Reza A. Ghanbari. / Includes bibliographical references (p. 128-134). / Supported in part by the Joint Services Electronics Program. DAAL03-92-C-0001 Supported in part by the National Science Foundation. ECS 90-16437 Supported in part by the U.S. Air Force Office of Scientific Research.

Els adenovirus oncolítics són uns nous agents antitumorals molt prometedors gràcies a la seva capacitat d'autoamplificar-se selectivament a la massa tumoral. Els assajos clínics realitzats fins a la data amb una primera generació d'aquests agents han indicat la necessitat d'una millora substancial de la capacitat antitumoral, sense descuidar però els possibles efectes adversos de la replicació als teixits normals. Una de les limitacions més importants d'aquesta teràpia és la incapacitat del virus per travessar les barreres estructurals que imposen les cèl·lules de l'estroma i la matriu extracel·lular del tumor. L'expressió de transgens que destrueixin aquestes barreres és una estratègia que s'ha mostrat molt prometedora per superar aquesta limitació i augmentar així l'activitat antitumoral. Per aconseguir aquest propòsit, cal optimitzar la maquinària d'expressió i el genoma de l'adenovirus oncolític on els transgens seran inserits per compatibilitzar l'expressió del transgen amb el cicle viral de l'adenovirus, i mantenir la mida del genoma dintre del límit que imposa la capacitat d'encapsidació dels adenovirus. En aquest treball, s'explora l'ús de caixes palindròmiques d'unió del factor de transcripció E2F per augmentar la selectivitat i la potència d'adenovirus oncolítics. En un primer virus construït, aquestes caixes van aconseguir augmentar significativament l'activitat antitumoral, tant in vitro com in vivo, però la combinació d'elements genètics presents en aquest virus augmentava molt la mida del genoma i no va permetre la introducció d'un transgen per superar les barreres presents als tumors. En un segon virus, l'optimització dels elements genètics va permetre aconseguir un virus que, gràcies a les caixes d'unió d'E2F, presentava un baix perfil de toxicitat i una gran potència antitumoral, fins i tot superior a la dels adenovirus salvatges. A més, la mida tan reduïda del seu genoma permet una expressió eficient i potent de transgens. Addicionalment, en aquest treball també s'analitzen els possibles beneficis de selectivitat i potència que poden tenir dos modificacions genètiques, la mutació T1 i la fibra RGDK, descrites amb anterioritat pel nostre grup. Tot plegat, aquest treball analitza la millor combinació possible d'elements genètics per aconseguir una bona base que permeti la construcció d'un futur adenovirus potent, selectiu i amb capacitat per destruir les barreres estromals dels tumors, superant així les limitacions més importants de la teràpia adenoviral del càncer i presentant-se com un ferm candidat a ser testat en futurs assajos clínics. / Conditionally Replicating Adenoviruses (CRADs) are novel antitumor agents due to their ability to self-amplify at the tumour site. Clinical trials performed with a first generation of these agents pointed out a critical need of improved antitumor activity, without overlooking concerning adverse effects of replication in normal tissues. However, one of the main limitations of this therapy is the inability of CRADs to overcome the barriers imposed by tumour stroma, including stromal cells and extracellular matrix. Transgene expression is valuable strategy to counteract these limitations and to enhance antitumor activity. For this purpose, the genetic backbone in which the transgene is inserted should be optimized to render transgene expression compatible with the adenovirus replication cycle and to keep genome size within the encapsidation size limit. In this work, we explore the use of palindromic E2F-binding sites to enhance the selectivity and the potency of CRADs. In a first virus, the insertion of these sites in an E2F-1 promoter controlling the expression of the E1A protein resulted in a significant increment in the oncolytic activity, both in vitro and in vivo. However, the unique combination of genetic elements present in this virus hindered the incorporation of transgenes to overcome stromal barriers. In a second virus, the insertion of E2F-binding sites into the endogenous E1A promoter allowed to solve this limitation. The insertion of these sites results in a low systemic toxicity profile in mice. Importantly, the E2F-binding sites also increased the cytotoxicity and the systemic antitumor activity relative to wild-type adenovirus in all cancer models tested. Furthermore, the constrained genome size of this backbone allows an efficient and potent expression of transgenes. In addition to this, in this work we also test the benefits in selectivity and potency of two previous mutations reported by our group, the T1 mutation and the RGDK fibre. All together, this thesis analyzes the best possible combination of genetic elements to achieve an adenoviral backbone that permits the design of a future CRAD, potent, selective and capable of destroy tumour stromal barriers, overcoming the main limitations of cancer virotherapy and constructing a firm candidate to be tested in future clinical trials.

