ginecológica, citología cervical, captura híbrida (HC2, Digene), genotipado de HPV (Roche lineal-Array PCR) y colposcopia y biopsia, si era necesario. Los datos fueron obtenidos a través de cuestionarios con variables sociodemográficas, conductuales, clínicas y de cribado. Para conocer los factores asociados se utilizó un modelo de regresión logística multivariante. Resultados: La prevalencia de infección por HPV (HR) fue de 33.2%. La prevalencia de ASCUS, LSIL y HSIL fueron 7.9%, 13.8% y 3.8%, respectivamente. Los genotipos más frecuentes fueron HPV16 (23%), HPV53 (20.3%) y HPV52 (16.2%). La frecuencia de cribado anual y la cobertura de cribado dentro de los últimos 2 años en las mujeres HIV positivas coinfectadas por el HPV (HR) fueron de 45.1% y 55.1% respectivamente. Los factores asociados a la infección por HPV (HR) fueron: la edad (OR: 0.9 IC: 0.94- 0 .99), último PAP anormal (OR: 8.2 IC: 4.0-16.9) y 1 versus > 11 PAP a lo largo de la vida (OR: 2.0 IC: 1.1-3.8). Los factores asociados a las alteraciones citológicas fueron: la primera relación sexual ≤18 años (OR: 2.3 IC: 1.1-5.0), último PAP anormal (OR: 10.3 IC: 3.5-30.1), recuento de CD4 <200 cel/mm3 versus >500 cel/mm3 (OR: 5.7 IC: 2.2-14.8) y recuento de CV >10000 copias/mL versus <400 copias/mL (OR: 3.1 IC: 1.4-6.9). Conclusiones: Se confirma en nuestro medio la elevada prevalencia de infección por HPV (HR), de lesiones cervicales y de genotipos con alto potencial oncogénico. Existe un cribado inadecuado consistente con la alta incidencia de ICC entre las mujeres HIV positivas en Cataluña. Es urgente aumentar la sensibilización entre los profesionales de la salud y las mujeres HIV positivas para optimizar la detección y prevención del ICC. Es necesario valorar en esta cohorte de manera longitudinal la asociación entre el HIV y el HPV (HR) para conocer los efectos de la terapia antirretroviral en el desarrollo y progresión de las lesiones cervicales. / Background: High-risk type Human papillomavirus HPV (HR) infection is a necessary factor for cervical squamous intraepithelial lesions (SIL) and invasive cervical cancer (ICC). In HIV infected women, HPV infection is more prevalent and a higher risk of ICC has been identified. The objectives of this study are: to estimate the prevalence of HPV (HR) and cervical lesions, describe the distribution of genotypes, to determine the clinico-epidemiological and screening history of women coinfected by HIV and HPV (HR) and identify the factors associated with HPV (HR) infection and cytological changes in HIV positive women in Catalonia. Methods: 479 HIV infected women were identified from ongoing prospective HIV infected patients cohort. Participants underwent a gynecologic examination, cervical PAP smear, hybrid-capture (HC2, Digene), HPV genotyping (Roche Linear-Array PCR) and colposcopy and biopsy, if necessary. Questionnaires on sociodemographic, behavioral, clinical and cervical cancer screening information were obtained. Multivariable logistic regression modeling was used. Results: HPV (HR) infection prevalence was 33.2%. The prevalence of ASCUS, LSIL and HSIL were 7.9%, 13.8% and 3.8% respectively. Most frequent genotypes were HPV16 (23%), HPV53 (20.3%) and HPV52 (16.2%). The frequency of annual screening and screening coverage within the last two years in HIV positive women coinfected with HPV (HR) were 45.1% and 55.1% respectively. The factors associated to HPV (HR) infection were: age (OR:0.9 CI:0.94-0.99), last PAP smear abnormal (OR:8.2 CI:4.0-16.9) and 1 versus >11 PAP smear lifetime (OR:2.0 CI:1.1-3.8). The factors associated to abnormal cytology were: first sexual intercourse ≤ 18 years (OR: 2.3 CI: 1.1-5.0), the last PAP abnormal (OR: 10.3 CI: 3.5-30.1), CD4 count <200 cells/mm3 versus > 500 cells/mm3 (OR: 5.7 CI: 2.2-14.8) and CV count > 10000 copies/ mL versus <400 copies / mL (OR: 3.1 CI: 1.4-6.9). Conclusion: It is confirmed in our area the high prevalence of HPV (HR) infection, cervical lesions and genotypes with high oncogenic potential. The history of poor cervical cancer screening found is consistent with the high incidence of ICC among HIV infected women in Spain. It is urgent to increase awareness among both health professionals and HIV infected women to optimize the screening and prevention of ICC. It is necessary a longitudinal assessment in this cohort to know the association between HIV and HPV (HR) to determine the effects of antiretroviral therapy in the development and progression of cervical lesions.

