A diferència de la infecció per virus lliure, la transmissió del VIH de cèl·lula a cèl·lula és un mecanisme altament eficient i citopàtic degut a l'establiment de les sinapsis virològiques induïdes per l'embolcall del virus on la informació es transmet en forma de partícules virals (acompanyades de traços de membrana) des de la cèl·lula efectora a la cèl·lula diana. L'objectiu inicial va ser la caracterització dels contactes cel·lulars mediats pel VIH en cultius mixtes de cèl·lules infectades i cèl·lules no infectades en absència o presència del coreceptor apropiat. Posteriorment es va evaluar la transferència viral de cèl·lula T a cèl·lula T, un fenòmen que pot o no portar a la infecció de la cèl·lula diana. Les molècules d'adhesió tenen un paper secundari en la transmissió viral a través de la sinapsis virològica. Tot i que les cèl·lules T de memòria expressen més quantitats d'aquestes molècules que les cèl·lules T naïve, la major transferència viral observada cap a aquestes no es pot explicar per aquest fet. La trogocitosis o intercanvi de components de membrana, no permetla transferència de virus ja que només opera en el sentit invers a la transmissió tot i que podria estar jugant un paper modulador en la formació i durada dels contactes. Finalment, la transmissió viral de cèl·lula a cèl·lula desencadena la infecció de cèl·lules T CD4 quiescents, les quals presenten nivells baixos de fosforilació de les proteïnes senyalitzadores p56Lck i ZAP70 un cop han contactat amb les cèl·lules infectades, en absència de proliferació cel·lular i infecció productiva d'aquestes cèl·lules en estat en repòs, permanent així, en un estat latentment infectades. / A diferencia de la infección por virus libre, la transmisión de VIH de célula a célula es un mecanismo altamente eficiente y citopático debido al establecimiento de las sinapsis virológicas inducidas por la envuelta del virus donde la información se transmite en forma de partículas virales (acompañadas de trazos de membrana) desde la célula efectora a la célula diana. Inicialmente se caracterizó los contactos celulares mediados por el VIH en cultivos mixtos de células infectadas y células no infectadas en ausencia o presencia del coreceptor apropiado y posteriormente se evaluó la transferéncia viral. Las moleculas de adhesion juegan un papel secundario en la transmisión viral a través de la sinapsis virológica. Las células T de memoria expresan más cantidades de estas moléculas que las células T naive, aún así, la mayor transferencia viral observada hacia as células de memoria no se explica por este hecho. La trogocitosis o intercambio de componentes de membrana, no permite la transferéncia de virus ya que sólo opera en el sentido inverso a la transmisión aunque puede tener un papel modulador en la formación y durada de los contactos. Finalmente, la transmisión viral de célula a célula desencadena la infección de células T CD4 quiescentes, las cuales presentan niveles bajos de fosforilación de las proteínas p56Lck y ZAP70 un vez han contactado con las células infectadas, en ausencia de proliferación celular y infección productiva de estas células en estado de reposo, permaneciendo así, en un estado latentemente infectadas. / Unlike virus-to-cell contacts, cell-to-cell HIV transmission (from infected cells to CD4 T cells) is a highly efficient and cytopathic mechanism. Such a high efficiency relies in the formation of "virological synapses" induced by the HIV envelope glycoproteins. The particularity of this synapse as compared to the classical ones would be that information is transferred as virus particles (accompanied by other components of the cell membrane) from effector to target cells. First, the aim was to characterize T cell-T cell contacts mediated by the HIV Envelope in mixed cultures of infected and target primary cells expressing or not the appropriate coreceptor. Then we have evaluated HIV transfer, which is an early event occurring immediately after the VS formation that precedes but does not necessarily lead to transmission, a later event resulting in infection. The presence of adhesion molecules at the synaptic junction showed a secondary role in cell-to-cell HIV transfer. Despite memory CD4 T cells expressed higher levels of adhesion molecules that naïve cells, it did not explain the selectivity of HIV transfer observed towards the memory CD4 T cell subset. Trogocytosis (i.e. intercellular exchange of membrane components) operates from the uninfected towards the infected cell direction but may modulate the extent and durability of HIV-mediated T cell contacts. Finally, cell-to-cell HIV transmission triggers the infection of quiescent CD4 T cells, which showed low levels of Envelope-CD4 mediated p56Lck and ZAP-70 phosphorylation in the absence of proliferation and productive infection of target cells.