Estudis previs duts a terme en el nostre laboratori han caracteritzat estructuralment i fenotípicament el bacteriòfag SE1. Aquest bacteriòfag presenta una elevada freqüència de transducció, capaç d'infectar S. enterica, serovar Enteritidis i serovar Typhimurium. Seguint aquesta línea d'investigació, el present treball s'ha plantejat ampliar la descripció genètica d'aquest bacteriòfag i caracteritzar les diferents funcions del fag SE1 en estat de lisogènia, tals com la conversió lisogènica, la integració i el seu regulador o interruptor genètic .La seqüenciació del genoma del bacteriòfag SE1, a partir d'una genoteca fàgica o per walking directament sobre el genoma, ha permès determinar que té una llargària de 41.941 pb, que es concreta en 67 orf. La comparació amb la base de dades GenBank ha revelat que aquest fag, com d'altres fags lambdoides, és un mosaic genètic resultat de recombinacions i transferències horitzontals amb d'altres bacteriòfags. La seqüència obtinguda va permetre mostrar que la deficiència en l'extrem carboxi terminal periplasmàtic de la proteïna codificada per un dels gens de conversió lisogènica (GtrC) podria ser la causa per la qual el bacteriòfag P22 podria infectar una cèl·lula lisògena per al bacteriòfag SE1.A més, en el present treball s'han determinat les seqüències dels operadors de la regió reguladora que interaccionen amb la proteïna cI de l'interruptor o regulador genètic. A través d'assaigs de retard electroforètic (EMSA) i de footprinting s'ha definit la seqüència consens dels motius d'unió dels operadors a la proteïna cI: AtAN3tTN3TATT.D'altra banda, l'anàlisi de la composició de la unitat transcripcional del gen cI per RT-PCR va permetre determinar que el gen orf23 en formava part. La proteïna Orf23 seria un potencial regulador membre de la superfamília de les ATPases involucrades en la partició genòmica. Mutants defectius en aquest gen presenten un increment de la inducció del cicle lític en presència de mitomicina C, la qual cosa indica que aquesta proteïna podria ser un modulador de la proteïna cI o que podria haver-hi una interacció entre la proteïna Orf23 i la proteïna cI. Aquesta és la primera vegada que es caracteritza una proteïna d'aquesta família d'ATPases en un bacteriòfag que s'integra en el genoma del seu hoste. / Carried out previous studies in our laboratory have characterized structurally and phenotipically the bacteriophage SE1. This bacteriophage presents a high frequency of transduction; it is able to infect S. enterica, to serovar Enteritidis and to serovar Typhimurium. Continuing this line of investigation, in the present work we have considered to extend the genetic description of this bacteriophage and to characterize different functions from phage SE1 in lysogen state, such as the lysogenic conversion, integration and its regulator or genetic switch. The sequencing of the bacteriophage SE1 genome, from its genotec or by walking directly on the genome, has allowed us to determine that it has a 41,041 pb of length, that takes shape in 67 orfs. The comparison with the data base of the GenBank has revealed that this phage, like other lambdoids phages, is a genetic mosaic result of recombination and horizontal transferences with other bacteriophages. The obtained sequence allowed us to show that the deficiency in the periplasmatic carboxi terminal end of the protein (GtrC) codified by one of the genes of lysogenic conversion could be the cause by which the bacteriophage P22 would be able to infect a lysogen cell by bacteriophage SE1. In addition, in the present work, the sequences of operators of regulating region have been determined, which interact with protein cI of the switch or genetic regulator. Through tests of electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and footprinting consensus sequence for union of operators to protein cI has been defined: AtAN3tTN3TATT. On the other hand, analysis of the composition of gene cI transcriptional unit by RT-PCR allowed us to determine that the gene orf23 comprised of the same one. The Orf23 protein is a regulating potential member of the superfamily of the ATPases involved in the genomic partition. Defective mutants in this gene present an increase of the induction of the lytic cycle in presence of mitomicina C, this indicates that this protein could be a modulator of the protein cI or that could have an interaction between the Orf23 protein and protein cI. This is the first time that a protein of this family of ATPases is characterized in a bacteriophage which integrates in the genome of its host cell. / Estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio han caracterizado estructuralmente y fenotípicamente el bacteriófago SE1. Este bacteriófago presenta una elevada frecuencia de transducción, capaz de infectar S. enterica, serovar Enteritidis y serovar Typhimurium. Continuando esta línea de investigación, en el presente trabajo se ha planteado ampliar la descripción genética de este bacteriófago y caracterizar las diferentes funciones del fago SE1 en estado de lisogenia, tales como la conversión lisogénica, la integración y su regulador o interruptor genético.La secuenciación del genoma del bacteriófago SE1, a partir de su genoteca o por walking directamente sobre el genoma, ha permitido determinar que tiene una longitud de 41.041 pb, que se concreta en 67 orfs. La comparación con la base de datos del GenBank ha revelado que dicho fago, como otros fagos lambdoides, es un mosaico genético resultado de recombinaciones y transferencias horizontales con otros bacteriófagos.La secuencia obtenida permitió mostrar que la deficiencia en el extremo carboxi Terminal periplasmático de la proteína codificada por uno de los genes de conversión lisogénica (GtrC) podría ser la causa por la cual el bacteriófago P22 podria infectar una célula lisógena por el bacteriófago SE1.Además, en el presente trabajo se han determinado las secuencias de los operadores de la región reguladora que interaccionan con la proteína cI del interruptor o regulador genético. A través de ensayos de retardo electroforético (EMSA) y de footprinting se ha definido la secuencia consenso de los motivos de unión de los operadores a la proteína cI: AtAN3tTN3TATT.Por otro lado, el análisis de la composición de la unidad transcripcional del gen cI por RT-PCR permitió determinar que el gen orf23 formaba parte de la misma. La proteína Orf23 seria un potencial regulador miembro de la superfamilia de las ATPasas involucradas en la partición genómica. Mutantes defectivos en este gen presentan un aumento de la inducción del ciclo lítico en presencia de mitomicina C, esto indica que esta proteína podría ser un modulador de la proteína cI o que podría haber una interacción entre la proteína Orf23 y la proteína cI. Esta es la primera vez que se caracteriza una proteína de esta familia de ATPasas en un bacteriófago que se integra en el genoma de su hospedador.