La infecció pel virus de la immunodeficiència humana (VIH) provoca una deficiència progressiva del sistema immunològic, caracteritzada per una destrucció massiva de les cèl•lules T CD4 i, una activació i inflamació immune mantinguda. La Teràpia Antiretroviral de Gran Activitat (o TARGA) indueix una supressió sostinguda de la replicació viral en individus infectats pel VIH, i una reducció de l’activació immune, encara que no es normalitza comparat amb individus no-infectats. Les causes d’aquesta activació immune persistent malgrat la supressió viral són encara desconegudes. Els nostres resultats demostren una dicotomia en les forces que indueixen l’activació immune en els limfòcits T CD4 i CD8 en individus suprimits per la TARGA. La replicació residual del VIH indueix l’activació immune en les cèl•lules T CD8. Per aquest motiu, la intensificació de la TARGA amb raltegravir produeix una reducció específica però reversible de l’activació de les cèl•lules CD8; i per tant, aquestes cèl•lules semblen ser sensors de la replicació viral (en particular l’expressió de CD38). Curiosament, l’expressió de CD38 està sota el control dels interferons de tipus I, el que suggereix que el virus també controla altres respostes inflamatòries, i que aquestes respostes estan íntimament lligades als marcadors d’activació de les cèl•lules T CD8. Contràriament, en individus tractats, la persistència viral té pocs efectes en el compartiment de cèl•lules T CD4, que encara pateix les conseqüències de la depleció pre-TARGA i que determina la recuperació immune. De fet, l’activació de cèl•lules CD4 no es redueix després d’un any de intensificació amb raltegravir. En canvi, la resposta homeostàtica a la depleció de cèl•lules CD4 sembla induir l’activació en aquest compartiment, especialment en pacients tractats que presenten una resposta immunològica deficient malgrat una supressió viral completa (pacients immunodiscordants). Els nostres resultats demostren que els pacients immnodiscordant tenen un menor producció de novo de cèl•lules T CD4, i una major translocació microbiana, activació i mort cel•lular comparat amb pacients amb una bona recuperació immune; malgrat aquestes diferències la immunodiscordància sembla està associada a l’increment de la destrucció cel•lular. L’activació i inflamació persistent en aquests individus procura un ambient que accelera la l’esgotament de les cèl•lules T CD4 i la immunosenescència de la resta del sistema immunològic, contribuint a llarg termini amb les co-morbiditats i l’envelliment prematur. Per aquest motiu, és important determinar les causes de l’activació immune incrementada (i mort cel•lular), per definir les estratègies terapèutiques que poden ser útils per millorar la recuperació immune. / Human immunodeficiency virus (HIV-­‐1) infection causes a progressive impairment of the immune system, characterized by a massive CD4 T-­‐cell depletion and sustained immune activation and inflammation. Highly active antiretroviral therapy (HAART) induces a sustained effective suppression of viral replication in HIV-­‐infected subjects and reduces immune activation, but does not normalize it. The causes of this persistent immunehyperactivation despite viral suppression remain unknown. Our results show a dichotomy between CD4 and CD8 T-­‐cell driving forces of immune activation in HIV-­‐infected HAART-­‐suppressed individuals. The low (but detectable) levels of residual replication drive immune activation in CD8 T-­‐cell compartment. Therefore, raltegravir intensification of HAART results in specific and reversible reduction of CD8 T-­‐cell activation, which seems to be a sensor of replication events (in particular CD38 expression). Interestingly, CD38 expression is under the control of Type I IFN, suggesting that the virus also controls inflammatory responses and that these responses are intimately linked to CD8 T-­‐cell activation markers. Conversely, in treated individuals, viral persitence has low effects on CD4 T-­‐cell compartment, which still show the consequences of pre-­‐HAART depletion and determine immune recovery. In fact, CD4 T-­‐cell activation is not reduced after one year of raltegravir intensification. Instead, the homeostatic response to CD4 T-­‐cell depletion might drive activation in this compartment, particularly in HAART-­‐treated individuals with satisfactory virological response but poor immune recovery (immunodiscordant subjects). Our results suggest that, even though immunodiscordant individuals showed lower CD4 T-­‐cell production and higher microbial translocation, activation and cell death, immunodiscordance seems to be related to increased cell-­‐destruction of CD4 T-­‐cells. The persistent immune activation and inflammation in these subjects provide a milieu of accelerated immunoexhaustion of CD4 T-­‐cells and immunosenescence of the whole immune system, contributing to long-­‐term co-­‐morbidities and accelerated ageing observed in these subjects. Therefore, determining the causes of this increased hyperactivation and cell-­‐death may be important for the development of therapeutic strategies aiming to improve immune recovery.