La mucoviscidose est une maladie génétique due à des mutations du gène CFTR, conduisant à une altération de la fonction de canal à ions chlorure de la glycoprotéine transmembranaire CFTR associée à une atteinte pulmonaire sévère. Plusieurs études récentes ont amené à reconsidérer l’utilisation des vecteurs adénoviraux (Ad) de sérotype 5 (Ad5) dans la mucoviscidose, lesquels induisent non seulement des réactions immunes anti-adénovirales mais aussi des effets cytopathiques indésirables. (1) Dans une première partie de notre étude, nous avons étudié l’entrée et le transit intracellulaire de l’Ad5/F35, vecteur chimérique portant les fibres de l’Ad sérotype 35 sur une capside de sérotype 5. Nous avons montré que la protéine fibre est déterminante dans l’internalisation et le trafic intracellulaire de ce vecteur. Le vecteur Ad5/F35 exprimant la fusion GFP-CFTR s’est révélé (i) être dépourvu de cytotoxicité, (ii) transduire efficacement les cellules épithéliales pulmonaires par voie apicale, et (iii) restaurer l’activité de canal à chlorure dans les cellules CFTR(-). Il constitue donc un vecteur de transfert du gène CFTR potentiellement utilisable en thérapie génique de la mucoviscidose. (2) Dans une seconde partie, nous avons exploré une stratégie alternative de transfert de la protéine CFTR par trogocytose. Nous avons fait l’hypothèse que le canal CFTR pouvait être véhiculé par des microvésicules ou microparticules membranaires (MP) émanant de la membrane cellulaire et libérées dans le milieu de culture. En utilisant un système d’expression stable de la protéine CFTR étiquetée par la protéine fluorescente GFP (GFP-CFTR) dans des cellules donneuses, nous avons pu démontrer que les MP sont capables de prendre en charge et délivrer la protéine GFP-CFTR à des cellules réceptrices, mais ce transfert n’est assuré que par une population réduite de MP (≤ 8 %), et la durée de vie du GFP-CFTR n’est que transitoire (≤ 24h). En fait, la majorité des MP transfèrent des molécules d’ARN messager ou polysomal GFP-CFTR. La protéine GFP-CFTR néosynthétisée à partir de ces ARNm est exprimée plus tardivement (> 48h) mais de façon prolongée (≥ 10 jours). La fonctionnalité du canal CFTR ainsi néosynthétisé est en cours d’évaluation. Les MP constituent donc un nouveau type de vecteurs de transfert non génique du CFTR qui pourraient être employés en thérapie de la mucoviscidose. / The cystic fibrosis (CF) is a genetic disease due to mutations of the CFTR gene, resulting in the alteration of the Cl channel function carried by the transmembranal glycoprotein CFTR, and associated with severe pulmonary complications. Several recent studies led the medical and scientific community to reconsider the use of adenovirus serotype 5 (Ad5)-based vectors as CFTR gene transfer vectors in CF gene therapy. Not only immune response against the vector itself and the ansduced cells have been observed, but also Ad5-induced nondesired cytopathic effects. (1) In the first part of our study, we analyzed the cell entry and traficking of Ad5/F35, a chimeric vector consisting of serotype 5 capsid carrying serotype 35 fibers. We showed that the fibre protein is the major, if not only, determinant of the internalisation and entry pathway of Ad5/F35. Ad5/F35-GFP-CFTR, expressing the fusin protein GF-CFTR, was found (i) to be devoid of detectable cytopathic effect, (ii) efficiently transduced airway epithélial cells via the apical pole, and (iii) restore the Cl channel function in CF cells. Ad5/F35 therefore represents a CFTR gene transfer vector with a great potential for gene therapy of CF. (2) In the second part of our study, we have investigated an alternative strategy based on the transfer of the mature CFTR protein via trogocytosis. We hypothesized that microvesicles or microparticules (MP) issued from the cell membranes and released into the culture medium could transport and achieve the cell-to-cell transfer of CFTR channel cargo. We engineered donor cells for stable expression of GFP-tagged CFTR protein (GFP-CFTR), and showed that donor cell-issued MP were capable of delivering GFP-CFTR protein to recipient cell. However, the GFP-CFTR protein was only transferred by a limited population of MP (≤ 8 %), and was only transient (≤ 24h). In fact, the major population of MP transferred mRNAGFP-CFTR or polysomal thereof. Interestingly, the GFPCFTR protein newly synthesized from this mRNAGFP-CFTR was expressed at late times after transfer (≥ 48 h) but in a prolonged manner (≥ 10 jours). The Cl canal function after MP-mediated CFTR transfer is being evaluated. MP represent a novel type of CFTR vectors which can be produced by specifically designed autologous donor cells, and which would overcome most of the inconveniences of gene therapy using viral or nonviral vectors.

No description available.