Aquesta tesi doctoral per compendi de publicacions avalua la importància clínica de les variants del VIH-1 minoritàries que alberguen mutacions de resistència. La primera publicació presenta una avaluació sistemàtica de la PCR específica d'al·lel (ASPCR) com a eina per detectar variants víriques minoritàries que amb mutacions de resistència a la transcriptasa inversa (M184V, M184I) i proteasa (regions de D30N), així com a la envolta (V38A). A la segona publicació, utilitzem aquesta tècnica conjuntament amb d'altres per caracteritzar amb alta resolució la dinàmica de pèrdua de mutants M184V a pacients infectats amb el VIH-1 resistents a múltiples tractaments i que interrompen tractament amb inhibidors de la transcriptasa inversa i continuen amb inhibidors de la proteasa. Aquest estudi mostra que la ASPCR es pot utilitzar per calcular la fitness de variants al·lèlics particulars in vivo i ajuda a millorar la nostra comprensió de dinàmica de la quasispecie viral en presència i absència de tractament antiretroviral. La tercera publicació mostra com es pot aplicar la detecció de mutants minoritàries a l'estudi de la resistència antiretroviral primària, duplicant o triplicant la prevalença de mutacions de resistència en comparació amb seqüenciació poblacional de virus a plasma. A la quarta publicació, mostrem que dones embarassades infectades pel VIH-1 i naive als antiretrovirals freqüentment seleccionen mutacions de resistència a antiretrovirals amb barrera baix genètica durant teràpia antiretroviral limitada a l'embaràs; de nou, la freqüència de mutacions de resistència augmenta més de dues vegades amb l'assaig d'ASPCR. Aquests descobriment te implicacions clíniques importants, doncs les dones que seleccionin mutacions de resistència durant la teràpia antiretroviral limitada a l'embaràs tenen més risc de fracassar a un tractament antiretroviral després del part. A la cinquena publicació demostrem que la detecció de variants minoritàries resistents als anàlegs de la transcriptasa inversa no-nucleòsids s'associa a un increment del risc de fracàs virològic a una primera línea de tractament antiretroviral amb efavirenz als pacients que prenen el fàrmac correctament. En resum, aquest treball demostra que les variants del VIH minoritàries resistent, que sovint no es detecten pels assaigs de resistències estàndards, modifiquen la resposta al tractament antiretroviral i per això són d'una importància clínica essencial. / This doctoral thesis by compendium of publications addresses the clinical relevance of minority HIV-1 variants harboring resistance mutations. The first publication presents a systematic evaluation of allele-specific polymerase chain reaction (ASPCR) as a tool to detect low-frequency viral variants harboring resistance mutations in the reverse transcriptase (M184V, M184I) and protease (D30N)-coding regions of pol, as well as in env (V38A). In the second publication, we use this technique alongside others to characterize with high resolution the decay dynamics of M184V mutants in subjects infected with multidrug-resistant HIV-1 who interrupt treatment with reverse transcriptase inhibitors and continue protease inhibitors. This study shows that ASPCR can be used to estimate the fitness of particular allelic variants in vivo and helps to improve our understanding of quasispecies dynamics in the presence and absence of therapy. The third publication shows how detection of low-frequency mutants can be applied to the surveillance of primary antiretroviral resistance, increasing the prevalence of resistance mutations by 2 to 3-fold relative to using bulk sequencing of plasma viruses. In the fourth publication, we show that antiretroviral naïve HIV-1-infected pregnant women frequently select resistance mutations to drugs with low-genetic barrier during pregnancy-limited antiretroviral therapy; again, the frequency of resistance mutations increases more than two-fold using the ASPCR assay. These findings have important clinical implications, given that women selecting resistance mutations during pregnancy-limited antiretroviral therapy may be more likely to fail postpartum antiretroviral therapy. In the fifth publication we demonstrate that pre-existing minority variants harboring resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors more than triple the risk of virological failure to first-line efavirenz-based antiretroviral therapy in drug-adherent subjects. In summary, this work demonstrates that minority HIV-1 resistant variants, which are often missed by standard viral population sequencing assays, do modify antiretroviral therapy outcomes and therefore are of major clinical importance.