Over the last half century, the saltmarshes of south east England have undergone an extensive decline, especially the pioneer zone vegetation. These losses have generally been blamed on coastal squeeze resulting from sea level rising against sea walls. There is little evidence to support this hypothesis however, and an alternative hypothesis, based on infaunal invertebrates preventing the establishment of saltmarsh plants was tested. In the managed realignment site at Tollesbury, and the other sites examined, the mudflat fauna was dominated by Nereis (= Hediste) diversicolor and Hydrobia ulvae. In laboratory experiments N. diversicolor and H. ulvae reduced the production of seedlings from seeds of Salicornia europaea agg.. Conversely the presence of S. europaea agg. significantly reduced the normal burrowing activity of N. diversicolor. Invertebrate exclusion experiments established at five sites in south east England facilitated colonisation by saltmarsh plants at some sites (Orplands, the Blythe Estuary, Wallasea Island and Maldon), by excluding large (>3cm) N. diversicolor. However, at the Tollesbury realignment site, the high rate of sediment deposition and the relatively long distance to a source of seeds prevented plant colonisation. This study supports the hypothesis that establishment of saltmarsh vegetation is prevented by infaunal invertebrates,particularly N.diversicolor, which exclude plants through bioturbation, herbivory and granivory. These interactions may help explain the loss of saltmarshes and will reduce the success of future managed realignment schemes which depend upon the colonisation of new intertidal areas by saltmarsh vegetation. Further management of realignment sites will be necessary to encourage saltmarsh development.

Translation control is a vital aspect of gene expression for both viruses and their cellular hosts. We have previously shown that the cellular mRNA decay activators Dhh1 and Lsm1-7 promote translation of positive-strand RNA [(+)RNA] viral genomes and their subsequent transport from the cellular translation machinery to replication complexes, a process that requires translation repression. These key steps in the replication of all (+)RNA viruses require profound rearrangements of the viral ribonucleoprotein (RNP) composition. How cellular decapping activators promote translation and replication of viral genomes remains unknown. Using the replication of the Brome mosaic virus in yeast, a fruitful model system for (+)RNA viral replication, we show that Dhh1 and Lsm1-7 function differentially in viral RNA translation and replication by assembling alternative mRNP complexes. The dependence on Dhh1 for viral RNA translation initiation is mediated by specific cis-acting sequences in the viral UTRs and a stem-loop in the ORF. Excitingly, by ribosome profiling analyses we identify a specific subset of cellular mRNAs that also depends on Dhh1 for translation. These mRNAs have as (+)RNA genomes long 5´UTR and highly structured 5´UTRs and ORFs. Moreover, they are enriched in mRNAs related to ribosome biogenesis. Interestingly, ribosome biogenesis is often altered in cancer cells and we and others determine that DDX6, the human ortholog of Dhh1, is indeed overexpressed in pancreatic and colon cancer. In conclusion, our results demonstrate that components of the cellular decapping machinery have a broad function in translational regulation. This enables fast fine-tuning of gene expression in response to perturbations. / El control de la traducción es un aspecto vital de la expresión génica tanto para los virus como para sus huéspedes celulares. Nuestro laboratorio ha demostrado que los activadores de la degradación del ARN mensajero celular, Dhh1 y Lsm1-7, promueven la traducción de los genomas de virus de ARN de cadena sencilla y polaridad positiva [(+)ARN] así como su transporte desde la maquinaria de traducción celular a los complejos de replicación, un proceso que necesita represión de la traducción. Estos pasos clave en la replicación de todos los virus (+)ARN requieren de una profunda reorganización en la composición de la ribonucleoproteina (RNP) viral. Cómo los activadores del decapping celular promueven la traducción y replicación de los genomas virales aún es desconocido. Utilizando