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Aquesta tesi doctoral per compendi de publicacions avalua la importància clínica de les variants del VIH-1 minoritàries que alberguen mutacions de resistència. La primera publicació presenta una avaluació sistemàtica de la PCR específica d'al·lel (ASPCR) com a eina per detectar variants víriques minoritàries que amb mutacions de resistència a la transcriptasa inversa (M184V, M184I) i proteasa (regions de D30N), així com a la envolta (V38A). A la segona publicació, utilitzem aquesta tècnica conjuntament amb d'altres per caracteritzar amb alta resolució la dinàmica de pèrdua de mutants M184V a pacients infectats amb el VIH-1 resistents a múltiples tractaments i que interrompen tractament amb inhibidors de la transcriptasa inversa i continuen amb inhibidors de la proteasa. Aquest estudi mostra que la ASPCR es pot utilitzar per calcular la fitness de variants al·lèlics particulars in vivo i ajuda a millorar la nostra comprensió de dinàmica de la quasispecie viral en presència i absència de tractament antiretroviral. La tercera publicació mostra com es pot aplicar la detecció de mutants minoritàries a l'estudi de la resistència antiretroviral primària, duplicant o triplicant la prevalença de mutacions de resistència en comparació amb seqüenciació poblacional de virus a plasma. A la quarta publicació, mostrem que dones embarassades infectades pel VIH-1 i naive als antiretrovirals freqüentment seleccionen mutacions de resistència a antiretrovirals amb barrera baix genètica durant teràpia antiretroviral limitada a l'embaràs; de nou, la freqüència de mutacions de resistència augmenta més de dues vegades amb l'assaig d'ASPCR. Aquests descobriment te implicacions clíniques importants, doncs les dones que seleccionin mutacions de resistència durant la teràpia antiretroviral limitada a l'embaràs tenen més risc de fracassar a un tractament antiretroviral després del part. A la cinquena publicació demostrem que la detecció de variants minoritàries resistents als anàlegs de la transcriptasa inversa no-nucleòsids s'associa a un increment del risc de fracàs virològic a una primera línea de tractament antiretroviral amb efavirenz als pacients que prenen el fàrmac correctament. En resum, aquest treball demostra que les variants del VIH minoritàries resistent, que sovint no es detecten pels assaigs de resistències estàndards, modifiquen la resposta al tractament antiretroviral i per això són d'una importància clínica essencial. / This doctoral thesis by compendium of publications addresses the clinical relevance of minority HIV-1 variants harboring resistance mutations. The first publication presents a systematic evaluation of allele-specific polymerase chain reaction (ASPCR) as a tool to detect low-frequency viral variants harboring resistance mutations in the reverse transcriptase (M184V, M184I) and protease (D30N)-coding regions of pol, as well as in env (V38A). In the second publication, we use this technique alongside others to characterize with high resolution the decay dynamics of M184V mutants in subjects infected with multidrug-resistant HIV-1 who interrupt treatment with reverse transcriptase inhibitors and continue protease inhibitors. This study shows that ASPCR can be used to estimate the fitness of particular allelic variants in vivo and helps to improve our understanding of quasispecies dynamics in the presence and absence of therapy. The third publication shows how detection of low-frequency mutants can be applied to the surveillance of primary antiretroviral resistance, increasing the prevalence of resistance mutations by 2 to 3-fold relative to using bulk sequencing of plasma viruses. In the fourth publication, we show that antiretroviral naïve HIV-1-infected pregnant women frequently select resistance mutations to drugs with low-genetic barrier during pregnancy-limited antiretroviral therapy; again, the frequency of resistance mutations increases more than two-fold using the ASPCR assay. These findings have important clinical implications, given that women selecting resistance mutations during pregnancy-limited antiretroviral therapy may be more likely to fail postpartum antiretroviral therapy. In the fifth publication we demonstrate that pre-existing minority variants harboring resistance to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors more than triple the risk of virological failure to first-line efavirenz-based antiretroviral therapy in drug-adherent subjects. In summary, this work demonstrates that minority HIV-1 resistant variants, which are often missed by standard viral population sequencing assays, do modify antiretroviral therapy outcomes and therefore are of major clinical importance.

