En los últimos años han aparecido en el mercado nuevas bebidas, combinación de zumos de fruta y leche con una buena aceptación por parte de los consumidores. Tradicionalmente, los alimentos líquidos como zumos de fruta y/o vegetales, así como la leche han sido conservados mediante técnicas por calor como la pasterización o esterilización. Sin embargo, los procesos térmicos de conservación dañan tanto a microorganismos y enzimas, como a nutrientes y otros compuestos químicos responsables de la calidad nutricional y organoléptica de los alimentos. En la última década, investigadores y tecnólogos, demandado por la industria alimentaria, han estudiado la aplicación de tecnologías de conservación alternativas al calor como los pulsos eléctricos de alta intensidad (PEAI). La aplicación de los PEAI es una técnica desarrollada para la conservación de alimentos líquidos a través de la exposición de éstos a un campo eléctrico de determinada intensidad durante un tiempo del orden de microsegundos, basándose en la propiedad que tienen los alimentos líquidos (principalmente, compuestos por agua y nutrientes) de ser buenos conductores eléctricos. La tecnología de PEAI es capaz de destruir microorganismos e inactivar enzimas preservando en mayor grado las características nutricionales y organolépticas de los alimentos tratados. En la presente tesis doctoral, se estudian los efectos de la aplicación de los PEAI sobre los compuestos bioactivos (ácido ascórbico, carotenoides, compuestos fenólicos), la capacidad antioxidante total (ORAC y TEAC) y otros parámetros físico-químicos y de calidad (pH, ºBrix y color) de una bebida mezcla de zumo de naranja y leche (50:20, v/v). Durante el estudio se ensayan cuatro intensidades de campo eléctrico (15, 25, 35 y 40 kV/cm) y seis tiempos de tratamiento para cada uno de dichos campos (desde 40 hasta 700 μs). Los resultados obtenidos tras la aplicación de los pulsos se comparan con los obtenidos tras la aplicación de un tratamiento tradicional por pasterización (90ºC, 20 s). Posteriormente, se evalúa la variación de las características nutricionales y organolépticas durante el almacenamiento de la bebida en refrigeración (4 y 10ºC) y se calcula la vida útil. Además, para evaluar el efecto de los PEAI sobre el perfil de ácidos grasos se realizan también ensayos con los dos campos eléctricos más intensos (35 y 40 kV/cm) en una bebida de zumo de naranja y leche enriquecida con ácidos grasos omega 3 y oléico. Por otro lado, debido a la falta de métodos oficiales para la determinación de la capacidad antioxidante total, en el trabajo se presenta una comparativa de dos de los métodos más utilizados (ORAC y TEAC) para la determinación de dicha capacidad antioxidante en la bebida de zumo y leche. La bebida tratada por PEAI presenta una mayor retención de compuestos bioactivos y mayor semejanza al producto fresco respecto a las tratadas por pasterización. Sin embargo, durante el almacenamiento, las bebidas tratadas por pulsos muestran una mayor inestabilidad según indican los parámetros físico-químicos (ºBrix, pH y densidad). / New ready-to-drink beverages combination of fruit juices and milk have been appeared in the market based on consumer claims for convenience and health. Traditionally, liquid foods such as fruit juices, vegetables soups or milk, has been treated by thermal treatments such as pasteurization or sterilization in order to prolong their shelf-life. The application of these treatments causes a reduction on microorganisms and enzymes, but also a reduction of nutrients and other substances related to product quality. In the last decades, owing to consumer demands for safe but high-quality natural foods (with minimal or no chemical preservatives), producers have been exploring innovative processing methods with minimal heat treatment such as pulsed electric fields (PEF). PEF is a novel and innovative non-thermal minimal processing technology which has the potential to pasteurize several foods via exposure to high-voltage short pulses (μs). PEF technology is able to destroy microorganisms and enzymes preserving the nutritional and quality characteristics of the product treated. The main objective of this doctoral thesis was to study the effect of PEF on bioactive compounds (ascorbic acid, carotenoids, phenolic compounds), total antioxidant capacity (ORAC and TEAC) and physico-chemical characteristics (colour, pH and ºBrix) of an orange juice-milk beverage. Results were compared with that obtained after pasteurization (90ºC, 20 s). Additionally, the shelf-life of this beverage treated by PEF was evaluated during storage at 4 and 10ºC. In order to evaluate the effect of PEF on fatty acids, a study of the application of 35 kV/cm and 40 kV/cm was carried out in a beverage added with omega-3 and oleic acid. On the other hand, due to the lack of an oficial method to determinate total antioxidante capacity, the current work presents a comparision about ORAC and TEAC methods to determinate this capacity in the orange-milk beverage. Immediately after treatment, PEF-treated beverages showed a major retention of bioactive compounds compared with pasteurized ones. However, during storage, fermentation signs appeared for PEF-treated beverages stored at 10ºC.