Entre els anys 2001 i 2005 es van capturar i analitzar 72.895 femelles de mosquits (Diptera: Culicidae) i 6.871 de flebòtoms (Diptera: Psychodidae) en les estacions d'abundància amb l'objectiu de detectar la presència de genoma d'arbovirus en diferents àrees d'Espanya, en especial en zones humides. L'estudi forma part d'un de més general que tracta de la transmissió d'arbovirus en quatre dels aiguamolls més importants d'Espanya que es troben a Girona, Barcelona, Tarragona i Huelva.Els insectes es van recollir amb esquer humà, amb trampes de CO2 i amb trampes CDC i es van agrupar en pools segons la data de captura, la localitat i l'espècie. Pel que fa als flebòtoms, les mostres es van obtenir a partir del 2002 a Barcelona i Huelva i es van identificar com a subfamília.Els culícids es van agrupar en 4.723 pools i pertanyien a 20 espècies dels gèneres Anopheles, Aedes, Ochlerotatus, Culex, Culiseta, Coquillettidia i Uranotaenia i els flebòtoms es van agrupar en 236 pools com a tals.Mentre es duia a terme l'estudi, es va detectar el mosquit invasor -Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse)- per primera vegada a Espanya, concretament a Sant Cugat del Vallès, durant l'estiu del 2004. Mitjançant inspeccions immediatament posteriors es va comprovar l'existència d'importants poblacions a la zona, i se'n va confirmar l'establiment. Aquesta és la primera notificació de l'espècie esmentada a la península Ibèrica. Es van analitzar totes les femelles capturades posteriorment a l'àrea d'estudi.L'espècie de culícid més abundant va ser Ochlerotatus caspius (40,9 %), seguida de Culex pipiens (32,3 %), Culex theileri (10,9 %), Anopheles atroparvus (6,6 %), i Culex modestus (4,6 %).Es van analitzar homogenats dels vectors per detectar directament ARN d'arbovirus dels gèneres Alphavirus, Flavivirus i Phlebovirus. No s'ha trobat ARN d'arbovirus patògens coneguts. En el cas dels mosquits, 111 pools van ser positius a Flavivirus, l'únic gènere detectat en aquest grup taxonòmic. Les seqüències de Flavivirus identificades són diferents de qualsevol Flavivirus de mosquit conegut i majoritàriament properes al virus Kamiti River (KRV) o al virus cell fusing agent (CFA), excepte en dos pools d'Andalusia que es troben properes al grup de virus transmesos per artròpodes. Per a totes les zones i espècies, es va calcular l'estimació del màxim de versemblança de la taxa d'infecció o the maximum likelihood estimation infection rate (MLE). Ae. albopictus tingué la MLE més alta, de 47,14, seguida per Aedes vexans amb 43,67 en el conjunt de l'àrea d'estudi. Per sota d'aquestes espècies hi havia Culiseta annulata, amb 36,00. Les espècies més abundants, Oc. caspius i Cx. pipiens, va obtenir valors MLE baixos (0,94 i 0,38 respectivament) en el conjunt de tota l'àrea.En el cas dels flebòtoms, 10 pools (9 dels quals de Barcelona) van donar positiu a Flavivirus semblants a Culex Flavivirus (CxFV). És la primera vegada que es troba genoma d'aquest gènere en flebòtoms de fora de l'Àfrica. En 8 pools de Barcelona es va trobar un Phlebovirus similar al complex Nàpols i al virus Massilia.Cal assenyalar que en el cas d'alguns mosquits, en especial en mostres dels gèneres Aedes i Ochlerotatus, el genoma detectat probablement eren seqüències d'ADN integrades en el genoma dels mosquits. Aquest fet l'han observat recentment altres autors.El 2006, seguint amb la campanya de detecció d'arbovirus, es va trobar, entre 436 pools dels aiguamolls de Catalunya i 9 espècies de mosquit, un de positiu a un Flavivirus identificat com a virus Usutu (USUV) en un pool de 3 Cx. pipiens obtingut a Viladecans (Barcelona). Les dades d'homologia van mostrar que la soca espanyola pertanyia a l'USUV però que era més propera a mostres africanes d'USUV que a les obtingudes a Europa central. / With the aim of assessing the presence of arbovirus genome in vectors in different areas, especially wetlands, in Spain, a total of 72,895 female mosquitoes (Diptera: Culicidae) and 6,871 sandflies (Diptera: Psychodidade) were trapped during their season of abundance, and analyzed between the years 2001 and 2005. The study formed part of general arbovirus transmission research in four of the most important wetlands in Spain in the provinces of Girona, Barcelona, Tarragona, and Huelva.Insects were collected using human bait, CO2 traps, or light traps, and they were pooled according to date of collection, location, and species. In the case of sandflies, the period of study started in 2002 in Barcelona and Huelva and species were not identified. Mosquitoes were sorted into 4,723 pools belonging to 20 Culicidae species from the Anopheles, Aedes, Ochlerotatus, Culex, Culiseta, Coquillettidia, and Uranotaenia genera. Sandflies were sorted into 236 pools as a whole.During the study, the invasive mosquito Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse) was detected for the first time in Spain, in Sant Cugat del Vallès during August 2004. Dense populations of adults and larvae were found in subsequent surveys, confirming the establishment of this species in this area. This is the first report of the establishment of Ae. albopictus in the Iberian Peninsula. All captured females in the studied area belonging to this species were analyzed.The most