Aquest treball s'emmarca dins d'una de les principals línees d'investigació del nostre grup, dirigida a l'avaluació d'estratègies aplicables a l'obtenció de varietats d'arròs resistents a patògens i insectes plaga mitjançant transformació genètica. L'objectiu general ha estat l'expressió simultània de gens vegetals que codifiquen proteïnes insecticides i antifúngiques en plantes d'arròs transgèniques. En primer lloc s'ha avaluat l'eficàcia de l'expressió d'un gen fusió que codifica dos inhibidors de proteases, els gens mpi de blat de moro (maize proteinase inhibitor) i pci de patata (potato carboxypeptidase inhibitor). Per a l'expressió simultània d'aquets dos gens s'han utilitzat vàries estratègies, com són, 1) l'ús d'una seqüència viral anomenada "2A" capaç de patir autoprocessament, 2) mitjançant una seqüència de processament de la protoxina Cry1B (definida com a seqüència "C") processada per enzims d'insectes o 3) mitjançant creuament de línees d'arròs pci i mpi. En segon lloc, s'ha estudiat l'ús d'un gen regulador de la resposta de defensa a Arabidopsis, el gen AtNPR1 (Non Expressor of Pathogenesis Related genes 1), com a transgen per l'expressió simultània de gens de defensa endògens de la planta d'arròs El gen fusió mpi-pci s'expressa correctament sota el seu propi promotor i terminador. Quan s'utilitza la seqüència 2A, el producte obtingut (proteïna MPI-2A-PCI) es processa parcialment a la cèl·lula d'arròs, mentre que la MPI-C-PCI s'acumula com a poliproteïna no processada. L'expressió del gen mpi-pci emprant ambdues estratègies (2A and C) confereix resistència front infestació amb larves del lepidòpter plaga (Chilo suppressalis). Bioassaigs amb plantes transgèniques d'arròs mpi-pci infestades mostren una reducció significativa del pes larval en comparació amb larves control. Tot i que tradicionalment s'ha atribuït un paper insecticida als inhibidors de proteases vegetals, hem demostrat el potencial del PCI com a agent antifúngic. Així, plantes transgèniques que expressen constitutivament el gen pci mostren resistència vers patògens de gran importància econòmica com Magnaporthe oryzae i Fusarium verticillioides. S'ha purificat una carboxipeptidasa de M. oryzae mitjançant cromatografia d'afinitat i posteriorment s'ha caracteritzat per espectrometria de masses. Aquesta proteïna fúngica resulta ser una nova carboxipeptidasa B (MoCPB) que és totalment inhibida pel PCI. En conjunt, aquests resultats indiquen que el PCI exerceix la seva activitat antifúngica mitjançant la inhibició d'aquesta carboxipeptidasa fúngica. A la segona part de la tesi, s'ha demostrat que l'expressió constitutiva en arròs del gen AtNPR1 d'Arabidopsis confereix resistència front els patògens fúngics M. oryzae i F. verticillioides, i el patogen bacterià Erwinia chrysantemi. S'ha determinat que la resistència observada vers M. grisea, està associada a un augment en la capacitat de la planta per activar els mecanismes endògens de defensa en condicions d'infecció, concretament l'expressió dels gens de defensa PR-1b, TLP (PR-5), Sci1 (PR-6), PR-10 i PBZ. Les plantes transgèniques AtNPR1 crescudes en condicions d'hivernacle presenten un tamany menor i produeixen menys llavors que les plantes no transformades. Les plantes AtNPR1 desenvolupen lesions espontànies a les fulles al ser crescudes en condicions de baixa intensitat de llum. Aquestes lesions van acompanyades d'una sèrie d'efectes citològics com són l'acumulació de l'ió superòxid i de compostos fluorescents en la paret cel·lular, fenòmens que mimetitzen la resposta hipersensible de defensa. Contràriament a la resistència observada vers patògens fúngics i bacterians, les plantes d'arròs AtNPR1 presenten una major susceptibilitat al Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). A més, l'expressió constitutiva del gen AtNPR1 regula negativament l'expressió de gens que participen en la resposta a estrès salí i sequera, com són els gens rab21, salT i dip1, resultant en una major sensibilitat a aquests dos tipus d'estrès abiòtics. Aquestes observacions suggereixen que el gen AtNPR1 en arròs presenta tant un paper positiu com negatiu en la resposta de defensa a estressos biòtics i abiòtics. / This work is part of integrated project focused on the improvement of resistance against pests and phytopathogens in rice. The general goal has been the simultaneous expression of genes encoding insecticides and antifungal proteins in transgenic rice plants. As a first approach, the effectiveness of the expression of a fusion gene that encodes two protease inhibitors, genes mpi (maize proteinase inhibitor) and pci (potato carboxypeptidase inhibitor) has been evaluated. The proteinase inhibitors are part of the natural defence system of plants against insect predation. For the simultaneous expression of these two genes has been used several strategies, including (1) the use of a viral sequence called "2A", a self-cleaving oligopeptide, (2) through a sequence of processing the protoxina Cry1B processed by insect enzymes (defined as a sequence 'C') or (3) by crossing pci and mpi lines of rice. Secondly, a regulator gene of the defence response in Arabidopsis (gene AtNPR1; Non Expressor of Pathogenesis Related gene 1) has been used as transgen for the simultaneous expression of endogenous defence genes in rice plant.The gene fusion mpi-pci is expressed correctly under the control of the mpi wound-inducible promoter and terminator regions. Using the processing sequence 2A, the protein product (MPI-2A-PCI) is partially processed in transformed rice cell, whereas MPI-C-PCI accumulates as a non-processed polyprotein. Expression of mpi-pci gene using both strategies (2A fragment and sequence C) confers resistance against the striped stem borer (Chilo suppressalis) larvae in transgenic rice plants. Bioassays performed with transgenic rice plants expressing the mpi-pci gene and infested with Chilo larvae showed a significant reduction of the larval weight compared with the control larvae group. Although the role of plant protease inhibitors has been described exclusively in the defense against insect attack, we reported about the potential role of the PCI inhibitor involved in resistance to fungal pathogens. Rice plants expressing constitutively the pci gene exhibit resistance