En las últimas décadas la restauración colectiva universitaria ha adquirido gran importancia. Es importante garantizar la calidad y variedad de los menús desde un aspecto nutricional como microbiológico o toxicológico. El control del nivel de compuestos polares en aceites y grasas usados es una medida de prevención frente a tóxicos de origen químico. El estudio de la prevalencia de Anisakis simplex en muestras de pescado es una medida para garantizar la seguridad alimentaria. Los servicios de restauración deben cumplir determinadas normas de higiene para la elaboración, distribución y comercio de comidas preparadas con la finalidad de mantener una calidad microbiológica adecuada. El riesgo producido por la presencia de microorganismos en los alimentos no viene representado únicamente por las bacterias presentes sino, también por las toxinas bacterianas. Entre ellas merecen especial atención las de E. coli y S. aureus. E. coli es una bacteria frecuentemente asociada con toxiinfecciones e intoxicaciones alimentarias. En condiciones normales, constituye una parte esencial de la flora bacteriana humana, sin embargo, existen cepas capaces de provocar alteraciones graves en forma de enteritis. Este grupo de cepas se denomina E. coli enterotoxigénico (ETEC) y se transmiten a través de los alimentos o el agua contaminada por heces animales o humanas. La toxina termo-lábil (HLT) es su principal factor de virulencia. S. aureus es la bacteria enterotoxigénica más corriente de los alimentos. Las cepas toxigénicas de S. aureus pueden producir más de una enterotoxina aunque la enterotoxina del tipo A es la que con más frecuencia aparece en los brotes de intoxicación alimentaria, seguida de los tipos B y D. Merece especial atención la toxina 1 del síndrome del shock tóxico (TSST-1). El desarrollo de técnicas rápidas y selectivas para la identificación y cuantificación de toxinas bacterianas contribuirá a garantizar la seguridad alimentaria. / The catering service at university has become very important in all developed countries in recent decades. Consumers are increasingly demanding healthy and safe food, with better nutritional properties. Meals served must ensure the nutritional quality and limit the exposure to different contaminants that can be found in food. It is therefore important to ensure the quality and variety of menus offered daily, from a nutritional viewpoint as microbiological or toxicological. University students have a special interest because many of them assume, for the first time, responsibility for their meal. Dietary habits established by university students when they are away from home, can have a significant effect on their health, determining or modifying the risk of nutrition-related diseases. In addition to the nutritional hazards it is desirable to identify, assess and prevent hazards from physical, chemical or biological origin that can affect food safety, in order to implement appropriate measures to reduce or eliminate hazards to acceptable health standards. University restaurants are catering services, where transformation of food is done to serve customers. The food served must have adequate sanitary and organoleptic quality, it is also important to safeguard the safety, as these foods may be responsible for food poisoning. Monitoring of polar compounds (legislated in Spain) in oils and fats used is a preventive measure against toxic chemical hazards. These are compounds formed in used oils as a result of changes in fats and oils during frying processes. The presence of external substances with biological origin in foods can also be cause of foodborne disease (FBD). Products consumed in university establishments can be vectors of several biological contaminants, mainly parasites and bacteria. It is therefore important to have systematic monitoring of the microbiological quality of the food served. A large number of marine and freshwater fish can serve as a source of medically important parasitic zoonoses. The most important of the fish-borne helminthes are anisakid nematodes (particularly Anisakis simplex). On the other hand, restaurants must meet certain hygiene standards for production, distribution and trade of ready meals in order to assess the quality and microbiological safety of food. The toxicological hazard caused by the presence of microorganisms in food is not represented only by bacteria present in food; but also bacterial toxins in foods eaten are important. Among them deserve particular attention for E. coli and S. aureus toxins. E. coli is a bacteria often associated with outbreaks and food poisoning. Under normal conditions, constitutes an essential part of human bacterial flora, however, there are strains capable of causing serious diseases as enteritis. This group of strains is called enterotoxigenic E. coli (ETEC) and is transmitted through food or contaminated water by animal or human feces. ETEC labile toxin (LT) is the major virulence factor of ETEC. S. aureus is the most common toxigenic bacteria in food. It is responsible for most annual cases of food poisoning caused by ingestion of foods where enterotoxins have been preformed. Toxigenic strains of S. aureus can produce more than one enterotoxin although enterotoxin type A is the most frequently found in outbreaks, followed by types B and D. S. aureus produce also toxic shock syndrome toxin 1 (TSST-1), previously classified as enterotoxin F, which has not been extensively studied in restaurants. The development of rapid and effective techniques for enterotoxin isolation and identification represent a great advantage for the evaluation of its toxicity and to quantify the amount of toxin produced by strains isolated from food. This will contribute to food security and thereby safeguard consumers´ health in university restaurants.