la replicación del virus del mosaico del Bromus en levadura, un modelo muy usado para el estudio de la replicación de virus (+)ARN, hemos demostrado que Dhh1 y Lsm1-7 funcionan de manera distinta en la traducción y replicación del ARN viral mediante el ensamblaje de complejos alternativos de RNP. La dependencia de Dhh1 para la iniciación de la traducción del ARN viral está mediada por secuencias específicas cis-acting localizadas en las regiones no traducidas (RNTs) del virus y un stem-loop en el marco de lectura. Sorprendentemente, mediante el uso del ribosome profiling hemos identificado un grupo específico de ARN mensajeros celulares que también dependen de Dhh1 para su traducción. Estos ARN mensajeros tienen, como los genomas de los virus (+)ARN, 5’RNT largos y altamente estructurados, así como marcos de lectura altamente estructurados. Además, entre ellos abundan los ARN mensajeros relacionados con biogénesis ribosomal. Es interesante mencionar que la biogénesis ribosomal está normalmente alterada en células cancerosas y nosotros, y otros grupos, hemos determinado que DDX6, el ortólogo en humanos de Dhh1, está sobreexpresado en cáncer pancreático y de colon. En conclusión, nuestros resultados demuestran que componentes de la maquinaria de decapping celular tienen una amplia función en la regulación de la traducción. Este hecho permite un rápido y preciso ajuste de la expresión génica en respuesta a perturbaciones.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS) / Los receptores de la familia SLAM se encuentran expresados diferencialmente en la superficie de los leucocitos y juegan un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa. En este trabajo se demuestra que el citomegalovirus (CMV) murino reduce específicamente la expresión de determinados miembros SLAM en la superficie de los macrófagos infectados. Mediante el escrutinio de un panel de mutantes de deleción del CMV murino se ha identificado m154 como el producto viral que modula la expresión del receptor SLAM CD48, el cual constituye el ligando de alta afinidad de CD244, una molécula involucrada en la regulación funcional de las células NK y T citotóxicas. Se muestra que m154 es una proteína tipo mucina, que se expresa con una cinética temprana y se localiza en la superficie de la célula infectada. La proteína viral actúa a través de un mecanismo que implica la degradación de CD48, siendo capaz de interferir con la respuesta citotóxica de las células NK desencadenada por la infección de los macrófagos por el CMV murino. Finalmente, demostramos en el modelo murino, que m154 le proporciona al virus protección in vivo frente al ataque de las células NK. Estos hallazgos contribuyen a un mejor entendimiento de la patogénesis del CMV y proveen un nuevo ejemplo de evasión de la inmunidad innata del huésped desarrollado por CMV. / The signalling lymphocyte-activation molecules (SLAM) family of receptors encompasses a number of proteins expressed on the surface of leukocytes that play critical roles in both innate and adaptive immunity upon engagement through homotypic or heterotypic interactions amongst them. In this study, we show that murine cytomegalovirus (MCMV) drastically downregulates several SLAM receptors during the course of the infection of macrophages, in a manner dependent on viral gene expression. By screening a battery of MCMV deletion mutants, we have identified m154 as an immunoevasin that effectively reduces the cell surface expression of the SLAM family member CD48, a high affinity ligand for natural killer (NK) and cytotoxic T cell receptor CD244. m154 is a mucin-like protein, expressed with early kinetics, that can be localized predominantly at the cell surface of the infected cell. During infection, m154 leads to proteolytic degradation of CD48, primarily via a proteasomal dependent mechanism. This viral protein interferes with the NK cell cytotoxicity triggered by MCMV infected macrophages. In addition, we demonstrate that mutant MCMVs lacking expression of m154 result in an attenuated phenotype in vivo which can be substantially restored after NK cell depletion of mice. Thus, we present here a novel tactic of cytomegalovirus to subvert detection by NK cells during acute infection, based on the modulation of a SLAM family member.