against the economically important pathogens Magnaporthe oryzae and Fusarium verticillioides. By affinity chromatography a carboxypeptidase of M. oryzae was purified using the PCI protein, and subsequently characterized by mass spectrometry. This fungal protein came out to be a novel carboxypeptidase B (MoCPB) which was fully inhibited by PCI. Homology-based modelling revealed structural similarities between the predicted structure of the MoCPB and the crystal structure of insect carboxypeptidases. Overall, these results indicate that PCI exerts its antifungal activity through the inhibition of this particular fungal carboxypeptidase. In the second part of this work we demonstrated that constitutive expression of the Arabidopsis AtNPR1 gene in rice confers resistance against the fungal pathogens M. oryzae and F. verticillioides, and the bacterial pathogen Erwinia chrysantemi. The protection of AtNPR1 against M. oryzae is due to the priming expression of salicylic acid-responsive endogenous genes (PR1b, PR5, HR-6, PR10 and PBZ). Transgenic AtNPR1 rice plants grown in the greenhouse showed growth retardation, reduced height and smaller seeds than wild type plants. When transferred to plant growth chambers, AtNPR1 plants developed spontaneous lesions (lesion mimic phenotype) showing typical cellular markers of lesion formation, such as accumulation of superoxide ions and autofluorescent material in the cell walls. On the other hand, AtNPR1-expressing rice plants showed a higher susceptibility to infection by the Rice Yellow Mottle Virus (RYMV). Moreover, AtNPR1 negatively regulates the expression of genes playing a role in the plant response to salt and drought stress, namely the rab21, salT and dip1 genes, resulting in a higher sensitivity to both types of abiotic stress. These observations suggest that AtNPR1 has both positive and negative regulatory roles in mediating defence responses against biotic and abiotic stresses.

ANGLÈS A grape-seed derived procyanidins extract (GSPE) was reported to mimic some of the physiological effects of insulin. However, GSPE showed some divergences when compared to insulin action, which suggests that procyanidins could be useful on a state of impaired insulin action. Therefore, the main purpose of this thesis was to understand how dietary procyanidins modulate glucose metabolism, mainly in adipose tissue and under an insulin resistant condition.Results show that a treatment of 25 mg GSPE/Kg bw for 30 days on cafeteria-diet-fed rats has a positive effect in improving some insulin resistance parameters and that white adipose tissue is also a clear target for procyanidins. Cell culture studies showed the ability of procyanidins for activating the insulin receptor and its ability for activating proteins kinases involved in the insulin signalling pathway. The GSPE study was completed showing that oligomeric structures of GSPE can reproduce the total GSPE effects. / CATALÀ A un extracte de procianidines de pinyol de raïm (GSPE) se l'hi han atribuït efectes mimètics d'algun dels efectes fisiològics de la insulina, però alhora la seva acció mostra algunes divergències respecte la pròpia hormona. Aquest fet suggereix un possible interès d'aquestes procianidines en patologies vinculades amb la resistència a la insulina. Per aquest motiu, l'objectiu principal d'aquesta tesi és entendre com les procianidines de la dieta modulen el metabolisme de la glucosa, principalment a teixit adipós i sota una condició de resistència a insulina. Els resultats obtinguts mostren que 30 dies de tractament amb 25 mg GSPE/Kg PC milloren la situació de resistència a insulina provocada per una dieta de cafeteria i evidencien que el teixit adipós és una clara diana per GSPE. En cèl·lules en cultiu s'observa com GSPE activa el receptor de la insulina i proteïnes de la via de senyalització de la insulina de manera diferent a la pròpia hormona. L'estudi es completa demostrant que les estructures oligomèriques de GSPE poden reproduir els efectes fins ara atribuïts a les procianidines.

DE LA TESI DOCTORAL: L'augment de la incidència de bacteris amb resistència als agents antimicrobians és deguda a les característiques intrínseques de les soques antimicrobianes, a una pressió selectiva per l'ús extensiu dels antibiòtics i a uns canvis socials i tecnològics que ha facilitat la transmissió d'organismes resistents o de gens de resistència. Aquest constitueix un problema sanitari de primera magnitud. Els bacteris presenten característiques que poden influir poderosament en l'emergència i la transmissió dels gens que codifiquen per a la resistència als agents antimicrobians.Els mecanismes de resistència dels bacteris als antibiòtics poden ser diversos. Des de la inactivació enzimàtica de l'antibiòtic, la modificació de la diana de l'antibiòtic així com mecanismes de caire més generals com la disminució de la permeabilitat de la membrana, l'expressió de bombes de reflux i l'intercanvi de material genètic per transferència de plasmidis, transposons o integrons. Precisament aquests últims mecanismes són objecte de la present tesi doctoral.El nostre grup de recerca ha treballat durant anys sobre diferents mecanismes de resistència als antibiòtics en diferents espècies bacterianes, continuant a l'actualitat amb aquesta activitat investigadora.Com a objectiu general d'aquesta tesi ens plantegem la caracterització molecular i funcional dels mecanismes de resistència d'un bacteri Gram negatiu: Morganella morganii. I en concret s'ha centrat en els següents punts:1. Investigar la susceptibilitat antimicrobiana de diverses soques de Morganella morganii d'origen clínic. 2. Investigar la importància de la permeabilitat de les envoltes cel·lulars bacterianes de Morganella morganii a diferents antibiòtics.3. Realitzar experiments de transformació i conjugació amb les soques clíniques resistents.4. Obtenir la porina de Morganella morganii purificada i realitzar estudis físico-químics seguint la tècnica de lipid planar bylayer.5. Investigar sobre l'existència d'integrons en la soca de Morganella morganii resistent i obtenir les seqüències dels gens de resistència inserits en aquests integrons.6. Estudiar la possible funcionalitat de bombes de reflux que puguin expulsar els antibiòtics fora de la cèl·lula.