La levadura Saccharomyces cerevisiae es la especie más utilizada desde un punto de vista biotecnológico. En la industria agroalimentaria interviene en la elaboración de pan y bebidas alcohólicas como el vino y la cerveza, además se emplea como suplemento dietético y como agente probiótico bajo el nombre de S. cerevisiae var. boulardii. A pesar de sus propiedades beneficiosas, S. cerevisiae se considera actualmente una levadura patógena oportunista emergente de baja virulencia, capaz de causar infecciones principalmente en hospedadores inmunodeprimidos. Con el fin de conocer el posible papel de esta levadura como patógeno emergente, el presente trabajo aborda un estudio comparativo entre aislados clínicos y no clínicos de S. cerevisiae desde diferentes puntos de vista. En primer lugar, la caracterización mediante técnicas moleculares de un gran número de aislados clínicos y su comparación con aislados no clínicos, ha sido de gran ayuda para esclarecer el origen de colonización en infecciones por S. cerevisiae. Dicha caracterización junto con un estudio filogenético de secuencias del gen COX2, evidenciaron dos posibles casos de colonización exógena por parte de cepas de panadería y la cepa probiótica S. cerevisiae var. boulardii.Por otro lado, los estudios de rasgos fenotípicos asociados con virulencia de esta levadura, mostraron que la capacidad de crecimiento a 42º C, el crecimiento pseudohifal y niveles altos en la actividad fosfolipasa, son rasgos de virulencia que marcan la diferencia entre los aislados clínicos y las cepas industriales. Dicho estudio junto con los ensayos en sistemas murino de infección sistémica, han permitido establecer el potencial patógeno de algunas cepas de S. cerevisiae.Finalmente se han observado diferentes grados de activación de las MAP quinasas Slt2 y Kss1 entre los aislados clínicos y no clínicos incluidos en este estudio, además de detectarse la presencia de dos proteínas Slt2 para un grupo de aislados clínicos. El análisis de la secuencia del gen SLT2 ha revelado que estos aislados tienen más de dos alelos que se diferencian en el tamaño, como consecuencia de la variación en un gran número de repeticiones de los trinucleótidos CAA/que codifican glutaminas. Estos estudios pueden ser de gran interés para las industrias de alimentos que incluyen a S. cerevisiae en sus preparados, así como en el ámbito hospitalario, advirtiendo del peligro que conlleva la administración de productos que contengan dicha levadura, a individuos inmunodeprimidos. / Saccharomyces cerevisiae has traditionally been used in industrial fermentative processes, beer and wine production, baking, and as a nutritional supplement or even as a probiotic. This is the case of the probiotic strain of this species, S. cerevisiae var. boulardii which has been widely used in Europe to treat several types of diarrhoea. Although S. cerevisiae and S. boulardii have commonly been considered as safe microorganism, this concept has changed due to an increased number of human infections. Consequently, S. cerevisiae is now considered an emerging opportunistic pathogen that can cause clinically relevant infections, mainly associated with immunocompromised patients. With the aim of know the possible role of this yeast as an opportunistic pathogen, the present work tackles a comparative study between clinical and no clinical isolates of S. cerevisiae from different point of view. This study could be of great interest for all food industry that include S. cerevisiae inside their preparation, just as in the hospital environment, warning of the risk that entail the administration of products which contain the above mentioned yeast to immunosuppressed person.

