En aquest treball es descriu la determinació estructural mitjançant cristal·lografia de raigs X de la proteïna p4 del bacteriòfag phi29 en la seva forma lliure i en complex amb DNA.La proteïna p4 és essencial en el procés infectiu del bacteriòfag, ja que regula la transcripció dels seus gens, establint-se dues fases transcripcionals clarament diferenciades. Això permet separar en el temps la síntesi de proteïnes implicades en la replicació del DNA fàgic i la de les proteïnes estructurals que formen la partícula del bacteriòfag. Existeixen 3 llocs funcionals de unió de p4 en el genoma del bacteriòfag phi29, que es localitzen en una regió intergènica de 219 pb on es troben els 3 promotors més importants: el A2b, el A2c i el A3.En absència de la proteïna p4, els promotors A2b i A2c són transcripcionalment actius, mentre que el promotor A3, degut a l'absència de una caixa -35 en la seva seqüència és incapaç d'unir l'RNA polimerasa i es manté inactiu.En el moment en que la proteïna p4 és sintetitzada, aquesta s'uneix als seus llocs d'unió i produeix diferents efectes depenent del promotor que considerem. En el promotor A2b, el lloc d'unió de la proteïna p4 solapa amb la seva caixa -35 i impedeix la unió de l'RNA polimerasa inhibint-se la transcripció. En el promotor A2c, la proteïna p4 afavoreix la unió de l'RNA polimerasa però aquesta no pot realitzar la seva funció perque es produeix una sobreestabilització del complex i l'RNA polimerasa és incapaç d'alliberar-se del promotor. En el promotor A3, la proteïna p4 recluta l'RNA polimerasa permetent l'inici de la transcripció.La proteïna p4 va cristal·litzar en dos grups espacials, C2221 i P212121 en presència i absència d'un compost de platí, respectivament. L'obtenció de fases es va realitzar pel mètode MAD, recollint 3 conjunts de dades a diferent longitud d'ona de manera que les intensitats fossin diferents en les reflexions simètriques per l'efecte del platí com a dispersor anòmal. El model de la proteïna es va afinar fins a 3 Å en el grup espacial C2221 i aquest va servir per poder fer una cerca de reemplaçament molecular en el cristall P212121. En aquest grup espacial es va poder afinar el model fins a 2 Å.El complex format per la proteïna p4 i el DNA va cristal·litzar en el grup espacial P2, apareixent un complex per unitat asimètrica. El fasejat es va realitzar pel mètode del reemplaçament molecular utilitzant com a model de cerca un dímer de la proteïna p4 i un fragment ideal de DNA en conformació B.La proteïna p4 és una proteïna de 125 aminoàcids que s'uneix al DNA en forma de dímer. La unió de la proteïna al DNA provoca una corvatura de 70º. La unió es realitza de manera específica en la regió N-terminal de la proteïna i de manera inespecífica en la regió de dimerització. Els contactes realitzats amb l'esquelet de fosfat del DNA tenen com a objectiu fixar el solc menor de la molècula de DNA en una conformació comprimida. / This work describes the structural determination by X-ray crystallography of the phi29 bacteriophage protein p4, both bound and unbound to DNA.Protein p4 is essential for the bateriophage infective step, as it regulates its genes transcription, thus establishing two clearly differentiated transcriptional phases. This allows temporal separation of the phage protein synthesis: the proteins involved in phage DNA replication are synthesized first and the structural proteins that form the bacteriophage particle later. There are three p4 functional binding sites in phi29 genome, which are located in a 219bp long intergenic region where the three most important promoters (A2b, A2c and A3) are located.In p4 absence, A2b and A2c promoters are active, while A3 promoter, due to not having a -35 box in its sequence, is unable of binding RNA polymerase and remains inactive.When p4 protein is synthesized, it binds to its binding sites, thus producing different effects depending on the promoter. In A2b promoter, protein p4 binding site encloses the promoter -35 box, thus preventing RNA polymerase binding and transcription consequently. In A2c promoter, although protein p4 enhances RNA polymerase binding, the enzyme is unable to perform its function because the complex is overstabilized and so RNA polymerase cannot escape from the promoter. In A3 promotor, protein p4 recruits RNA polymerase, thus allowing transcription initiation.Protein p4 was crystallized in two different space groups, C2221 in presence of a platinum compost and P212121 in its absence. Phases were obtained by MAD, collecting 3 data sets at different wavelengths to have differences in the symmetric reflections intensities due to the effect as an anomal dispersor of the platinium. The protein model was refined up to 3 Å in the C2221 space group, and this model was used to perform a molecular replacement in the P212121 crystal. In this former space group, the model could be refined up to 2 Å .The complex formed by protein p4 and DNA was crystallized in P2 space group, with one complex per asymmetric unit. Molecular replacement was used for phase determination, taking a protein p4 dimer and an ideal DNA fragment in B conformation as a searching model.P4 is a 125 aminoacid long protein that binds DNA as a dimer. P4 binding to the DNA induces a 70º curvature on it. This binding is specific at the n-terminal region and unspecific at the dimerization area. The contacts with the phosphate backbone of the DNA fix the minor groove of the DNA molecule in a narrowed conformation.