En los últimos años ha habido un incremento en la aparición de nuevas enfermedades infecciosas y en la reemergencia de otras que se consideraban ya controladas. La situación actual es preocupante porque muchos de estos nuevos agentes patógenos causan enfermedades graves. En muchas de estas infecciones, la resistencia a los fármacos se está convirtiendo en uno de los obstáculos principales para su control, con la aparición de cepas multiresistentes a los antibióticos normalmente utilizados. ¿Cuales son las claves para el éxito de estas bacterias patógenas? Para responder esta pregunta, se realizan estudios sobre los mecanismos por los cuales los microorganismos causan la enfermedad, es decir, la patogénesis. Pero también existen cuestiones importantes sobre la evolución de la patogénesis de estos microorganismos que continúan siendo una incógnita: ¿cuales son los factores que determinan la emergencia de un nuevo patógeno?, ¿cuando se desarrollan determinados clones patógenos?, ¿porqué cepas no patógenas presentan genes asociados a la virulencia? Los estudios de genética de poblaciones contribuyen a este conocimiento, proporcionando información sobre la estructura poblacional y la naturaleza de la variación genética que existe en las poblaciones naturales ya que la cantidad de variación genética de una población es un parámetro fundamental, debido a que determina el potencial evolutivo de ésta. Los cortos períodos de generación de la mayoría de las bacterias y el enorme tamaño de sus poblaciones, hace que los cambios evolutivos sean muy rápidos. La dinámica de aparición y selección de mutantes o la importancia relativa de la mutación y de la recombinación en estas poblaciones, son efectos esenciales para comprender los cambios epidemiológicos que se producen en ellas. Estudiar las poblaciones bacterianas también nos permite caracterizar las cepas de las especies patógenas; pero también es importante comprender las relaciones genéticas existentes entre cepas patógenas, causantes de la enfermedad, y cepas no patógenas de una misma especie bacteriana. La comparación entre ambas poblaciones puede ayudarnos a explicar los orígenes de las cepas patógenas e identificar las diferencias genéticas entre las dos. Se ha observado que, generalmente, se da una asociación aparente entre determinados clones de la bacteria, que se encuentran en pequeña proporción, y el desarrollo de una enfermedad; por tanto, esto sugiere que hay una menor diversidad en las cepas patógenas que en las de vida "libre". Estas observaciones han sugerido que la mayoría de las bacterias presentan una estructura poblacional clonal. Más recientemente, el aumento del número de bacterias estudiadas y la aplicación de técnicas moleculares, han dado lugar a la observación de que la estructura clonal de las poblaciones se puede "romper" por acción de la recombinación genética, aunque su papel no es igual en todas las especies bacterianas. La transferencia horizontal de genes tiene una gran relevancia en la epidemiología de las enfermedades causadas por bacterias patógenas. Se ha observado una marcada diferencia en el grado de recombinación entre cepas patógenas y cepas no patógenas, aunque no se conocen las causas. La adquisición de material extracromosómico tiene consecuencias importantes en la evolución de las bacterias, tanto a corto plazo, por la distribución horizontal de genes de resistencia, como a largo plazo, por la adquisición de nuevos determinantes de virulencia o propiedades metabólicas que puedan producir un cambio significativo en la patogenicidad o que afecten al hábitat ecológico donde residen. Por tanto, la variación genotípica en las poblaciones de los microorganismos patógenos, plantea importantes dificultades en el control de les enfermedades infecciosas (emergencia de nuevas cepas patógenas, aparición de poblaciones de bacterias resistentes a los antibióticos, dificultades asociadas a la obtención de vacunas contra microorganismos antigénicamente diversos o variantes).P. aeruginosa es una bacteria Gram negativa y cosmopolita, y es una de las principales causas de infecciones en cáncer, transplantes, quemados y en pacientes con fibrosis cística. Estas infecciones son muy difíciles de erradicar ya que este microorganismo presenta una elevada resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, lo que lo hace responsable de infecciones nosocomiales de difícil tratamiento y de elevada morbi-mortalidad. En los últimos años se ha observado un incremento progresivo en la incidencia de cepas resistentes a diversos antibióticos de última generación como por ejemplo el imipenem y de cepas que presentan