Tesi realitzada a l'Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC) i a l'Institut de Recerca Biomèdica de Barcelona (IRBB) / Picornaviridae are among the most diverse and oldest known viral families that include many important pathogens of humans and animals. They are small, icosahedral (+)ssRNA viruses, causing a variety of diseases, such as encephalitis, and poliomyelitis. Vaccines are available for poliovirus, hepatitis A virus and foot-and mouth disease virus, but no effective prophylaxis is implemented for other picornaviruses. Thus far, anti-viral research has focused on the capsid, whereas inhibitors targeting non-structural proteins (i.e. proteases, helicases, polymerases) have remained largely unaddressed. The project was focused on structural and biochemical characterization of the enterovirus-B93 (EVB93) 3C protease alone and in complex with several covalent inhibitors. The second objective was to identify the first non-covalent potent inhibitors of the EV-B93 3C protease and their further biochemical, antiviral, and structural evaluation. This work studied the in-vitro proteolytic activity of the EV-B93 3C protease, alone and in the presence of two known covalent inhibitors - rupintrivir and compound 1, as well as three low molecular weight covalent inhibitors - NZO, NZN and DB5_60. The crystal structures of the EV-B93 3C protease alone and in complex with rupintrivir, compound 1, and NZN molecule were solved at high resolution (1.57, 1.50, 1.32, and 1.73 Å, respectively). The structures revealed that the protein adapts a chymotrypsinlike fold similarly to other picornavirus 3C proteases and possesses His-40, Glu-71 and Cys-147 as a catalytic triad. The STD NMR-based fragment screening was performed to select non-covalent binders of the EV-B93 3C protease. Validation and profiling of the most promising non-covalent hits were done using thermal shift assay (TSA), surface plasmon resonance (SPR), and proteolytic activity assay. 44 analogs of the most potent molecule were evaluated in the in-vitro proteolytic activity assay. The most active compound displayed IC50 value of 5 flM. Further chemical optimization was performed resulting in more efficient inhibitor with similar IC50 value. Selected analogs were tested in the in-vitro proteolytic assay against analogous 3C proteases from the following viruses: human rhinovirus-A49, enterovirusD68, aichivirus A, porcine sapelovirus, and equine rhinitis B virus. All compounds exhibited good inhibitory activity against three of the tested proteases. Furthermore, in a cell-based proteolytic assay and an antiviral assay the compounds did not exhibit either proteolytic or antiviral activity, which may be explained by several factors such as lack of cell permeability, low solubility and/or high toxicity. Extensive co-crystallization and soaking trials were performed to obtain crystal structures of noncovalent complexes of the EV-B93 3C protease with the most potent compounds. Regrettably, no additional electron density was identified in the proteolytic active site. Bioinformatics docking simulations suggested potential binding mode of the optimized compound. These pointed to the presumed pockets occupied by the compound that interact with the two conserved residues from the catalytic triad. Since the most potent compound is a relatively large and rigid molecule, it is unable to bind to the protease without its previous rearrangement, which is unfavorable in the crystalline state of the protein. This observation may explain the inability of the non-covalent molecules to co-crystallize with EV-B93 3C protease. The results obtained in this study may aid the design of potent, noncovalent antivirals targeting enteroviral 3C proteases. / Los Picornaviridae son una de las familias de virus más diversas y conocidas desde hace más tiempo. Esta familia incluye importantes agentes patógenos que afectan a humanos y a animales. Los Picornaviridae son virus pequeños, icosaédricos, de ARN de cadena sencilla de sentido positivo y causan una gran variedad de enfermedades, tales como encefalitis y poliomielitis. Se dispone de vacunas para el poliovirus, el virus de la hepatitis A y el virus de la fiebre aftosa, pero no se ha implementado ninguna profilaxis efectiva para otros picornavirus. Hasta ahora, la investigación antiviral se ha centrado en la cápside, mientras que los inhibidores dirigidos a proteínas no estructurales (como las proteasas, las helicasas y las polimerasas) están todavía por explorar. Este proyecto se centró en la caracterización estructural y bioquímica de la proteasa 3C de enterovirus B93 (EV-B93) y de los complejos de esta proteasa con varios inhibidores covalentes. El segundo objetivo fue conseguir inhibidores no covalentes de la proteasa EV-B93 3C y realizar una caracterización bioquímica, antiviral y estructural de los complejos de EV-B93 3C con estos inhibidores.