INTRODUCCIÓN: Desde la introducción del TARGA la historia natural de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ha cambiado. El descenso en eventos definitorios de SIDA y el aumentado en la supervivencia han hecho que estos pacientes presenten enfermedades órgano-terminales como enfermedad renal crónica (ERC). Existe poca información clínica y epidemiológica respecto los pacientes con infección por el VIH que están en terapia renal sustitutiva (diálisis o trasplante renal –TR-) en España y en Europa. OBJETIVO GENERAL: tener un mejor conocimiento global de la patología renal en pacientes con infección por el VIH; estudiar las características clínicas, epidemiológicas, la prevalencia, las tasas de supervivencia y los factores pronóstico de los pacientes con infección por el VIH y ERC que están en terapia renal sustitutiva en España y en Europa. MÉTODOS: se han realizado 3 estudios epidemiológicos de prevalencia (2 en España y uno en Europa), un estudio de cohortes retrospectivo para el análisis de la supervivencia y dos descripciones de la experiencia aislada con casos clínicos. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: los resultados se recogen en 6 trabajos originales y 3 trabajos relacionados con esta tesis doctoral con las siguientes conclusiones: 1. Epidemiología del VIH en diálisis 1.1.- La prevalencia del VIH en centros de diálisis en España es del 0.54%, siendo superior en diálisis peritoneal respecto a hemodiálisis. 1.2.- Los pacientes con VIH en diálisis en España son jóvenes, de raza blanca, afectos de distintas glomerulonefritis no-NAVIH y con un buen control del VIH bajo TARGA. 1.3.- Los pacientes con VIH en diálisis en Europa son también jóvenes y con un buen control del VIH, pero con una mayor presencia de raza negra y de NAVIH como causa de ERC. 1.4.- Un 39.5% de pacientes con VIH en diálisis cumple criterios para su inclusión en lista de espera para TR, pero solo un 12% estaba en lista de espera. Las causas de exclusión más frecuentes están relacionadas con un mal control del VIH. 1.5.- Dos tercios de los pacientes con VIH en diálisis en España presentan coinfección por el VHC, al ser la transmisión parenteral la vía más frecuente. En Europa la transmisión sexual es más frecuente, siendo el porcentaje de coinfectados por el VHC muy inferior. 1.6.- Los pacientes coinfectados VIH/VHC en diálisis no presentan mayor mortalidad respecto a los monoinfectados por el VIH, pero sí tienen alguna característica diferencial, siendo la más importante el menor acceso al TR. 2. Supervivencia del VIH en diálisis 2.1.- La supervivencia a medio plazo de los pacientes con VIH en diálisis es inferior respecto a la población control sin VIH. 2.2.- Los factores asociados a mal pronóstico son la ausencia de una pauta efectiva de TARGA y estar en diálisis peritoneal respecto a hemodiálisis. 3. TR en pacientes con VIH 3.1.- El TR en pacientes con VIH en Europa tiene una prevalencia del 0.04%, siendo las tasas de supervivencia a medio plazo (de injerto y paciente) muy elevadas y similares a les series publicadas en pacientes sin VIH. 3.2.- La tasa de rechazo agudo en receptores europeos de TR con VIH fue del 30%, siendo superior a la de las series publicadas en pacientes sin VIH. 3.3.- El uso de timoglobulina como agente inductor en receptores de TR con VIH produce una rápida y profunda linfocitopenia que no se asoció a un mayor número de infecciones respecto a un grupo control sin VIH. 3.4.- El cambio de TARGA por una combinación que incluya raltegravir en el periodo post-trasplante es una estrategia segura y eficaz para el manejo del VIH por la ausencia de interacciones farmacológicas con inmunosupresores. 3.5.- El doble trasplante reno-pancreático es también posible en pacientes con VIH pero la experiencia es muy escasa. / BACKGROUND: Antiretroviral therapy (ART) has been immensely successful in reducing AIDS-events and death after HIV infection, raising the interest in non-infectious comorbidities including kidney disease. There is a lack of clinical and epidemiological data regarding kidney issues in HIV-infected patients. OBJECTIVE: to improve global knowledge on kidney diseases in HIV-infected patients, focusing on clinical and epidemiological issues (prevalence, survival and prognostic factors) among HIV infection on dialysis or renal transplantation (RT) in Spain and Europe. METHODS: the following studies were conducted: three cross-sectional prevalence studies, one retrospective survival cohort study and two descriptive case series experiences. RESULTS AND CONCLUSIONS: the results are included in 6 original and 3 related studies with the following conclusions: 1.- Prevalence of HIV on dialysis units in Spain was 0.54% being higher on peritoneal dialysis. 2.- Spanish HIV-infected patients on dialysis were young males, with no-HIVAN glomerulonephritis and with a good control of HIV. In European patients a higher proportion of black race and HIVAN was found. 3.- 39.5% of HIV-infected patients on dialysis met criteria to be included on RT waiting list. Only 12% were already included. The most frequent exclusion criteria were related with poor control of HIV. 4.- HCV coinfection was present in 2/3 of HIV-infected patients on dialysis, was not associated with mortality but with lower access to RT. 5.- Survival of HIV-infected patients on dialysis was lower than that of matched HIV-negative patients. Factors related with poor prognosis were the absence of ART and peritoneal dialysis. 6.- Patients and graft survival rates of European HIV-infected RT recipients were similar to HIV-negative patients. Acute rejection was more frequent (30%). 7.- Thymoglobulin produced a profound lymphocytopenia that was not associated with increased risk of infections. 8.- Raltegravir had no interactions with immunosuppressants and can be used safely after transplant.