una sensibilidad disminuida simultáneamente a diversos grupos de antibióticos como penicilinas, cefalosporinas con actividad anti-pseudomónica, quinolonas y aminoglicósidos, situación que ha agravado notablemente la dificultad terapéutica que habitualmente comportan las infecciones causadas por este patógeno. ¿Tienen las cepas patógenas que viven en el interior de los hospitales alguna relación genética con las cepas que viven libremente en el entorno de éstos? ¿Qué mecanismos de resistencia han utilizado estas cepas patógenas para "evadir" la acción de los antimicrobianos utilizados contra ellas? En este trabajo hemos tratado de hacer una aproximación a la respuesta de estas preguntas, centrándonos en las poblaciones de Pseudomonas aeruginosa del hospital de Bellvitge y su entorno.La línea principal de investigación de nuestro grupo de trabajo se centra en los mecanismos moleculares de extensión de los caracteres de resistencia de las bacterias Gram negativas a los agentes antimicrobianos. La presente tesis se inscribe en el núcleo de la actividad del grupo. Se ha pretendido explorar las relaciones existentes entre aislamientos clínicos y ambientales de Pseudomonas aeruginosa en relación a la susceptibilidad a los agentes antimicrobianos.Este objetivo de carácter general se puede subdividir en los siguientes apartados: 1. Aislar cepas ambientales y seleccionar cepas clínicas aisladas en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Bellvitge.2. Determinar la susceptibilidad a los antimicrobianos de los distintos aislamientos y comparar las posibles diferencias de susceptibilidad entre los grupos.3. Explorar la contribución de las propiedades de la membrana externa a los perfiles de susceptibilidad a los antimicrobianos. 4. Analizar la variabilidad fenotípica y genotípica de los aislados en base a la información obtenida de metodologías moleculares como: perfiles electroforéticos de las proteínas de la membrana externa (OMPs), electroforesis en campo pulsante (PFGE) y amplificación de fragmentos de DNA con cebadores aleatorios (RAPD). 5. Elaborar un modelo aproximativo de la estructura de las poblaciones de P. aeruginosa en el ambiente "Hospital Universitario de Bellvitge" (Hospital y entorno).6. Estudiar la eventual presencia de integrones en los dos grupos de bacterias y determinar los genes que incorporan.7. Estudiar las mutaciones de la proteína OprD y su relación con la resistencia a los antibióticos en las cepas estudiadas.8. Realizar una aproximación al modelo estructural de la proteína OprD.Las conclusiones obtenidas después de llevar a cabo los experimentos para la consecución de los diversos obtenidos, son las siguientes: 1. Las cepas clínicas son más resistentes a los antibióticos que las cepas ambientales, debido a la fuerte presión que existe en el entorno hospitalario, y que favorece a las cepas que desarrollan mecanismos para evadir la acción de diferentes antimicrobianos. Estas diferencias en la susceptibilidad sugieren, además, cierto grado de aislamiento ecológico entre las dos poblaciones, ya que las cepas clínicas se encontrarían en un hábitat, que presenta una elevada presión selectiva por parte de los antibióticos y desinfectantes, y en cambio las cepas ambientales estarían en otro hábitat separado donde esta presión no existe.2. Técnicas que miden la variabilidad fenotípica y genotípica como las proteínas totales (PT), proteínas de membrana externa (OMPs), la electroforesis de campo pulsante (PFGE) y la amplificación de polimorfismos de DNA al azar (RAPD) utilizando el primer 208, confirman la distancia entre los aislados de los dos orígenes.3. El conjunto de los resultados nos sugiere que la población de P. aeruginosa en nuestro entorno (Hospital de Bellvitge y alrededores), podría ser una población clonal epidémica, en la cual todas las cepas provienen de una población ambiental muy diversa, y de la que un clon ha emergido para dar lugar a la población clínica que, una vez establecida, vuelve a diversificarse.4. La ausencia/presencia de la proteína OprD en la membrana externa de Pseudomonas aeruginosa, no explica totalmente los patrones de resistencia/susceptibilidad observados en las cepas investigadas. 5. La existencia de cepas sensibles al imipenem que no presentan OprD en sus membranas externas, sugiere la presencia de otro mecanismo secundario de entrada del imipenem a las células, independiente de OprD.6. A falta de un modelo estructural basado en la cristalización, nuestro modelo tridimensional de la proteína OprD confirma las predicciones, anteriormente realizadas, de la estructura del heterómero del que está constituido esta porina.