En el primer capítulo de esta Tesis se ha realizado un estudio de la variabilidad genética y evolución del virus del moteado de la parietaria (PMoV). El análisis filogenético mostró que los aislados italianos se agrupaban en el clado I aislados españoles se agrupaban en los clados II, III y IV. El aislado griego GrT-1 estudiado formaba parte del clado IV en el árbol filogenético de la CP mientras que en el árbol filogenético de la 2b aparecía como un aislado independiente. La diversidad nucleotídica de los genes que codifican para las proteínas 2b y CP fue baja, aunque más alta que la observada en otros ilarvirus. La distribución de las sustituciones sinónimas (S) y no sinónimas (N) reveló que las proteínas 2b y CP se encontraban bajo presión de selección purificadora, con unas pocas posiciones bajo selección diversificadora. También se detectaron fenómenos de intercambio genético entre algunos aislados españoles, probablemente como resultado de reordenamientos entre los segmentos genómicos de éstos. Se caracterizó biológica y molecularmente el aislado del PMoV T32. Se observó que T32 era un patotipo y genotipo diferente al aislado español CR8. El análisis de secuencia de los RNAs genómicos del aislado T32 y de las secuencias aminoacídicas de las proteínas mostró diferentes dominios conservados. La CP del aislado T32 tenía 16 aminoácidos menos que la CPs de los otros dos aislados italianos (Pe1 y ST-1) como consecuencia de la delección de un nucleótido (citosina). Finalmente, el análisis de las substituciones N y S indicó que todas las regiones genómicas del aislado T32 estaban sometidas a una presión de selección negativa o purificadora. Posteriormente se estudió la implicación de la proteína 3a (MP) de PMoV en el movimiento célula-a-célula del virus. Se observó la presencia de dos regiones hidrofílicas no contiguas (R1 y R2) con un alto contenido de aminoácidos básicos lisinas (K) y argininas (R) y una estructura secundaria en α-hélice. Además, se demostró que ambas regiones tenían capacidad de unión al RNA de manera independiente. Mediante un análisis mutacional se observó que la pérdida de los aminoácidos básicos de estas regiones interfería con el movimiento intercelular del virus. Los estudios de localización subcelular mostraron que la MP nativa de PMoV se localizaba en los PDs mientras que las MPs a las que se les había quitado los aminoácidos básicos perdían parcial o totalmente la capacidad de localizarse en los PDs. Los ensayos llevados a cabo con una construcción recombinante que contenía el RNA 3 del virus del mosaico de la alfalfa (Alfalfa mosaic virus, AMV) y a la que se le había reemplazado la MP por la del PMoV mostraron que la acumulación de la MP en los PDs es esencial para el movimiento intercelular del virus. Finalmente, se estudió la implicación de las proteínas 2b, MP y CP del PMoV en la patogenicidad del virus y el posible mecanismo de inducción de síntomas (factores de potogenicidad o avirulencia). Se observó que la CP de PMoV indujo fuertes síntomas de enanismo, mosaico y enrollado foliar en plantas de Nicotiana benthamiana, mientras que la MP y la 2b de PMoV indujeron únicamente síntomas de enrollado foliar y mosaico. El análisis para determinar si las proteínas CP, 2b y MP de PMoV eran supresores de silenciamiento génico (Viral suppressors of RNA silencing, VSRs), mediante una construcción genética basada en la secuencia genética del virus del arrugado del nabo (TCV) mostraron que ni la CP, MP ni la 2b de PMoV eran capaces de restablecer el movimiento de la construcción de TCV, sugiriendo que ninguna de ellas tenía actividad VSR. / In the first Thesis chapter , we have studied the genetic variation and evolution of parietaria mottle virus (PMoV). Phylogenetic analysis showed that the Italian isolates clustered in the clade I and the Spanish isolates clustered in the clades II, III and IV. The studied isolate GrT-1 from Greece clustered in the clade IV for the CP phylogenetic tree whereas it fell out as an individual isolate for the 2b phylogenetic tree. The nucleotide diversity was low as for other plant viruses, but higher than that for other ilarviruses. The distribution of synonymous (S) and non synonymous (N) substitutions revealed that 2b and CP were under strong purifying selection with some positions under diversifying selection. These results suggest that both genes are under evolutionary constrains probably as a consequence of the essential roles played on the virus life cycle. In addition, we have detected some events of genetic exchange, probably by reassortement of different genomic segments between PMoV Spanish isolates. A molecular and biological characterization of the PMoV isolate T32 was performed. The results obtained suggested