abundant species was Ochlerotatus caspius (40.9 %), followed by Culex pipiens (32.3 %), Culex theileri (10.9 %), Anopheles atroparvus (6.6 %), and Culex modestus (4.6 %).Arboviral RNA was directly detected from vector homogenates for the genera Alphavirus, Flavivirus, and Phlebovirus. No arboviral RNA from known pathogenic arboviruses was found. In the case of mosquitoes, 111 pools tested positive for unknown mosquito Flavivirus, the only genus detected in this taxonomic group. The Flavivirus sequences identified were different from all known Flavivirus mosquito viruses, but very close to Kamiti River virus (KRV) or cell fusing agent virus (CFA) with the exception of two pools from Andalusia, close to the group of arthropod borne viruses. The maximum likelihood estimation infection rate (MLE) was calculated for all regions and species. Ae. albopictus had the highest MLE at 47.14, followed by Aedes vexans with 43.67 over the entire area. These species were followed by Culiseta annulata, with 36.00. The most common species, Oc. caspius and Cx. pipiens, had low MLE values -0.94 and 0.38, respectively- over the area as a whole.In the case of sandflies, 10 pools (9 in Barcelona) tested positive for a Flavivirus similar to Culex Flavivirus (CxFV) being this, the first time that Flavivirus genome is detected in sand flies outside Africa. Phlebovirus viruses similar to Naples complex and Massilia were found in 8 sandflies pools, all from Barcelona area.In some samples of mosquitoes, especially in genera Aedes and Ochlerotatus, detected genome was probably DNA sequences integrated in the mosquito genome as has been observed recently by other authors.In 2006, surveillance monitoring samples carried out in Catalonia detected, in 436 pools belonging to 9 mosquito species, a positive for Flavivirus identified as Usutu virus (USUV) in a pool of 3 Cx. pipiens obtained from the town of Viladecans, Barcelona. The homology data showed that the Spanish strain belongs to USUV species and is more related to the African USUV isolates than to central European isolates.

Las poblaciones de rebeco pirenaico (Rupicapra pyrenaica) situadas en el Pirineo central y oriental se han reducido drásticamente debido a sucesivos brotes de enfermedad asociados a un Virus de la Enfermedad de la Frontera (BDV en sus siglas en inglés) desde el año 2001. Sin embargo, la enfermedad observada no presenta las características clásicas de la Enfermedad de la Frontera, descrita en las especies domésticas. La presente investigación tiene como objetivo investigar la patogenia de la enfermedad asociada al BDV del rebeco (ch-BDV) en rebecos infectados de manera natural y en tres especies infectadas experimentalmente: rebeco pirenaico, oveja y cerdo. En primer lugar, investigamos la excreción, distribución y cuantificación del ch-BDV en los órganos de rebecos infectados de manera natural. El suero y los tejidos analizados fueron positivos mediante RT-PCR y aislamiento vírico en todos los animales estudiados. Los hisopos nasal, oral y rectal, así como la orina fueron también positivos mediante RT-PCR en casi todas las muestras analizadas, confirmando que el virus se elimina al ambiente a través de las vías de excreción analizadas. El estudio serológico no detectó anticuerpos en ningún rebeco utilizando técnicas de ELISA y seroneutralización. El estudio genético de la región no codificante 5’ confirmó que el virus pertenecía al grupo BDV-4, tal y como se había descrito anteriormente en los brotes de enfermedad. La presencia de un feto positivo al ch-BDV mediante RT-PCR sugiere que sea posible la existencia de animales persistentemente infectados. El objetivo de la infección experimental en el rebeco pirenaico fue la reproducción en condiciones experimentales de la enfermedad observada en los rebecos salvajes. Siete rebecos (cinco seronegativos y dos seropositivos a anticuerpos frente a BDV) fueron inoculados con una cepa BDV aislada de un rebeco de campo infectado. Tres animales más se mantuvieron como controles. Los cinco rebecos seronegativos infectados presentaron una viremia desde el día 2 post-inoculación (pi) hasta la muerte del animal o el fin del experimento en el día 34 pi, y desarrollaron anticuerpos neutralizantes a partir del día 18 pi. Los rebecos virémicos presentaron un descenso en el recuento leucocitario, especialmente significativo en los neutrófilos. Las lesiones más significativas se observaron en el encéfalo y órganos linfoides, que presentaron una meningoencefalitis no supurativa y una moderada depleción linfoide generalizada, respectivamente. De manera similar a los rebecos infectados de manera natural, los rebecos de este experimento también presentaron virus en hisopo nasal, saliva y heces, hecho que explicaría la elevada capacidad de transmisión horizontal observada en las poblaciones de rebecos salvajes afectadas por las epizootias. Esta infección experimental confirma que el ch-BDV es el agente etiológico primario de la enfermedad que ha afectado a las poblaciones de rebeco en los últimos años en el Pirineo. La Enfermedad de la Frontera en las ovejas cursa con un cuadro sintomático leve o subclínico, aunque se han descrito brotes de enfermedad con elevada mortalidad. En la infección experimental