Tesi realitzada al Centre de Recerca en Agrigenòmica (CRAG) / Consorci CSIC-IRTA-UB-UAB / En esta tesis se aborda la identificación de factores del pulgón Myzus persicae que podrían participar en el proceso de transmisión del potyvirus del grabado del tabaco, Tobacco etch virus (TEV), y se explora la posibilidad de alterar la expresión de genes particulares en el insecto vector como una manera de dificultar o impedir la diseminación de este virus. Se conoce la intervención de un factor auxiliar de origen viral, la proteína HCPro, en la transmisión de potyvirus, actuando como un puente molecular reversible para retener las partículas de virus en el aparato bucal del pulgón. La proteína HCPro interacciona con la proteína de la cápside viral, CP, y previsiblemente con receptores específicos en el pulgón. Después de analizar un conjunto de productos capaces de interaccionar con la proteína HCPro de TEV (interactoma), se han considerado dos proteínas candidatas. La primera, MpRPS2, presenta homología con proteínas ribosomales, y la segunda MpRR1Cp2 es una proteína cuticular. La interacción entre HCPro y MpRPS2 se ha verificado en ensayos Far Western Blot y en el sistema de doble híbrido de levaduras. Los intentos para confirmar la localización de esta proteína en estiletes diseccionados de pulgón no fueron concluyentes, aunque con un antisuero específico sí se ha podido detectar la presencia de MpRPS2 en la cutícula de mudas de pulgón aisladas. Para validar la participación de estos hipotéticos receptores en el proceso de transmisión viral, se han explorado estrategias de interferencia con la expresión génica de MpRPS2 y MpRR1Cp2 en pulgones. Tras analizar sus niveles de expresión durante a lo largo del desarrollo, se consideraron dos sistemas para inducir respuestas de silenciamiento (RNAi) basados en la alimentación. El uso de dietas artificiales suplementadas con dobles cadenas de RNA específicas sintetizadas in vitro no produjo en general reducciones de la acumulación de RNA mensajeros, mientras que la alimentación de pulgones sobre plantas infectadas con un vector viral basado en el virus del cascabeleo del tabaco, Tobacco rattle virus (TRV), que contiene un fragmento de la secuencia del gen, tuvo un efecto más pronunciado. Las reducciones de expresión observadas fueron variables entre los dos genes, con el efecto más fuerte en el caso del gen MpRR1Cp2, en pulgones alimentados en plantas de tabaco infectadas con una variante de TRV que incorporaba un fragmento de este gen. Este sistema de RNAi nos ha permitido ensayar el efecto de la reducción de la expresión de los dos candidatos seleccionados en experimentos de transmisión de TEV. Estos resultados podrían ayudar a mejorar la comprensión de las interacciones moleculares necesarias durante la transmisión, a identificar factores en el vector que participan en el proceso, y eventualmente podrían usarse para el diseño de estrategias innovadoras de bloqueo de la diseminación viral basadas en la interferencia de la expresión de dichos factores. / This thesis addresses the identification of Myzus persicae aphid factors that could be involved in the transmission process of Tobacco etch virus (TEV), a potyvirus, and explores the possibility of altering the expression of specific genes in the insect vector as a way to prevent virus spread. An auxiliary factor of viral origin, the HCPro protein is known to participate in potyvirus transmission. HCPro acts as a reversible molecular bridge retaining virus particles in aphid mouthparts. HCPro interacts with the viral coat protein, CP, and predictably with specific receptors in aphid mouthparts. After analyzing a set of products able to interact with the TEV HCPro (interactome), we have considered two candidate proteins. The first one MpRPS2, shows homology with ribosomal proteins, and the second one, MpRR1Cp2 is a cuticular protein. The interaction between HCPro and MpRPS2 has been verified in Far Western Blot assays and in yeast two-hybrids. Attempts to confirm the localization of this protein in dissected aphid stylets were not conclusive, although using an specific antiserum it has been possible to detect the presence of the MpRPS2 in the cuticle of isolated aphid moults. To confirm the involvement of these hypothetical receptors in the viral transmission process, strategies of interference with expression of MpRR1Cp2 and MpRPS2 have been explored in aphids. After analyzing their expression levels along development, two systems based on feeding were considered to induce silencing responses (RNAi). The use of artificial diets supplemented with specific in vitro synthesized dsRNA did not produced reductions in mRNA accumulation, while aphids fed on plants infected with a viral vector based on Tobacco rattle virus (TRV), which contains a fragment of the targeted genes, showed more clear effects. The observed reductions in expression were rather variable between the two genes considered, with a stronger effect in the case of MpRR1Cp2 in aphids fed on tobacco plants infected with a TRV variant that incorporates a fragment of this gene. This RNAi system allowed us to test the effect of knocking down the expression of the two selected candidates in TEV transmission experiments. Our results might help to improve our understanding of the molecular interactions during transmission, to identify factors in the vector that participate in the process, and eventually could serve to design new strategies to interfere with viral dissemination based on specifically interfering with their expression.