Bacillus cereus es un bacilo Gram positivo esporulado contaminante habitual de alimentos tanto frescos como procesados. La detección y cuantificación de este patógeno de alimentos se realiza habi-tualmente por técnicas culturales. Dichas técnicas consumen mucho tiempo y, en ocasiones, llevan a identificaciones erróneas. Como alternativa, las técnicas moleculares basadas en la PCR tienen como ventaja una mayor rapidez y seguridad en la identificación del microorganismo, e incluso permiten su cuantificación mediante PCR a tiempo real (Q-PCR). En este estudio se han desarrollado diferentes métodos para el control de este microorganismo en alimentos, basados en la técnica de la PCR.A partir de una colección de cepas de referencia y aislados de alimentos, identificados previamente por métodos fenotípicos, (ISO 7932 y API-50CH/B) y genotípicos, (ISR-PCR y RAPD), se determinó la presencia de genes relacionados con factores de virulencia mediante PCR convencional. El gen pc-plc se detectó en un mayor porcentaje en las cepas del "grupo B. cereus", y dado que se encuentra en una única copia por genoma, fue seleccionado como gen diana. Se diseñaron 4 oligonucleótidos para el desarrollo de procedimientos de Q-PCR en modo SYBR Green y Taqman. Se optimizaron los parámetros de la reacción de cuantificación, y se evaluó su especificidad para el "grupo B. cereus", resultando más adecuado el procedimiento de SYBR Green Q-PCR. A continuación se ensayó la capacidad para la detección y cuantificación en alimentos contaminados artificialmente: huevo líquido y leche en polvo infantil. Como resultado el sistema desarrollado ha demostrado su capacidad para la cuantificación de B. cereus entre 105 y 100 ufc/ml a partir de la matriz ensayada, que corresponde al mismo nivel que el método de referencia por recuento en placa. Dado que B. cereus puede estar presente en alimentos tanto en forma vegetativa como esporulada, para su detección por PCR se abordó, asimismo el desarrollo de un protocolo para asegurar la liberación del DNA a partir de esporas. Se partió de suspensiones calibradas de esporas que fueron sometidas a diferentes tratamientos: a) térmicos y b) adición de germinadores en diferentes combinaciones. Tras los tratamientos, se realizó la extracción de DNA con DNeasy Tissue kit (Qiagen), se cuantificó y se evaluó el rendimiento espectrofluorimétricamente (PicoGreen, Invitrogen) y mediante PCR convencional y SYBR Green Q-PCR. El tratamiento de germinación con 0,5 mM L-alanina/inosina resultó el más eficiente en suspensiones concentradas de esporas. Sin embargo, cuando se ensayó en alimentos inoculados (104 - 100 esporas/ml), la extracción con DNeasy Tissue Kit, sin necesidad de tratamientos previos, resultó satisfactorio.Por último, se realizó una aproximación cuantitativa para la detección de formas viables de B. cereus. Para ello se desarrolló un procedimiento de PCR a tiempo real con transcripción inversa (Q-RT-PCR) utilizando como diana el RNA mensajero del gen pc-plc, como indicador del estado de viabilidad celular. El nivel de sensibilidad obtenido por Q-RT-PCR fue de 30 células/reacción a partir de suspensiones celulares, y de 847 células/reacción tras su aplicación en huevo líquido.Los procedimientos de Q-PCR y Q-RT-PCR desarrollados en este estudio han mostrado ser eficientes para detectar la presencia de las especies del "grupo B. cereus" en alimentos, al menos al mismo nivel que el método de referencia, permitiendo además la cuantificación incluso de formas viables. / Bacillus cereus is a rod-shaped, Gram-positive sporeforming bacterium widely recognized as a food poisoning organism. Detection of this pathogen in food is usually carried out by culture techniques that are time consuming and frequently lead to misidentifications. As an alternative, molecular genetic techniques allow rapid, sensitive and accurate detection. In the present work, PCR based systems were applied for a rapid and unequivocal detection of "B. cereus group" which would be very valuable in food safety assessment. The presence of virulence genes was tested by PCR amplification in a collection of reference strains and food isolates that had been phenotypically and genotypically characterized. The pc-plc gene showed the highest prevalence among the tested strains and five oligonucleotides were designed in order to develop SYBR Green and TaqMan real-time PCR (Q-PCR) procedures. The SYBR Green Q-PCR was applied on spiked liquid egg and dried infant formulae showing suitable quantification results in a range of 105 to 100 ufc/ml, and high degrees of correspondence between Q-PCR assays and plate counts. To assess detection of B. cereus spores by PCR procedures, several DNA isolation methods were tested on spore suspensions: i) heat treatment and ii) germination triggered by nutrient germinants followed by DNA isolation (DNeasy tissue kit, Qiagen). Recovery of DNA was evaluated by PCR, Q-PCR, and PicoGreen fluorescence (Invitrogen). Germination with L-alanine 0.5 mM/inosine 0.5 mM rendered the maximum rate of DNA at 108 spores/ml. However, DNA extraction without any modifications rendered similar DNA recovery on 105 to 100 spores/ml range. Spore detection was established in 3-4 spores/reaction using both spore suspensions and spiked food samples. Besides pathogen detection, cell viability is important in food safety. Thus a one-step Q-RT-PCR detection system, was established to investigate the presence of metabolically active cells. By using this approach, 30 cells/reaction and 847 cells/reaction were detected in cell suspensions and spiked liquid egg samples, respectively.The developed Q-PCR and Q-RT-PCR systems proved to be highly sensitive and specific for the rapid and accurate detection and quantification of species of the "B. cereus group" in food, and constitute a promising tool in the detection of B. cereus including spores as well as viable cells.