that this PMoV isolate is a different pathotype and genotype respect to the Spanish isolated CR8 and Italian isolate Pe1. Nucleotide sequence analysis of the T32 genomic RNAs and the encoded putative proteins showed different conserved motifs. The CP of isolate T32 showed a nucleotide (cytosine) deletion that resulted in a different start codon rendering a CP which was 16 amino acids shorter than those of the Italian isolates (Pe1 and ST-1). Finally, the analysis of N and S substitutions indicated a negative or purifying selection pressure for all genomic regions. Later, the role of 3a (MP) protein in the virus cell-to-cell movement was studied. In silico analysis revealed the presence of two hydrophilic non-contiguous regions (R1 and R2) with many basic amino acids: lysines (K) and arginines (R), and a secondary structure in α-helix. Results of Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) showed that both R1 and R2 regions were able to bind RNA in an independent manner. Mutational analysis showed that K and R basic amino acids of these regions were essential for virus cell-to-cell movement. The assays carried out to determine the subcellular localization of PMoV MP reveled that the wild-type MP was located in the PDs whereas the MP mutants which the basic amino acids were removed, lost total or partially the ability to accumulate in the PDs. Assays with a recombinant construction containing the RNA 3 of Alfalfa mosaic virus (AMV) whose MP was replaced with those of PMoV showed that MP localization in the PDs was essential for the intercellular virus movement. Finally, the role played for the CP, MP and 2b proteins of PMoV in the development of infection symptoms (pathogenicity or avirulence factors) was studied. The PMoV CP induced strong symptoms of stunting, mosaic and leaf deformation in Nicotiana benthamiana plants, while PMoV MP and 2b proteins induced only leaf deformation and mosaic symptoms. The analysis to determine if PMoV CP, MP and 2b proteins act as suppressors of RNA silencing (VSRs) through a viral vector based on the Turnip crinkle virus (TCV) showed that neither CP, MP or 2b proteins were able to suppress the genic silencing mechanism. These results showed that suppression of RNA silencing pathway could not be implied on symptoms induction in N. benthamiana plants by CP, MP or 2b proteins of PMoV.

La Malaltia Inflamatòria Intestinal (IBD) engloba un grup de malalties (com la CD i la UC) que es caracteritzen per una inflamació crònica del tub digestiu. La IBD requereix un tractament mèdic i farmacològic a mida, i tot i que actualment existeixen diferents teràpies que permeten millorar la qualitat de vida dels pacients, cap d’aquestes aconsegueix eliminar totalment la malaltia. La teràpia gènica és una de les disciplines de la biomedicina amb més futur pel tractament de malalties d’origen genètic, però també en malalties en que la patologia no està determinada per un sol gen sinó que hi ha una alteració de la homeòstasis del sistema, com en càncer, malalties cardiovasculars o malalties neurològiques. Per tant la teràpia gènica sembla una alternativa prometedora per administrar localment a l’intestí una teràpia per a la IBD. Dintre de la família dels adenovirus, els vectors més utilitzats en teràpia gènica, hi ha el subgrup F (Ad40 i Ad41) amb tropisme intestinal. Aquests adenovirus es caracteritzen per la presència de dos fibers de diferent mida i pel seu pobre creixement in vitro. Mitjançant el pseudotipatge, es pot substituir els gens que codifiquen la proteïna fiber de l’Ad5, un dels vectors més utilitzats en teràpia gènica, per gens que codifiquen per la proteïna fiber curta de l’Ad40. D’aquesta manera, a més de canviar el tropisme natural de l’Ad5 pel tropisme del nou fiber, es millora la seva producció i es facilita la clonació de gens terapèutics. Així doncs, ens vam proposar caracteritzar i analitzar el potencial terapèutic d’adenovirus quimèrics 5/40 de tropisme específic intestinal per a la futura aplicació com vectors de teràpia gènica per a la Malaltia Inflamatòria Intestinal. En la primera part d’aquest treball ens vam centrar en caracteritzar els vectors quimèrics per tal de determinar les possibilitats reals per convertir-se en vectors de teràpia gènica. En primer lloc es va optimitzar el protocol de producció dels vectors, augmentant l’eficiència de 2-4 a 20 i 25 vegades per cada cicle, i es va estudiar quines noves característiques conferia el fiber curt de l’Ad40 a les partícules de l’Ad5. En la segona part es va avaluar la capacitat dels vectors quimèrics com a vectors de teràpia gènica a l’intestí. Es va comprovar que la presència del fiber augmentava la resistència a pH àcid dels vectors (tot i que no a proteases) i es va estudiar