de oveja valoramos la susceptibilidad de esta especie al ch-BDV. No se observaron signos clínicos ni lesiones histopatológicas en los corderos inoculados aunque el BDV se detectó en suero entre los días 4 y 10 pi. Todos los corderos infectados mostraron anticuerpos neutralizantes a partir del día 21 pi. La conclusión principal de esta infección experimental fue que el ch-BDV infecta la oveja vía oro-nasal, desarrollando en ésta una respuesta humoral que elimina el virus. El BDV infecta diferentes especies animales. Previamente a la infección experimental en cerdo, habíamos detectado jabalíes con anticuerpos frente a BDV en las zonas del Pirineo donde se habían producido los brotes de enfermedad en rebeco. El objetivo principal de la infección experimental en el cerdo fue estudiar bajo condiciones experimentales los efectos del ch-BDV y la dinámica de la infección en esta especie. Los cerdos infectados mostraron una viremia desde el día 3 hasta el 14 pi, a partir del cual los animales desarrollaron una repuesta humoral. No se observó sintomatología clínica ni lesiones histológicas. Esta infección experimental demostró la susceptibilidad del cerdo al ch-BDV, lo que podría representar un problema en el diagnóstico de la Peste Porcina Clásica en el jabalí. / Since 2001 several outbreaks of disease associated with BDV infection have been reported in the Pyrenees (North-Eastern Spain), affecting Pyrenean chamois (Rupicapra pyrenaica) and entailing a major population reduction. However, the clinical disease observed in the affected chamois was not the typical one described in domestic animals. The present research aims to investigate the pathogenesis of the disease associated to chamois-BDV (ch-BDV) in naturally-infected chamois and in three experimental animal models: pig, sheep and Pyrenean chamois. The shedding, distribution and quantification of ch-BDV in the organs of naturally infected chamois was investigated as a previous step to the experimental challenges in the three animal models. Sera and all tissue samples were positive to RT-PCR and virus isolation in all studied chamois. Also, nasal, oral and rectal swabs and urine were RT-PCR positive in almost all analyzed samples, confirming that the virus is shed through the main excretion routes. In addition, sera were tested for BDV antibodies using an ELISA and seroneutralization tests, with negative results. Sequence analysis of the 5’ untranslated region (5’-UTR) confirmed that this virus was grouped into the BDV-4 genotype as reported in previous studies. The observation of a RT-PCR positive foetus in an adult female suggests that persistently infected animals could be possible. The aim of the experimental infection in Pyrenean chamois was to reproduce the disease reported in chamois in the field and to study it under experimental conditions. Seven chamois (five seronegative and two seropositive against BDV) were inoculated with a BDV isolated from a naturally-infected chamois and three animals were kept as controls. The five seronegative infected chamois were viraemic from day 2 post inoculation (pi) until the day they died or the end of the experiment on day 34 pi, and developed neutralizing antibodies from day 18 pi until the end of the study. There was also a progressive decline in their white blood cell counts, especially marked in the neutrophil count. The most consistent histopathological lesions were in brain and lymphoid tissues, where non-suppurative meningoencephalitis and generalized moderate lymphocyte depletion were observed, respectively. Like naturally infected chamois, experimentally infected animals also contained high doses of BDV in main putative excretion routes, which would explain the high transmission rate of the infection in free-ranging chamois populations in the Pyrenees. This experimental infection in chamois confirms that BDV is the primary agent of the disease that has been affecting chamois populations in recent years in the Pyrenees. Clinical manifestations of Border Disease in healthy sheep acutely infected are mild or unapparent, but a few outbreaks with high mortality have been reported. Sheep were experimentally infected with ch-BDV and examined the susceptibility to the infection of this species. Clinical signs or histological lesions were not observed in inoculated lambs but BDV was detected in sera from the infected group from day 4 pi to day 10 pi. All infected lambs showed neutralizing antibodies at day 21 pi. Therefore, ch-BDV can infect domestic sheep through the oro-nasal route, developing a humoral response that completely eliminates the virus. It is well documented that BDV can infect domestic and feral swine. In a previous study, seropositive wild boars against BDV were detected from the Pyrenees areas where chamois epizootics occurred. For this reason, experimentally the effects and dynamics of ch-BDV infection in domestic pig were studied. In this challenge all infected pigs were viraemic from day 3 to 14 pi, when all animals developed an antibody response. Clinical signs or histological lesions were not observed. Thus, the susceptibility of domestic swine to ch-BDV was demonstrated, representing a potential challenge to the monitoring of CSFV in wild swine populations.