Objetivo: Desarrollar un alimento funcional a partir de hierro hémico (relleno para galletas) y evaluar su biodisponibilidad en cerdos en etapa de crecimiento, a fin de que sea usado en humanos para el control y prevención de la deficiencia de hierro, con más ventajas que los productos actuales.Material y métodos: La fase experimental del proyecto se realizó en dos etapas:1.- Desarrollo del relleno para galletas enriquecido con hierro hémico. Incluida la elaboración de la documentación correspondiente a los procesos.2.- Evaluación de la biodisponibilidad del metal en cerdas en crecimiento, para lo cual se formaron 3 grupos a los que se les administró: 1) Pienso bajo en hierro, más galletas adicionadas con hierro hémico en forma de relleno. 2) Pienso bajo en hierro, más caramelos de goma adicionados con lactato ferroso y 3) Pienso normal (con sulfato ferroso), considerado este como el grupo control. Se realizó un seguimiento diario y quincenalmente se tomó el peso y se hicieron determinaciones del perfil férrico en muestras de sangre de las cerdas. Se realizó análisis pareado: valores iniciales contra finales y análisis de variancia entre los resultados de los tres grupos.Resultados: Se desarrolló un producto de apariencia cremosa de color marrón oscuro, olor y sabor a chocolate, apropiada untabilidad, contenido de hierro hémico de 2,6 mg por gramo, 14,8% de proteína de buena calidad biológica y vida útil de un mes. Se fabricó mediante un proceso sencillo, sin necesidad de usar calor y aceptable cantidad de grasa (10.9%) en su composición.En la evaluación de biodisponibilidad, las cerdas suplementadas con hierro hémico presentaron mayor ganancia de peso: 14,6% más que las suplementadas con lactato ferroso y un 27,8% mayor que las del grupo control. La mortalidad fue menor en el grupo de hierro hémico (10%), que los grupos que recibieron lactato ferroso (20%) y el grupo control (50%). En los tres grupos de estudio, fue notorio un incremento de los parámetros sanguíneos que informan del hierro funcionante y un decremento en el hierro circulante, este último, más manifiesto en el grupo de hémico.Hubo una tendencia en los promedios de la cantidad total de hierro detectada en los grupos de estudio; de mayor a menor fue en el siguiente orden: Grupo de hémico, lactato y control. Inversa a los promedios de la cantidad total de hierro consumida, que de menor a mayor fue: hémico, lactato y control.Conclusiones: Es posible formular un producto aceptable, con alto contenido de hierro hémico y factible de ser usado como relleno para galletas.La suplementación con hierro hémico demostró ser mejor en el incremento de peso y en la disminución de la mortalidad de cerdas en crecimiento. / Objective: To develop a functional food based on hemic iron (a biscuit filling) and which has more advantages than present-day products and to assess its bioavailability in growing female pigs, with the aim of using it in humans for the control and prevention of iron deficiency.Material and methods: The experimental phase of the project was carried out in two stages 1) Development of a biscuit filling enriched with hemic iron. At the same time, the documents relating to the process were prepared.2) Assessment of the bioavailability of metal in growing female pigs, for the purpose of which three groups were formed, to which the following were administered: 1) feed low in iron content , as well as biscuits containing hemic iron in the form of a filling. 2) Feed low in iron, as well as gums containing ferrous lactate and 3) normal feed (with ferrous sulphate), this being the control group.A daily follow-up was carried out and, on a fortnightly basis, the female pigs were weighed and the ferric profile was measured from blood samples that were taken. Parallel tests were carried out: initial levels contrasted with final ones and an ANOVA of the results of the three tests was carried out.Results: A dark brown product with a creamy appearance smelling and tasting of chocolate and with an appropriate spreadability was developed, containing 2,6mg of hemic iron per gram 14,8% protein of good biological quality, and a shelf-life of one month.It was elaborated by means of a simple process, without the need to use heat and with an acceptable amount of fat (10,9%) as part of its composition.When an assessment was made of bioavailability, the female pigs supplemented with hemic iron presented a greater weight increase: 14,6% more than those supplemented with ferrous lactate and 27,8% more than those of the control group.The mortality rate was less in the hemic iron group (10%) than in the groups which received ferrous lactate (20%) and than in the control group (50%). In the three study groups, there was a clear increase in the blood parameters which provide information on the functioning iron and a clear decrease in the circulating iron, the latter being more evident in the hemic group.A tendency was observed in the averages of the total amount of iron detected in the study groups: from higher to lower in the following order: The hemic group, the lactate group and the control group.Conclusions: It is possible to elaborate an acceptable product with a high hemic iron content, and which can be used in a viable manner as a biscuit filling.Supplementation with hemic iron was proven to give better results with regard to weight increase and with regard to a decrease in the mortality rate among growing female pigs.