la biodistribució i bioseguretat d’aquests vectors en ratolins per tres vies diferents: oral, rectal i intravenosa mitjançant la quantificació de l’expressió de β-gal per luminometria i l’anàlisi histològic i immunohistoquímic de la transfecció adenoviral. Els resultats van mostrar que els adenovirus quimèrics administrats per la via rectal eren més eficients que l’Ad5, transfectant cèl·lules epitelials en vellositats i criptes intestinals, cèl·lules enteroendocrines i macròfags locals de la mucosa intestinal. Un cop avaluada la capacitat dels adenovirus quimèrics d’infectar l’intestí de ratolins sans, es va procedir a avaluar si mantenia la seva infectivitat en un model murí de MMI, escollint el model de colitis induïda per DSS. En la tercera part d’aquest treball es van generar nous vectors quimèrics que permetessin la clonació fàcil i ràpida de qualsevol gen terapèutic. En resum, en aquest treball demostrem que amb el pseudotipatge del fiber curt de l’Ad40 es transfereixen moltes de les característiques singulars dels Adenovirus entèrics, i es proposa un protocol optimitzat per a la seva producció a nivells equivalents als de l’Ad5. Els nostres resultats també suggereixen que l’adenovirus quimèric F/40S es un excel·lent candidat com a vector estratègia de teràpia gènica per a l’administració de gens terapèutics a l’intestí de manera local. / Inflammatory Bowel Disease (IBD) comprises a group of diseases (such as CD and UC) characterized by a chronic inflammation of the digestive tract. The IBD requires a personalized medical and pharmacological approach, and although currently there are different therapies to improve the quality of life of patients, none of these has healed the disease. Gene therapy is one of the most promising biomedical disciplines for the treatment of genetic diseases, but also for other diseases in which the pathology is not determined by a single gene, but there is an alteration of the homeostasis of the system, such as cancer, cardiovascular disease and neurological diseases. Therefore, gene therapy seems a promising alternative to administer local therapy in the intestine for IBD. Within the family of adenovirus vectors, the most used vectors in gene therapy, there is subgroup F adenovirus (Ad40 and Ad41) with intestinal tropism. These adenoviruses are characterized by the presence of two different size fibers and its poor growth in vitro. By pseudotyping technique, you can replace the genes encoding the Ad5 fiber protein, one of the most used adenoviral vector, for the genes encoding the protein of Ad40 short fiber. Thus, besides changing the natural tropism of Ad5 tropism by the new fiber, it improves production and simplify the cloning of therapeutic genes. Therefore, we decided to analyse and characterize the therapeutic potential of chimeric adenovirus 5/40 specific intestinal tropism for future use as gene therapy vectors for Inflammatory Bowel Disease. In the first part of this work, we focused on characterizing the chimeric vector to determine the real possibilities to become gene therapy vectors. Firstly, we optimize the protocol for the vectors production, increasing the efficiency from 2-4 times to 20 and 25 times per cycle, and we studied what new features the Ad40 short fiber transferred to Ad5 particles. In the second part, we evaluate the ability of chimeric vectors as gene therapy vectors in the intestine. We found that the presence of fiber increased vectors resistance to acidic pH (but not to proteases) and we studied the biodistribution and biosafety of these vectors in mice by three different routes: oral, rectal and intravenous by quantifying the expression of β-gal luminometry and by histology and immunohistochemistry analysis of adenoviral transfection. The results showed that the chimeric adenovirus administered by rectal route were more efficient than Ad5, transfecting intestinal epithelial cells in villi and crypts, and enteroendocrine cells and local macrophages in intestinal mucosa. After evaluating the ability of chimeric adenovirus to infect the intestines of healthy mice, we proceeded to assess their infectivity capacity in a MMI animal model of MMI, choosing the model of DSS-induced colitis mice. In the third part of this work, we generate new chimeric vectors that allow easy and fast cloning of any therapeutic gene. In summary, this work shows that the short fiber of the Ad40 pseudotipying transferred many of the unique characteristics of enteric adenovirus, and it proposes an optimized protocol for production levels equivalent to the Ad5. Our results also suggest that the chimeric adenovirus F/40S is an excellent candidate as a gene therapy vector for for the local administration of therapeutic genes in the gut