El Ad es el vector más utilizado en ensayos clínicos con humanos. Para evitar la respuesta inmune celular inducida por los Ad de 1ª y 2ª generación, se han generado los vectores de 3ª generación, también llamados gutless o helper dependientes. Para producir estos vectores se necesitan tres elementos fundamentales: un Ad gutless con un gen terapéutico o marcador de interés; un Ad helper que aporte las proteínas virales necesarias in trans y; una línea celular permisiva para la producción de Ad. Los Ad gutless, al no contener ninguna región viral codificante, no generan respuesta inmune celular y tienen una capacidad de hasta 36 Kpb. Se ha demostrado que la expresión de los genes que incorporan puede durar toda la vida del organismo. Sin embargo, si bien presentan grandes ventajas, su uso en ensayos clínicos con humanos todavía no ha sido viable debido a dos grandes inconvenientes: la contaminación por Ad helper y su producción a gran escala. Para solventar el problema de la contaminación por Ad helper, en este trabajo se propone un nuevo sistema de generación de Ad gutless basado en la recombinasa ?C31-attB/attP. Los Ad helper generados llevan flanqueada su señal ? por las secuencias attB/attP. ?C31 es una recombinasa unidireccional con lo que una vez realizada su función, al escindir la señal de empaquetamiento, evita la reacción inversa. Esta característica supone una ventaja frente a otras recombinasas como Cre ó FLPe. Sorprendentemente, al incorporar la secuencia attB entre el extremo ITR del Ad y su señal de empaquetamiento, los Ad helper generados alargan su ciclo viral hasta las 56-60 horas, sin embargo, ello no afecta la replicación eficiente del genoma viral y la producción de proteínas virales. Asimismo, se ha demostrado que tanto el proceso de empaquetamiento como el de la maduración de la partícula viral están afectados. Se ha observado que la clonación de una segunda señal de empaquetamiento en el extremo 3' normaliza los niveles de producción de los Ad controles, confirmando así que el genoma no queda retenido en ninguna región nuclear. Ensayos de EMSA han mostrado que diferentes proteínas celulares se unen a la secuencia attB y probablemente la unión de una de ellas impida el correcto empaquetamiento del genoma adenoviral. Por todo ello, el empaquetamiento diferencial por tiempo de los Ad helper-attB/attP generados ha sido aprovechado para la producción de Ad gutless acotando su producción a las 36 horas (tiempo en el que un Ad control completa su ciclo viral). Sin embargo, en las producciones de Ad gutless, los niveles de contaminación por Ad helper fueron elevados y éstos aumentaban significativamente en los sucesivos pasos de amplificación. El análisis del extremo 5' del Ad helper confirmó que éste recombinaba con el Ad gutless por la señal de empaquetamiento perdiendo las secuencias de recombinación y así su capacidad de empaquetarse más lentamente. Sin embargo, la inversión de la señal de empaquetamiento supuso la demostración de que este efecto es fácilmente evitable lo que convierte al Ad helper Ad5/FC31.Cre.?R en una buena herramienta para la producción de Ad gutless. / Adenovirus is the most used vector in human clinical trials. In order to overcome cellular inmune response evoked by first and second generation adenovirus, third generation, also called gutless or helper-dependent adenovirus have been generated. Gutless adenovirus production needs three basic elements: a gutless adenovirus with a therapeutic or marker gene; a helper adenovirus which provide all viral proteins in trans and; a permisive cell line to produce adenovirus. Gutless adenovirus, without any codificant viral region, don't evoke cellular inmune response and can incorporate DNA inserts up to 36 Kb. It has been reported that the expresion of incorporated genes can last the whole life of the organism. Nevertheless, its use in human clinial trials is not suitable due two important inconvenients: helper adenovirus contamination and up-scale processes. To solve helper adenovirus contamination problem, this present work propose a new adenovirus gutless generation system based on ?C31-attB/attP recombinase. Helper adenovirus generated have flanked its packaging signal (?) by attB/attP sequences. ?C31 is an unidirectional recombinase which avoid reverse reaction. This characteristic is an important advantage in front of other recombinases such as Cre or FLPe. Surprisingly, attB sequence incorporated between Ad-ITR and ? lengthens adenovirus cycle up to 56-60 hours, However, this effect don't affect efficient genome replication or protein shyntesis. Moreover, it has been shown that packaging and maturation processes are affected. It has been observed that the cloning of a second ? in the 3'-ITR normalize production levels in comparison to control adenvovirus, proving adenovirus genome is not trapped in any nuclear region. EMSA assays have shown different cellular proteins interact with attB sequence and likely the interaction of one of this cellular proteins impairs the correct packaging of adenovirus genome. For this reason, differential packaging in time of attB/attP-helper adenovirus generated have been used to produce gutless adenovirus limiting production times at 36 hours (time when control adenovirus finish its viral cycle) . However, in gutless adenovirus productions, helper adenovirus contamination levels were high and they increase significantly in the successive amplification steps. The 5' extreme analysis showed helper and gutless adenovirus recombine by their ? loosing recombination sequences and, in this way, helper adenovirus slow packaging capacity. Nevertheless, the inversion of ? showed this effect can be easily avoided which make Ad5/FC31.Cre.?R helper adenovirus a good tool for gutless adenovirus production.