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En aquesta tesi s'analitza l'estat nutritiu de la població espanyola entre 1860 i 1970, un període crucial en les transformacions econòmiques i socials del país.A la primera part d'aquesta tesi s'examinen els fonaments científics de la relació entre alimentació, estat nutritiu i salut. També es fonamenta la validesa i utilitat dels indicadors que utilitzarem per avaluar l'estat nutritiu i tractar d'interpretar la seva evolució.A la segona part s'ha analitzat l'estat nutritiu de la població espanyola, la seva evolució històrica i les disparitats regionals que presenta, a partir de tres indicadors: la comparació entre la ingesta de nutrients i les racions recomanades de nutrients de la població espanyola, la talla (principalment dels reclutes) i la mortalitat associada més o menys directament a problemes nutricionals, com la mortalitat infantil i juvenil i la causada per malalties sinèrgiques amb la malnutrició. També s'han reunit i elaborat diversos indicadors de risc de problemes nutricionals, com l'ingrés per habitant o les taxes d'alfabetització femenina. A partir de l'examen de la informació obtinguda es pot concloure la existència de greus problemes nutricionals per a una part important de la població espanyola en el transcurs de la major part del període estudiat. Amb una sensible millora durant les primeres dècades del segle XX, un clar retrocés entre finals dels anys trenta i la dècada dels 50, i una millora definitiva des d'aleshores. S'aprecien també importants disparitats regionals en benefici de les províncies situades a la cornisa cantàbrica primer, i de les més desenvolupades del país després, entrat el segle XX. Al respecte, destacar el pes inicial del context ecològic sobre aquestes disparitats.Per últim, destacar l'aparent importància de la mortalitat associada a l'alimentació sobre el conjunt de la mortalitat espanyola, i per tant la influència de l'alimentació en les seves dimensions, característiques i evolució d'aquesta mortalitat. / This thesis analyses the nutritional status of the Spanish population between 1860 and 1970, a crucial period for the economic and social transformations of the country.On the first part of this thesis, I have studied the scientific bases of the relationship among feeding, nutritional status and health. It also bases the indicators that will be used to evaluate the nutritional status, and try to understand its evolution.On the second part I have analysed the nutritional status of the Spanish population. Its historical evolution and regional differences, upon the base of three indicators: the comparison between consumption and recommended dietary allowances of the Spanish population, height (specially, soldiers) and mortality associated to nutritional problems. It have been also elaborated several risk indicators of nutritional problems as the income per capita or the women alphabetisation.From the revision of the obtained information we conclude the existence of serious nutritional problems for an important part of Spanish population during the refereed period. With a notorious improvement during the first decades of the 20th Century, a clear recession between the final 30's and the 50's, and a permanent improvement from then till the end of the studied period. There are also important regional disparities: first on the advantage of the northern coast regions, and afterwards on the advantage of the more developed regions, at the beginning of the 20th Century. Related to that, it's important to underline the influence of the ecological context in these disparities.To finish, I have to remark the importance of mortality associated to feeding on the whole of the Spanish mortality, and so the influence of feeding on the dimensions, characteristics and evolution of this mortality.

Aquest treball es centra en la investigació sobre la producció de proteïnes heteròlogues en el llevat metilotròfic Pichia Pastoris. El principal avantatge de la utilització d'aquest sistema d'expressió és l'existència del promotor d'alcohol oxidasa, un dels més eficaços i fortament regulats per la presència de metanol com a única font de carboni. El gen hoste emprat és la lipasa del fong Rhizopus oryzae, proteïna d'elevat interès industrial i biotecnològic per les seves nombroses i variades aplicacions.De quatre tipus de soques diferents, dos parelles de diferent fenotip (Mut+ i Muts) i dins el mateix fenotip amb una o vàries còpies del gen hoste, s'ha seleccionat la soca més adient, en aquest cas Muts singlecopy, per una posterior explotació en cultiu semicontinu segons criteris de productivitat i dinàmica de creixement.S'ha observat que un dels problemes que presenta aquest tipus de cultiu és la reproductibilitat i el control de la concentració de metanol que s'aconsella no superar els nivells considerats com a tòxics de 10 g·l-1. Diferents mesures com l'anàlisi de la composició dels gasos de sortida del fermentador, l'extracció automàtica de mostres i la gestió de tota la informació del cultiu des de un programari dissenyat específicament, milloren significativament el seguiment i el control del cultiu. La disponibilitat de noves mesures del cultiu permeten estimar variables d'estat com la biomassa i la velocitat específica de creixement que són molt útils per conèixer el estat fisiològic del microorganisme.Per aconseguir mantenir estable la concentració de substrat inductor s'ha proposat utilitzar un llaç de control en retroalimentació començant pels sistemes de control més clàssics basats en l'error. La dinàmica canviant del sistema i el temps mort també variable fa que controls de tipus "on-off" i Proporciona Integral no siguin adients per mantenir prou estable la concentració de