No description available.

A diferència de la infecció per virus lliure, la transmissió del VIH de cèl·lula a cèl·lula és un mecanisme altament eficient i citopàtic degut a l'establiment de les sinapsis virològiques induïdes per l'embolcall del virus on la informació es transmet en forma de partícules virals (acompanyades de traços de membrana) des de la cèl·lula efectora a la cèl·lula diana. L'objectiu inicial va ser la caracterització dels contactes cel·lulars mediats pel VIH en cultius mixtes de cèl·lules infectades i cèl·lules no infectades en absència o presència del coreceptor apropiat. Posteriorment es va evaluar la transferència viral de cèl·lula T a cèl·lula T, un fenòmen que pot o no portar a la infecció de la cèl·lula diana. Les molècules d'adhesió tenen un paper secundari en la transmissió viral a través de la sinapsis virològica. Tot i que les cèl·lules T de memòria expressen més quantitats d'aquestes molècules que les cèl·lules T naïve, la major transferència viral observada cap a aquestes no es pot explicar per aquest fet. La trogocitosis o intercanvi de components de membrana, no permetla transferència de virus ja que només opera en el sentit invers a la transmissió tot i que podria estar jugant un paper modulador en la formació i durada dels contactes. Finalment, la transmissió viral de cèl·lula a cèl·lula desencadena la infecció de cèl·lules T CD4 quiescents, les quals presenten nivells baixos de fosforilació de les proteïnes senyalitzadores p56Lck i ZAP70 un cop han contactat amb les cèl·lules infectades, en absència de proliferació cel·lular i infecció productiva d'aquestes cèl·lules en estat en repòs, permanent així, en un estat latentment infectades. / A diferencia de la infección por virus libre, la transmisión de VIH de célula a célula es un mecanismo altamente eficiente y citopático debido al establecimiento de las sinapsis virológicas inducidas por la envuelta del virus donde la información se transmite en forma de partículas virales (acompañadas de trazos de membrana) desde la célula efectora a la célula diana. Inicialmente se caracterizó los contactos celulares mediados por el VIH en cultivos mixtos de células infectadas y células no infectadas en ausencia o presencia del coreceptor apropiado y posteriormente se evaluó la transferéncia viral. Las moleculas de adhesion juegan un papel secundario en la transmisión viral a través de la sinapsis virológica. Las células T de memoria expresan más cantidades de estas moléculas que las células T naive, aún así, la mayor transferencia viral observada hacia as células de memoria no se explica por este hecho. La trogocitosis o intercambio de componentes de membrana, no permite la transferéncia de virus ya que sólo opera en el sentido inverso a la transmisión aunque puede tener un papel modulador en la formación y durada de los contactos. Finalmente, la transmisión viral de célula a célula desencadena la infección de células T CD4 quiescentes, las cuales presentan niveles bajos de fosforilación de las proteínas p56Lck y ZAP70 un vez han contactado con las células infectadas, en ausencia de proliferación celular y infección productiva de estas células en estado de reposo, permaneciendo así, en un estado latentemente infectadas. / Unlike virus-to-cell contacts, cell-to-cell HIV transmission (from infected cells to CD4 T cells) is a highly efficient and cytopathic mechanism. Such a high efficiency relies in the formation of "virological synapses" induced by the HIV envelope glycoproteins. The particularity of this synapse as compared to the classical ones would be that information is transferred as virus particles (accompanied by other components of the cell membrane) from effector to target cells. First, the aim was to characterize T cell-T cell contacts mediated by the HIV Envelope in mixed cultures of infected and target primary cells expressing or not the appropriate coreceptor. Then we have evaluated HIV transfer, which is an early event occurring immediately after the VS formation that precedes but does not necessarily lead to transmission, a later event resulting in infection. The presence of adhesion molecules at the synaptic junction showed a secondary role in cell-to-cell HIV transfer. Despite memory CD4 T cells expressed higher levels of adhesion molecules that naïve cells, it did not explain the selectivity of HIV transfer observed towards the memory CD4 T cell subset. Trogocytosis (i.e. intercellular exchange of membrane components) operates from the uninfected towards the infected cell direction but may modulate the extent and durability of HIV-mediated T cell contacts. Finally, cell-to-cell HIV transmission triggers the infection of quiescent CD4 T cells, which showed low levels of Envelope-CD4 mediated p56Lck and ZAP-70 phosphorylation in the absence of proliferation and productive infection of target cells.