Los individuos expuestos al VIH-1 y no infectados y los pacientes infectados no progresores de larga duración son situaciones modelo para estudiar factores del huésped implicados en conferir resistencia a la infección / progresión y su conocimiento puede ser esencial para desarrollar nuevas estrategias preventivas y terapéuticas. El diseño del estudio fue un análisis de la frecuencia de nuevos factores inmunogenéticos, que potencialmente podrían estar implicados en la resistencia/pogresión de la infección, no descritos previamente en 4 grupos de individuos muy bien definidos: 1) pacientes VIH+ con progresión lenta de la infección, 2) pacientes con progresión normal de la infección, 3) individuos con exposición a la infección por el VIH, que permanecen seronegativos y 4) controles sanos.El primer factor inmunogenético analizado fueron los polimorfismos en el receptor alfa de la IL-4. La IL-4 in vitro disminuye la expresión de CCR5 y aumenta la expresión de CXCR4 y además potencia la diferenciación de los linfocitos Th hacia una respuesta tipo 2, por lo que las diferentes variantes podrían influir en la resistencia a la infección o progresión hacia sida. Los polimorfismos analizados fueron I50V en el exón 5 (extracelular) y 6 polimorfismos localizados en el exón 12 (intracelular). Los principales resultados obtenidos fueron: 1) la variante homozigota V50 se asoció con la progresión lenta de la infección por el VIH y 2) la presencia de haplotipos infrecuentes en el exón 12 se asoció a una mayor susceptibilidad a la infección por el VIH tras una exposición parenteral. El segundo trabajo parte de que la activación de linfocitos CD4 vía CD28 modula la expresión de los principales co-receptores del VIH-1, CCR5 y CXCR4. Por ello, se analizó la presencia de posibles posibles polimorfismos en la región 5'UTR del gen de CD28. Los resultados obtenidos fueron: 1) la presencia de un polimorfismo que consiste en la inserción de 5 nucleótidos y 2) que esta variante se encuentra con más frecuencia en los pacientes infectados con respecto a aquellos pacientes repetidamente expuestos al VIH por vía sexual, que permanecen seronegativos. Estos datos sugieren que esta variante favorecería la infección por el VIH a través de las mucosas. El tercer y último trabajo analiza el polimorfismo en la región no traducida del gen SDF-1 (SDF1-3'A), ligando natural del CXCR4. Esta mutación en su forma homozigota se ha relacionado con progresión lenta hacia el desarrollo de SIDA, aunque otros trabajos no confirman estos resultados e incluso lo contradicen. Las consecuencias biológicas de esta mutación no se conocían por lo que consideramos como objetivos de trabajo, correlacionar los niveles de SDF-1 con la presencia o no de la mutación SDF1-3'A, analizar el genotipo, los niveles de SDF-1 y la expresión de CXCR4 en los diferentes grupos de estudio. Las principales conclusiones fueron: 1) la mutación SDF1 3'A-3'A no se asoció a progresión lenta de la infección, 2) la presencia homozigota de la mutación SDF1-3'A, se asoció a concentraciones bajas de SDF-1, 3) la infección por el VIH se acompañó de una elevación de los niveles de SDF-1 y un descenso en la expresión de CXCR4. Este patrón se mantuvo en los pacientes LTNP, mientras que en los pacientes con progresión normal de la infección y especialmente en aquellos con una fase muy avanzada de la enfermedad y 4) en nuestro estudio la mutación SDF1-3'A no se asoció a resistencia al VIH-1.

La capacidad de Acinetobacter baumannii para causar infecciones nosocomiales se relaciona con su habilidad para desarrollar rápidamente resistencia a los antibióticos, junto con la capacidad que tiene este organismo para sobrevivir durante largos períodos de tiempo en el hábitat hospitalario.A pesar de ser un problema emergente en la UCIs, falta mucha información sobre los mecanismos de virulencia y resistencia a los antimicrobianos, a la desecación y a la desinfección. Los objetivos principales de este trabajo fueron estudiar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos en cepas clínicas de la especie Acinetobacter, haciendo énfasis en la identificación de nuevas bombas de expulsión y porinas, junto con un estudio del efecto que produce la formación de biopelícula en el éxito de A. baumannii como patógeno.Con A. baumannii, se ha estudiado la prevalencia de bombas de expulsión específicas para tetraciclinas (TetA y TetB) y β-lactamasas en una colección de cepas clínicas españolas. Adicionalmente, se ha estudiado el efecto de la secuencia de inserción ISAba1 como promotor de estas β-lactamasas y se ha concluido que este elemento móvil, que puede ser adquirido o perdido en el ámbito hospitalario, se está convirtiendo en un activador importante de estos genes de resistencia. Paralelamente, se ha analizado la actividad de ceftobiprole y doripenem, dos nuevos β-lactámicos, frente a cepas clínicas de este microorganismo que únicamente ofrecen una pequeña mejoría frente a las antiguas carbapenemas y cefalosporinas. También se ha detectado y secuenciado un gen homológo a mdfA en Escherichia coli que codifica una bomba de expulsión en una cepa clínica de A. baumannii.Aproximaciones genómicas y proteómicas han demostrado ser metodologías importantes para la identificación y caracterización de nuevos mecanismos de resistencia. Se ha hecho un análisis proteómico de una fracción enriquecida en proteínas de membrana en una cepa clínica y un estudio proteómico entre una cepa clínica sensible a quinolonas y un mutante isogénico resistente a quinolonas con la obtención de diversas proteínas de membrana que se sobre-expresaban en el mutante resistente; estas porinas podrían hacer la membrana bacteriana más impermeable a los agentes antimicrobianos. Un análisis de la membrana en mutantes resistentes a colistina demuestran que esta resistencia puede estar asociada a cambios a nivel proteico y a un incremento en la producción de lipopolisacáridos.Finalmente se ha analizado la formación de biopelícula en una colección de cepas clínicas de A. baumannii, estudiando la relación entre la formación de biopelícula y otras características clínicas o microbiológicas. Se ha demostrado que hay una clara asociación entre formación de biopelícula y sensibilidad a imipenem y ciprofloxacino; las cepas resistentes a quinolonas son menos propensas a formar biopelícula que sus equivalentes sensible debido a una expresión reducida de una fimbria de tipo 1, el primer paso en la formación de biopelícula. Además, pacientes tratados previamente con aminoglucósidos tienen un riesgo de ser colonizados o infectados con cepas de A. baumannii formadoras de biopelícula.En este trabajo también se han considerado otras genospecies y se han estudiado los mecanismos de resistencia a quinolonas y colistina, concretamente en cepas de la Genospecie 3 y 13. Cepas clínicas no pertenecientes al grupo A. baumannii están probablemente siendo subestimadas como agentes patogénicos porque las cepas resistentes pueden ser clasificadas como A. baumannii por equivocación. A pesar de que estas cepas son generalmente más sensibles a los antibióticos, están adquiriendo nuevos mecanismos de resistencia.