substrat. Com alternativa, s'ha implementat amb èxit un controlador predictiu basat en model que s'adapta contínuament al consum canviant de substrat inductor.Utilitzant de forma conjunta totes les millores instrumentals i de control del procés s'ha observat la influència que té la concentració de metanol sobre la producció de proteïna. D'aquest estudi se'n dedueix que mantenir la concentració a 1 g·l-1 durant el cultiu pot augmentar de forma significativa la productivitat. Paral·lelament es defineix que per maximitzar la productivitat la durada del cultiu ha de ser al voltant de les 80- 90h.Es pot afirmar que la instal·lació d'instrumentació juntament amb l'estimació, modelització i control d'algunes de les variables principals del cultiu, són mesures que permeten millorar la producció extracel·lular de proteïnes heteròlogues en Pichia Pastoris. / In this work the production of heterologous proteins by the methilotrophic yeast Pichia Pastoris has been studied. The main advantage of this expression system is the existence of a strong and tightly regulated (methanol-inducible) promoter from the alcohol oxidase gene (PAOX1).Using a battery of four strains, which secrete a Rhizophus oryzae lipase (ROL), the combined effects of gene dosage and Mut phenotype on recombinant protein production by P. pastoris were observed in fed-batch cultures. This study concludes that the use of Muts ROL single copy strain is advantageous because it allows easier process control strategies with high productivity.One of the main problems of these cultures is the low reproducibility and the need of accurate control of the methanol concentration in the fermentation to maintain it below toxic limits, 10 g·l-1. The implementation of exhaust gas analyzer, an autosampler system and specific software to on-line administrate the culture information improved significantly the control of the bioprocess.With several of these on-line measures it has been implemented an estimation algorithm that allows to determine both the specific growth rate of the microorganism and biomass concentration, used as physiologic indicators.To control the methanol concentration at an optimal set-point level during the cultivation, a feedback control using different error based controllers has been implemented. The use of on-off and PI (Proportional Integral) controllers is not recommended due to the dynamics of the biological system and the large death time of the system. As alternative, a predictive control algorithm based on the on-line estimation of the methanol rate has been successfully implemented.The improvement of the instrumentation and control of the bioprocess has provided the tools for the study of the influence of the methanol concentration on protein production. It has been observed that if the methanol concentration is maintained at 1 g·l-1 productivity increase about 140% is produced. Moreover, it suggested that to maximize the productivity of the system, the duration of the fed-batch fermentation should be around 80-90 h.The implementation of new instrumentation jointly with the use of software sensors, the modeling of the bioprocess, and the control of some of the fermentation variables significantly improved the production of the extracellular heterologous Rhizopus oryzae lipase by the yeast Pichia pastoris.

L’activitat de recerca i desenvolupament en el camp de la biotecnologia genera de forma altament dinàmica noves cèl· lules i productes d’interès en múltiples sectors. En aquest context, cal explorar en temps raonables i amb mitjans altament tecnificats i estandarditzats, el potencial productor de les diferents cèl· lules modificades, en quant al seu creixement, la capacitat producció i la qualitat dels productes obtinguts. Establir les condicions d’un procés productiu basat en cèl· lules requereix completar un nombre d’etapes molt elevat: des de la selecció del model cel· lular i la realització de treballs de biologia molecular fins a assolir un procés productiu amb unes condicions optimitzades. En aquest treball es presenta el disseny i desenvolupament d’un sistema de múltiples minibioreactors orientats a escometre les primeres fases del desenvolupament del bioprocés de forma ràpida, sistemàtica i amb informació rellevant sobre l’evolució de les principals variables de cultiu, de manera que sigui possible realitzar, entre altres experiments, la selecció de clons, caracterització del seu comportament en cultiu, optimització de medis de cultiu, i proves de toxicitat de molècules sobre els perfils dels cultius. El disseny del sistema de múltiples minibioreactors presentat reuneix els avantatges dels sistemes habituals de cultiu a petita escala, com són el treball amb volums reduïts i la capacitat de realitzar diversos cultius en paral· lel, així com els avantatges del treball amb reactors de major volum, com són l’homogeneïtat i el coneixement que les principals variables del cultiu estan en valors no limitants per a aquest. Així doncs, s’ha donat una elevada importància a que els minibioreactors disposin d’un sistema d’agitació que permeti assegurar l’homogeneïtat del seu contingut, i a disposar de sistemes de seguiment. Aquests permeten d’una banda conèixer els valors de les variables dels cultius, i d’altra banda la caracterització del comportament de les cèl· lules estudiades, obtenint dades útils per al disseny dels bioprocessos corresponents que puguin ser transferires amb èxit els processos cap a majors escales, i permetent prosseguir el camí cap a l’escala de producció sense que apareguin incidències, bàsicament pèrdues de productivitat, degudes a la manca de coneixement existent habitualment en les cultius a petita escala. Prèviament a iniciar l’etapa de desenvolupament tecnològic, s’ha realitzat