La caracterització genòmica del VHC al 1989, el desenvolupament de tècniques de detecció d’anticossos i, més recentment, la introducció de mètodes moleculars per a la identificació de l’ARN viral han permès pràcticament eliminar el risc de transmissió del VHC associat a la transfusió de productes sanguinis. No obstant, en la pràctica diària, les tècniques de cribatge d’anticossos i inclús els mètodes confirmatoris basats en immunoblots generen resultats indeterminats (presència d’anticossos enfront a un únic antigen viral en absència de virèmia), representant un problema pels Bancs de Sang a l’hora d’informar als donants sobre la causa de l’exclusió definitiva de la donació altruista. Per altra banda, tot i que l’eficàcia del tractament antiviral de la infecció persistent pel VHC ha millorat sensiblement en els últims anys, existeixen grups especials de pacients en els que la teràpia actualment disponible està contraindicada o és francament insuficient, pel que una millor comprensió dels mecanismes de persistència viral o resolució espontània de la infecció poden ser clínicament rellevants. La resposta immune cel·lular CD4+ i CD8+ tipus Th1 potent, multiespecífica i mantinguda és essencial per a la resolució espontània de la infecció, mentre que la infecció persistent es caracteritza per l’absència o la presència de cèl·lules específiques d’antigen funcionalment alterades. Estudis experimentals en ximpanzés han demostrat que l’absència de col·laboració per part dels limfòcits T CD4+ específics d’antigen condiciona la persistència viral, per la qual cosa és possible que la infecció crònica en l’ésser humà sigui deguda primàriament a una disfunció de la resposta CD4+. Les causes d’aquesta disfunció poden ser vàries, incloent la inducció d’anèrgia a través de lligands peptídics alterats tal com s’ha postulat en el cas de la tolerància a cèl·lules tumorals. En base a aquestes troballes, es van plantejar dos objectius principals de la tesi: (1) determinar el significat dels patrons d’immunoblot indeterminat en donants de sang i (2) avaluar la possible presència de limfòcits T CD4+ anèrgics en pacients amb infecció persistent, determinar la especificitat antigènica, i estudiar la possibilitat de restaurar la capacitat funcional de les cèl·lules T CD4+ específiques del VHC ex vivo. Els resultats dels estudis han permès demostrar en primer lloc que aproximadament la meitat dels donants amb patró d’immunoblot indeterminat representen curacions espontànies de la infecció, suggerint la utilitat de la tècnica d’ELISpot-IFN-γ per diferenciar donants falsos positius de les tècniques serològiques de cribatge d’aquells que presenten infeccions resoltes espontàniament. A més, es va determinar que la resposta cel·lular Th1 CD4+ enfront al domini helicasa de la proteïna NS3 és el factor discriminant de la resposta immune en infeccions resoltes. En el segon estudi es va demostrar presència de limfòcits T CD4+ específics de NS3 disfuncionals en la majoria dels pacients amb infecció persistent, independentment del seu perfil funcional, mitjançant l’activació transitòria antigen – específica del lligand del CD40 (CD154). També es va demostrar la possibilitat de revertir l’estat disfuncional de les cèl·lules T CD4+ específiques de NS3 mitjançant l’expansió in vitro en absència de l'estímul inductor d'anèrgia i en presència de citocines homeostàtiques (IL-7 i IL-15), proporcionant un nou instrument per entendre els mecanismes de persistència viral i investigar l'ús d'aquestes cèl·lules per a estratègies d'immunoteràpia adaptativa. / The HCV genome characterization in 1989, the development of antibodies detection techniques and, more recently, the introduction of molecular methods for identification of viral RNA have allowed to reduce the risk of HCV transmission associated with blood products transfusion. However, in current practice, the antibody screening techniques and the confirmatory methods based on immunoblot assays generate indeterminate results (antibodies against a single viral antigen in the absence of viremia), representing a problem for blood banks to inform donors about the cause of the definitive exclusion of altruistic donation. Moreover, although the effectiveness of antiviral treatment for persistent HCV infection has improved considerably in recent years, there are special groups of patients for whom currently available therapy is contraindicated or is frankly inadequate. A better understanding of the mechanisms of viral persistence or spontaneous clearance may be thus clinically relevant. Sustained persistence of powerful and multispecific CD4+ and CD8+ Th1 responses are essential for spontaneous HCV clearance, and persistent infection is characterized by the absence or the functional alteration of antigen-specific T cells. Experimental studies in chimpanzees