La infecció pel VIH ha esdevingut una malaltia crònica gràcies a la introducció del tractament antiretroviral. Tot i la disminució de la mortalitat, la incidència de complicacions metabòliques relacionades amb el tractament i la infecció adquireixen cada cop més rellevància clínica. La infecció pel VIH promou un estat pro-oxidatiu que afavoreix la mateixa replicació viral i l'aparició d'alteracions metabòliques com l'aterosclerosi o la lipodistròfia. L'aterosclerosi és reconeguda com una malaltia inflamatoria crònica. La paraoxonasa-1 (PON1) és un enzim associat a les lipoproteïnes d'alta densitat (HDL) que li confereix gran capacitat antioxidant. Tot i que el seu sustrat fisiològic encara no es coneix, s'ha estudiat el seu rol protector en diverses malaties cròniques. Per aquesta raó creiem interessant investigar la possible funció d'aquest enzim antioxidant en la evolució immunològica i virològica de la infecció pel VIH i així també en l'aparició de complicacions metabòliques com l'aterosclerosi. / HIV infection has become a chronic disease since introduction of antiretroviral treatments. Despite the decline in mortality, the incidence of metabolic complications related to treatment and the infection itself are becoming more relevant. HIV infection promotes a pro-oxidative status that favors viral replication and the emergence of the metabolic disorders such as atherosclerosis and lipodystrophy. Atherosclerosis is recognized as a chronic inflammatory disease. The paraoxonase-1 (PON1) is an enzyme bound to high-density lipoprotein (HDL), which confers high antioxidant properties. Although its physiological sustrat is not yet known, it has been studied its protective role in several chronic diseases with an increase in oxidative stress and atherosclerosis. For this reason we believe is of interest to investigate the possible role of this antioxidant enzyme in the immunological and the virological evolution of HIV infection and in the apparition of metabolic complications such as atherosclerosis.

La contaminación del medio ambiente, principalmente de ríos, lagos, playas y agua subterránea, que habitualmente se utilizan para actividades recreacionales, cultivos de moluscos, sistemas riego en la agricultura o como fuentes de agua para el consumo humano, es un tema de gran preocupación en términos de salud pública y de gran importancia económica y de legislación. Si se considera la distribución de la población humana, especialmente en zonas cercanas a estos tipos de agua, es indiscutible que estos ecosistemas tienen un considerable riesgo de contaminación que proviene de agua residual de origen humano e incluso de mataderos de animales y de fertilizantes de origen animal empleados en la agricultura. La mayoría de los estudios y datos disponibles sobre contaminación y calidad microbiológica del agua, hacen especial referencia a la contaminación de origen fecal, es bien conocido que una gran cantidad de microorganismos son excretados en la orina y la heces, entre éstos, los virus. Definitivamente la ruta fecal-oral es la vía responsable de la mayoría de las infecciones víricas asociadas al agua. Existen importantes patógenos transmitidos por el agua contaminada, sin embargo, en la actualidad la calidad microbiológica del agua es controlada mediante estándares bacterianos. Actualmente no existe un protocolo estandarizado en las legislaciones para el estudio de virus en muestras ambientales, ni protocolos estándar para el estudio de la infectividad de estos virus. El presente trabajo de Tesis Doctoral describe el desarrollo de nuevas metodologías para la concentración y detección de virus en agua, la utilización de indicadores víricos para evaluar la contaminación fecal, así como también datos sobre la presencia de virus emergentes y virus potencialmente nuevos. El trabajo consta de tres Capítulos que engloban cinco Estudios diferentes. / Fecal contamination in the environment is a public health concern and a serious economical problem. This situation is mainly in rivers, lakes and seawater that frequently are used in recreational activities, shellfish industry, and irrigation in the agriculture and as sources for drinking water. If we consider the high distribution of human population, especially in coastal areas, certainly these ecosystems have a risk of fecal contamination by waste water from humans, agriculture and animals. Most of the studies and available data about contamination and microbiological quality of water have a special interest in the fecal contamination, it is well know that a numerous microorganisms are shed by humans in feaces and urine, among these the viruses. The fecal-oral transmission route is definitely the responsible of most of viral infections related to water. There are important pathogens transmitted by fecal contaminated water, however, currently the microbiological quality of water is monitored using bacterial standards. At the moment there are not standard protocols to study viruses in the legislations for the environment. The present Doctoral Thesis describes the development of new methodologies for the concentration and detection of viruses in water, the use of viral indicators to monitor the fecal contamination of water, as well as data about the emerging viruses and potential new viruses in the environment.