INTRODUCCIÓN:Tanto en países desarrollados como en vías de desarrollo las Salmonellas son responsables de un alto nivel de morbilidad y mortalidad. Este problema es especialmente relevante en áreas en vías de desarrollo donde la carencia de fuentes económicas no permite disponer de un amplio potencial antibacteriano. Además, en algunas de estas áreas tanto la situación social como la presencia de otras enfermedades favorecen la infección por estos microorganismos. El género Salmonella está compuesto por 2501 serotipos con diferentes características fenotípicas y genotípicas y aunque usualmente produce una infección autolimitada, la duración o la severidad de los síntomas pueden requerir tratamiento antibiótico.Las especies de Salmonella disponen de altos niveles de resistencia natural a los agentes antimicrobianos más usados, sin embargo la aparición de cepas de Salmonella mostrando resistencia a uno o más agentes antibacterianos ha aumentado considerablemente probablemente debido a la continua presión antibiótica, lo cual constituye un importante problema para la salud pública. La resistencia a algunos antibióticos, tales como β-lactámicos, tetraciclina, cloranfenicol, o trimetoprim-sulfametoxazol está siendo reportada con alta frecuencia. Además se ha descrito el desarrollo de resistencia a quinolonas. Una eficiente ruta de adquisición de esta resistencia es a través de elementos genéticos tales como, plámidos, transposones e integrones.El principal objetivo de este estudio fue analizar la evolución de la resistencia en aislamientos de Salmonella de origen clínico, caracterizar los mecanismos de resistencia a diferentes agentes antimicrobianos y analizar el potencial de diseminación de clones resistentes.MATERIALES Y MÉTODOS:En este estudio se analizaron cepas (n=62) aisladas de muestras de heces procedentes de viajeros que padecían diarrea del viajero y cepas (n=34) aisladas de muestras de heces de pacientes con gastroenteritis aguda de diferentes regiones de Cuba. El estudio se llevó a cabo en el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital Clínic de Barcelona. Los patógenos diarreagénicos encontrados fueron identificados por métodos convencionales. El serotipo se determinó utilizando antisueros somáticos y flagelares. La fase flagelar fue determinada por el método de inversión de fase descrito por Kauffman y White y siguiendo las recomendaciones de Edward y Ewing. También se identificaron los fagotipos de los serotipos Enteritidis, Typhimurium, Hadar y Virchow. Se determinó la susceptibilidad antimicrobiana por el método de Kirby-Bauer a diferentes agentes antimicrobianos: ampicilina, amoxicilina-ácido clavulánico, ácido nalidíxico, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloranfenicol, gentamicina, amikacina, espectinomicina, imipenem, norfloxacino, ciprofloxacino y ceftazidima. La interpretación de los resultados se llevó a cabo según las normas del CLSI. Staphylococcus aureus ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 se utilizaron como cepas controles.Para determinar los mecanismos moleculares de resistencia a quinolonas se detectaron las mutaciones en los genes gyrA y parC mediante la técnica de PCR con iniciadores específicos. La presencia de los genes cmlA y floR asociados con la resistencia a cloranfenicol se determinó por PCR. La actividad cloranfenicol acetiltransferasa se determinó mediante un ensayo colorimétrico. La detección de los genes que codifican para beta-lactamasas (tipo tem, carb, shv, y oxa) así como la determinación de los mecanismos de resistencia a tetraciclina relacionados con la presencia de los genes tetA, tetB y tetG también fue determinada por PCR. Para determinar el mecanismo de resistencia a trimetoprim-sulfametoxazol la presencia de dihidrofolato reductasas fue determinada con primers genéricos y análisis del polimorfismo de los fragmentos de restricción. La detección de integrones Clase 1 también se determinó utilizando primes específicos ya descritos.Los productos de las diferentes PCR fueron visualizados en un gel de agarosa al 2%. El producto de la PCR visualizado en el gel fue secuenciado y analizado en un secuenciador automático usando el kit de secuenciación Big Dye3.1.La clonalidad de los aislamientos se determinó mediante análisis del ADN cromosómico digerido con XbaI y separación en electroforesis en campo pulsante.RESULTADOS:Los serotipos más frecuentes fueron Salmonella enteritidis y Salmonella typhimurium. La