have shown that the absence of HCV-specific CD4+ T lymphocytes cooperation can generate viral persistence, so it is possible that chronic infection in humans may be primarily due to a dysfunction of the CD4+ immune response. The causes of this dysfunction may be various, including the induction of anergy by altered peptide ligands, as has been postulated in the case of tolerance to tumour cells. Based on these findings, we raised two main objectives for this thesis: (1) to determine the significance of indeterminate immunoblot patterns in blood donors and (2) to evaluate the presence of CD4+ T lymphocytes with anergic phenotype in patients with persistent infection, to determine the antigenic specificity, and whether HCV-specific CD4+ T cells dysfunction can be reversed in vitro. Study results have allowed to demonstrate that approximately half of donors with indeterminate immunoblot pattern have resolved a previous HCV infection and suggested that ELISpot-IFN-γ might be a useful tool to distinguish donors with false positive serological techniques results from those with resolved spontaneous infections. In addition, we showed that the CD4+ Th1 immune response against NS3 helicase domain is the discriminate factor in the immune response in resolved infection. The second study showed that HCV-specific CD4+ T cells, although dysfunctional, are present in the peripheral blood of most patients with persistent HCV infection and can be easily detected, irrespectively of their functional profile, by the transient antigen - specific upregulation of CD40 ligand (CD154). We also demonstrated that it was possible to rescue NS3-specific CD4+ T cell response in most chronic HCV patients by in vitro expansion in the absence of HCV-specific antigen and presence of homeostatic cytokines (IL-7 and IL-15), providing a new tool to understand the mechanisms of viral persistence and investigate the use of these cells for immunotherapy of adaptive strategies.

Incorporating team context into research and practice concerning team effectiveness in multinational organizations still remains an ongoing challenge. The purpose of this dissertation was to explore the influence of industry, corporate culture, structure, strategy and task characteristics on MNTs in business organizations and to develop a more comprehensive framework connecting the internal dynamics with contextual aspects of MNTs functioning in companies in Europe and the USA. The study was conducted in an Austrian (VA TECH), a German (Henkel) and an American company (K&M International). Forty-two problem-centered interviews were conducted with 22 team members and 20 team leaders. Levels of uncertainty, stress and turbulence influence organizations and MNTs since teams and organizations have to reshape their strategies. Multinational strategy has a positive impact on MNTs while companies with a global strategy assign low value to diversity. MNT norms in companies with a strong corporate culture are reflective of the organizational culture. MNTs at companies with a weak corporate culture develop their own unique cultures and deviate from the values and norms set by the organization. Team composition, size and length of cooperation have a moderating effect on MNTs. We could identify several team leader competences that contribute to team success. The results show how teams reduce the complexity of operations by facilitating the creation and transfer of explicit and tacit knowledge and by transferring appropriate dimensions of the HQ corporate culture between geographically dispersed business units. (author's abstract)

En la segunda mitad del siglo XX se produjo probablemente la diseminación inicial del virus de la hepatitis C (VHC) a través de inyecciones parenterales poco seguras, procedimientos médicos y quirúrgicos invasivos, y transfusiones de sangre y hemoderivados.A finales de los años setenta se extendió en España el uso intravenoso de drogas, fundamentalmente heroína, lo que abrió una nueva vía de contagio: el uso compartido de material de inyección de drogas intravenosas. El pico de máxima incidencia de nuevos consumidores de heroína inyectada fue a comienzos de la década de los ochenta. En Europa se observan tres patrones de transmisión, el Norte de Europa, con baja prevalencia 0,1%-1% de la población general, la región centroeuropea, con una prevalencia media, y el sur de Europa (sur de Francia, España, Italia y Grecia) con prevalencias de 2,5-3-5%. Con el control de la transmisión nosocomial y transfusional, los genotipos más prevalentes pasaron a ser los relacionados con la adicción a drogas por vía parenteral, 1b, 3 y 4, en detrimento de los genotipos 1a y 2. Apareció entonces la pandemia del síndrome de inmunodeficicencia adquirida SIDA, cuyo agente causal, el VIH, fue rápidamente identificado. Hasta 1989 