un estudi preliminar per tal de tenir un major coneixement de les prestacions necessàries dels equips, tant pel que fa a la funcionalitat dels sistemes que proporcionen les condicions necessàries per al creixement dels cultius (agitació i aeració), com pel que fa a la potencialitat i limitacions dels sistemes de seguiment seleccionats. D’entrada, l’objectiu ha estat seguir el pH i l’oxigen dissolt com a variables del cultiu, la concentració cel· lular per a conèixer el creixement, i el consum d’oxigen com a indicador metabòlic, si bé el pH també és una variable que dóna informació interessant relativa al metabolisme i fisiologia dels cultius. Donats els diferents enfocaments de desenvolupament possibles en funció dels models cel· lulars a emprar, se n’ha seleccionat un d’ells, les cèl· lules animals. Així, el disseny detallat del sistema de minibioreactors s’ha orientat cap a aplicacions amb aquest model cel· lular, i aquesta elecció també s’ha tingut en compte en el capítol de desenvolupament, on s’han posat a punt els sistemes per a permetre la realització d’aquest tipus de cultius (bàsicament agitació i aeració), realitzant una caracterització hidrodinàmica dels minibioreactors desenvolupats. D’altra banda, també en aquest capítol es presenta el desenvolupament de les tècniques per a seguir la concentració cel· lular, el pH, l’oxigen dissolt i consum d’oxigen. La darrera part d’aquest treball, una vegada desenvolupades i validades les diferents tecnologies, consta de la realització de cultius emprant diferents tipus de cèl· lules, valorant la reproduïbilitat de l’equip i discutint la informació que aquest proporciona quan una línia cel· lular es cultiva a condicions diferents. Finalment, també cal remarcar que aquest treball obre les portes al desenvolupament de noves prestacions per al sistema de múltiples minibioreactors desenvolupat, com són el control del pH i de l’oxigen dissolt, i la possible utilització del sistema per al cultiu de bacteris i llevats. / The research and development in the biotechnological field generates a vast amount of new cells and products of interest for various economical sectors. In this framework, it is needed to explore, in reasonable times and with automated means, the potential of the generated, regarding its growth, productivity and quality of the obtained products. Establishing the culture conditions of a productive process based in cells required accomplishing several stages: from the selection of the cellular system and the realization of molecular biology works to the achievement of a bioprocess having optimized conditions. In this work the design and development of a multiple minibioreactor system is presented, having the aim of fastening the first stages of the bioprocess development, in a systematic way, and acquiring relevant information regarding the evolution of the main culture variables, making possible the realization of various sorts of experiments such as clone selections, the characterization of its culture performance, the culture medium optimization, and the toxicological evaluation of molecules. The design of the multiple minibioreactor system combines the benefits of the usual small scale culture systems, such as the consumption of small amounts of medium ad the capability of performing multiple parallel cultures, and the benefits of larger scale culture systems, such as the homogeneity and the knowledge of the main culture variables, ensuring these do not have limiting values. Consequently, special attention has been paid to the development of a stirring system ensuring the homogeneity of the bioreactor content and to the monitoring systems allowing the characterization of the cell growth and metabolism, which permits having sufficient data to upscale the process, minimizing the risks of such duty. Before starting the technological development stage, a preliminary study has been done with the aim of identifying and characterizing the required equipment features, regarding the auxiliary equipment supplying the culture conditions (stirring, aeration), and also regarding the potentiality and limitations of the monitoring systems. The main culture environmental variables to be monitored are pH and dissolved oxygen, whereas to monitor growth cellular concentration is to be followed. Additionally, oxygen consumption is to be used as a metabolic indicator, and pH is also a variable from which it can be obtained interesting information regarding culture physiology and metabolism. Given the different design possibilities for the required technologies depending on the cellular models to be used, one of them, precisely mammalian cells have been chosen. Thus, the detailed design and development of the minibioreactor system has been directed towards applications with such cellular model, paying special attention to the characteristic requirements of mammalian cells (basically agitation and aeration), and to the hydrodynamic characteristics of the system. On the other hand, also in the technological development chapter, techniques to monitor cell concentration, pH, dissolved oxygen and oxygen consumption have been implemented. Once the technological development has been completed and the required functionalities validated, in the last part of this work various cultures are performed with the aim of evaluating the culture reproducibility, and the information obtained by the equipment as it is used for culturing a certain cell line at various conditions. Finally, it is also interesting to underline the potential fields of development based on this work: new features of the multiple minibioreactor system, such as the pH and dissolved oxygen controls, and the potential use of the system for the culture of bacteria and yeast.