mayoría de las cepas mostraron resistencia al menos a uno de los agentes antimicrobianos utilizados, encontrándose un alto porcentaje de multirresistencia. Los antibióticos frente a los cuales se observó mayor resistencia fueron: tetraciclina, ampicilina, cloranfenicol, ácido nalidíxico y trimetoprim-sulfametoxazol. Una simple sustitución de aminoácidos en las posiciones 83 y 87 del gen gyrA ha sido descrita con anterioridad como causa de resistencia frente al ácido nalidíxico, mientras que sustituciones en ambas posiciones más sustituciones en el gen parC confieren elevada resistencia a fluoroquinolonas. En nuestro estudio se encontró resistencia al ácido nalidíxico y sensibilidad disminuida a ciprofloxacino y norfloxacino. Destacándose como principal causa de esta resistencia mutaciones en el gen gyrA. No se encontraron mutaciones en el gen parC. Ocho aislamientos mostraron resistencia a ampicilina provocada por la presencia de beta-lactamasas tipo CARB, TEM y OXA. Es algunas cepas productoras de beta-lactamasas tipo TEM también se encontraron niveles intermedios de sensibilidad a amoxicilina-ácido clavulánico. Está demostrado que la sobreexpresión de estas enzimas provoca sensibilidad disminuida o resistencia frente a este antibiótico.El principal mecanismo de resistencia involucrado en la resistencia al trimetoprim-sulfametoxazol fue la presencia de dihidrofolato reductasas presentes en cuatro aislamientos, específicamente dfrA1, dfrA12, dfrA14 y dfrA17. La resistencia al cloranfenicol estuvo determinada por la presencia de los genes cmlA, floR y la actividad cloranfenicol acetil transferasa (CAT). De los aislamientos resistentes a tetraciclina, el gen tetA fue el principal responsable de la resistencia. Los genes de resistencia localizados en integrones fueron asociados con resistencia a aminoglucosidos, beta-lactamasas, trimetoprim y cloranfenicol. El campo pulsante reveló la existencia y diseminación de un clon resistente de Salmonella typhimurium en diferentes regiones de Cuba.CONCLUSIONES:Nuestros resultados muestran niveles importantes de resistencia en cepas de Salmonella, principalmente frente al ácido nalidíxico, además de una gran heterogeneidad de mecanismos moleculares de resistencia frente a antibióticos de primera línea. A nuestro parecer con nuestro estudio contribuimos a mantener la vigilancia de esos microorganismos y así tener información de los niveles de resistencia para mejorar el tratamiento y desarrollar estrategias en la prevención de la diseminación de la resistencia.

DE LA TESIS:Desde la aparición de las quinolonas, las resistencias bacterianas a las mismas han evolucionado de forma paralela. Conforme han ido apareciendo nuevas moléculas con mayor capacidad bactericida y mejores parámetros farmacodinámicos y farmacocinéticos, también se han ido identificando nuevos y más sofisticados mecanismos de resistencia, que se han ido adaptando a las necesidades de cada momento. Es por ello que se hace necesaria una nueva metodología para el diseño y la síntesis de nuevos agentes antibacterianos con el objetivo de aumentar su potencia antibacteriana y, al mismo tiempo, disminuir la probabilidad de generar a corto plazo nuevos mecanismos de resistencia. Con este fin, es fundamental conocer todos los mecanismos de resistencia y cuál es, en detalle, su mecanismo de acción, para poder diseñar nuevas moléculas capaces de, manteniendo su capacidad bactericida, eludir dichos mecanismos.En esta tesis nos propusimos como objetivos fundamentales, en primer lugar, investigar las bases moleculares de los mecanismos de resistencia a quinolonas en bacterias Gram-negativas. En concreto, en Escherichia coli, Yersinia enterocolitica y Citrobacter freundii. Por otro lado, se llevaron a cabo cálculos de acoplamiento o "docking" mediante la utilización de programas informáticos con el fin de incrementar nuestros conocimientos respecto al modelo de interacción entra ADN-ADN girasa-quinolona, para de esta manera mejorar nuestra comprensión de los mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas asociados a las mutaciones más comúnmente encontradas en el gen gyrA. Finalmente, el último de los objetivos que nos propusimos fue el de diseñar, sintetizar y evaluar diferentes derivados de ciprofloxacino y norfloxacino con el fin de encontrar entre ellos alguno que tuviera la capacidad de interaccionar con la enzima ADN girasa, poseyendo ésta uno o dos cambios aminoacídicos en su subunidad A.