no se identifica el agente responsable de la hepatitis crónica noA noB, el Flavivirus VHC.Al compartir mecanismos de transmisión, ambas infecciones se entrecruzaron, dando lugar a un solapamiento de las dos epidemias que según algunas estimaciones podría afectar a 10-12 millones de personas. En nuestro país, la cifra de personas infectadas por el VIH-1 es aproximadamente 160.000, de las cuales globalmente, el 55%-65% están coinfectados por VHC, siendo esta cifra mayor entre aquellos que adquirieron la infección vía parenteral, hemofílicos y adictos a drogas, entre los que puede alcanzar el 80-90% de prevalencia, y más baja entre aquellos que adquirieron la infección por transmisión sexual, en los que la prevalencia es tan baja como 4-8%; estas diferencias se deben a que el VHC se transmite muy eficazmente vía parenteral, se estima que el 90% de los adictos de infectan en el primer año de adicción, y poco eficazmente por transmisión sexual. La transmisión vertical, aunque algo mayor en pacientes coinfectados, está alrededor del 10%.La coexistencia en el mismo enfermo de ambas infecciones tiene efectos deletéreos para ambas enfermedades. En la mayoría de los pacientes la respuesta inmunológica frente al VHC llega tarde o no es suficientemente vigorosa o completa, lo que permite una replicación viral sostenida que, a través de errores de trascripción en los continuos ciclos de replicación viral, dará lugar a una cuasi especie del VHC cada vez más adaptada al ambiente del huésped y, por tanto, con mayor capacidad para eludir su sistema inmunitario. La coinfección, además, se asocia con títulos mas elevados de ARN-VHC sobretodo en pacientes con CD4 bajos lo cual posiblemente refleja un déficit en el control de la replicación del VHC secundario a la inmunodeficiencia causada por el VIH-1. El valor de la carga viral del VHC en sangre no se ha relacionado con la evolución de la enfermedad pero si tiene valor pronóstico de cara a la respuesta al tratamiento. La enfermedad hepática progresa más rápidamente hacia la cirrosis y la muerte comportándose para algunos autores como una infección oportunista.En cuanto al VIH, la tolerancia al tratamiento antirretroviral y la respuesta inmunológica son peores en los pacientes coinfectados por el VHC. El VHC podría actuar como cofactor acelerando la progresión de la enfermedad por VIH-1 por diferentes mecanismos: mediante la estimulación del sistema inmunológico podría favorecer la replicación del VIH-1; además la infección de células inmunitarias por el VHC podría favorecer la depleción de linfocitos CD4 y reducir la recuperación inmunológica que acompaña a la supresión de la replicación viral con el tratamiento antirretroviral y, por último, la infección por VHC podría comprometer el beneficio proporcionado por dicho tratamiento como consecuencia de una más frecuente toxicidad hepática que motivaría interrumpir el tratamiento.Al comienzo de la pandemia de SIDA la mortalidad era tan masiva y precoz que minimizaba el impacto de la hepatitis crónica C entre los pacientes coinfectados. Pero incluso entonces ya había descripciones de cómo la infección VIH era capaz de modificar la historia natural de la hepatitis crónica C (HCC), acelerando la evolución hacia la cirrosis. Con el advenimiento del TARGA (terapia antirretroviral de gran actividad), a partir de 1996, la mortalidad por SIDA desciende dramáticamente, y es a partir de entonces que la mortalidad y morbilidad de causa hepática comienza a ser un problema y es responsable en gran medida del exceso de mortalidad de los pacientes infectados por VIH y VHC, comportándose como un epidemia dentro de la epidemia de SIDA. La presente tesis doctoral se presenta como compendio de publicaciones según la normativa aprobada por la Comisión de Doctorado del Consejo de Gobierno de este Universidad en julio de 2008. Los trabajos presentados se enmarcan un una misma línea de investigación: el cuidado de los enfermos de hepatitis crónica C e infección VIH-1.ARTÍCULOS, INCLUIDOS COMO ANEXOS:1. Laguno M, Cifuentes C, Murillas J, Veloso S, Larrousse M, Payeras A, Bonet L, Vidal F, Milinkovic A, Bassa A, Villalonga C, Pérez I, Tural C, Martínez- Rebollar M, Calvo M, Blanco JL, Martínez E, Sánchez-Tapias JM, Gatell JM, Mallolas J. "A randomized trial to compare the efficacy and safety of PEGinterferon alfa-2b plus ribavirin versus PEG-interferon alfa-2a plus ribavirin for treatment of chronic hepatitis C in HIV co-infected patients". Hepatology 2009; 49:22-3102. Laguno M, Larrousse M, Murillas J, Blanco JL, León A, Milinkovic A, Loncá M, Martinez E, Sánchez-Tapias JM, de Lazzari E, Gatell JM, Costa J, Mallolas J. "Predictive Value of Early Virologic Response in HIV/Hepatitis C Virus- Coinfected Patients Treated With an Interferon-Based Regimen Plus Ribavirin". J Acquir Immune Defic Syndr. 2007 Feb 1; 44(2):174-8.3. Laufer N, Laguno M, Perez I, Cifuentes C, Murillas J, Vidal F, Bonet L, Veloso S, Gatell JM, Mallolas J. "Abacavir does not influence the rate of virological response in HIV-HCV-coinfected patients treated with pegylated interferon and weight-adjusted ribavirin". Antivir Ther. 2008; 13(7):953-7.4. Murillas J, Rimola A, Laguno M, De Lazzari E, Rascón J, Aguero F, Blanco JL, Moitinho E, Moreno A, Miro JM, and the ESLD-HIV Working Group Investigators. "The Model for End-Stage Liver Disease Score Is the Best Prognostic Factor in Human Immunodeficiency Virus 1-Infected Patients with End-Stage Liver Disease: A Prospective Cohort Study". Liver Transplantation 2009, en prensa.5. Murillas J, Del Río M, Riera M, Vaquer P, Salas A, Leyes M, Angeles Ribas M, Peñaranda Vera M, Villalonga C. "Increased incidence of hepatocellular carcinoma (HCC) in HIV-1 infected patients". Eur J Intern Med. 2005 Apr; 16(2):113-115.6. Miró JM, Murillas J, Laguno M, Tuset M, Aguero, Moreno A, Rimola A and the Hospital Clinic OLT in HIV Working Group. "Liver Transplantation in HIV-Infected Patients: Update in 2006". HEPATOLOGY Reviews 2006; 3:16-29

El hombre excreta una gran cantidad de virus a través de las heces y la orina, que llegan al medio acuático y se dispersan. Su gran estabilidad hace que en muchas ocasiones los procesos de depuración actualmente aplicados no consigan eliminarlos completamente. La ingestión de agua o alimentos contaminados puede provocar una gran diversidad de enfermedades, incluso con dosis infecciosas muy bajas. En este estudio se ha desarrollado una metodología para la recuperación de partículas víricas a partir de muestras de agua, suspensiones fecales y moluscos bivalvos, basados en la elución de los virus a partir del material particulado, utilizando tapón glicina a pH 9,5-10 y concentración por ultracentrifugación o ultrafiltración. Dicha metodología fue aplicada para evaluar la contaminación vírica del medio acuático del área metropolitana de Barcelona, que representa una población de aproximadamente dos millones de personas.

The ability to mount an efficient immune response should be an important life-history trait as parasitism can impact upon an individual's fecundity and survival prospects, and hence its fitness. However, immune function is likely to be costly as resources must be divided between many important traits. Whilst many studies have examined host resistance to particular parasite types, fewer have considered general immune responses. Studies that have considered general immune responses tend to do so in vertebrate models. However, the complexity of the vertebrate immune system makes the examination of evolutionary aspects of immune function difficult. Using larvae of the genus Spodoptera (Lepidoptera: Noctuidae) as a model system, this study examines' genetic and phenotypic aspects of innate immunity. The aims were to assess the levels of additive genetic variation maintained in immune traits, to consider possible costs that could maintain this variation, and to assess the role of phenotypic plasticity in ameliorating those costs. A key finding of this study was that high levels of additive genetic variation were maintained in all of the measured Immune traits. Analysis of the genetic correlations between traits revealed potential trade-offs within the immune system and between immune components and body condition. In addition, it was shown that larvae living at high densities invest more in immune function than those living in solitary conditions, suggesting that larvae can minimise the costs of immune function by employing them only when the risk of pathogenesis is high.

Das Thema dieser Dissertation ist die Frage, wie kulturelle Unterschiede zwischen deutschen und israelischen Personalmanagement-Stilen und Arbeitsnormen zu Problemen in der täglichen Arbeit führen können und wie man diese Probleme vermeiden bzw. mit ihnen besser umgehen kann. Der zentrale Zugang zur Beantwortung dieser Frage wurde über deutsche ManagerInnen, die in Israel Niederlassungen von deutschen oder österreichischen Firmen leiten, und über israelische ManagerInnen, die in israelischen Niederlassungen deutscher oder österreichischer Firmen tätig sind, gesucht. Im theoretischen Teil der Dissertation wurde die deutsch- und englischsprachige (US-amerikanische, britische und israelische) Fachliteratur zum Thema 'internationales Personalmanagement' und 'Arbeitsnormen' referiert, im praktischen Teil wurden leitfaden-orientierte Interviews mit ManagerInnen aus Deutschland und Israel durchgeführt und ausgewertet. Als Ergebnis dieser Dissertation sind die Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Personalmanagement und den Arbeitsnormen, die auf die unterschiedlichen Kulturen zurückzuführen sind, aufgezeigt und erklärt worden. (Autorenref.)