Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans plusieurs processus intracellulaires, dont l'apoptose, l'endocytose et le trafic membranaire, le bourgeonnement de certains rétrovirus (ex. HIV-1, EIAV) à travers la membrane plasmique ou encore la cytokinèse. Alix est constituée de trois domaines majeurs: un domaine BRO N-terminal, un domaine spécifique « en V » central (Alix-V) et un domaine C-terminal riche en prolines (PRD). Nous avons montré que la forme tronquée en C-terminal au niveau du domaine PRD (Alix-∃PRD) formait des monomères et des dimères en solution, et que le domaine Alix-V était suffisant pour permettre cette dimérisation. La diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) a montré que Alix-∃PRD se structurait en une forme incurvée et allongée qui rappelle les domaines BAR impliqués dans les phénomènes d'incurvation de membrane. Bien que l'interaction d'Alix avec la membrane ait été mise en évidence in vitro, sa capacité à déformer la membrane doit encore être confirmée. En outre, nous avons déterminé lors d'expériences de microcalorimétrie que les formes monomériques et dimériques de Alix-V interagissent avec un peptide dérivé de la protéine p9 EIAV Gag avec une affinité de l'ordre du micromolaire. Des cristaux de la forme dimérique de Alix-V ont été obtenus. Ces cristaux présentaient un faible pouvoir de diffraction (10Å). En revanche, des cristaux diffractant à 3Å ont été obtenus à partir d'une forme mutante de Alix-V (Mut1) incapable de dimériser et qui se structure en une forme monomérique ouverte et allongée ; la résolution de cette structure est en cours. De plus, nous avons montré que l'absence de relarguage des particules virales (VLP) après surexpression de la forme humaine de Alix-∃Bro (résidus 358-868) pouvait être rétablie à partir de la version Mut1 de cette forme, ce qui suggère donc un rôle de cette dimérisation dans le relarguage des VLP. La protéine Alix-V dimérique a également été utilisée pour produire un antisérum Alix, qui a montré que la protéine endogène Alix pouvait être co-localiser avec les endosomes de recyclage. Enfin, nous avons montré que CHMP4B formant des structures polymériques en anneaux, pouvait interagir avec Alix. L'ensemble de ces résultats donne de nouvelles informations sur la flexibilité conformationnelle d'Alix et, associée avec CHMP4, sur son implication dans les processus de bourgeonnement membranaire. Ce travail définit également le cadre des futures analyses fonctionnelles visant à définir le rôle de la protéine dimérique Alix dans les cellules infectées par le virus HIV-1.

La voie endo-lysosomale dirige les récepteurs membranaires vers le processus de dégradation lysosomale. En bref, les récepteurs sont marqués par l'ubiquitine, envoyés vers les endosomes précoces puis, pris en charge pas le système ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) et intégrés dans des vésicules intraluminales. Ce système est composé des complexes ESCRT-0, I, II, II et VPS4. Certaines protéines ESCRT sont aussi recrutées lors de processus topologiquement similaires comme la cytokinèse ou le bourgeonnment viral de certains virus enveloppés. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) est une ubiquitine-hydrolase associée au système ESCRT qui hydrolyse les chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63. Elle interagit directement avec ESCRT-0 via la sous-unité STAM et avec les membres CHMP1A, 1B et 3 d'ESCRT-III. Bien qu'AMSH pourait recruter ces protéines ESCRT ou être elle-même recrutée par celles-ci, le mécanisme d'activation de son activité d'hydrolase est encore méconnu. Afin de mieux comprendre les bases structurales de l'activation d'AMSH, j'ai essayé danalyser des formes recombinantes de cette protéine par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ce qui m'a permis d'obtenir deux modèles à basse résolution. De plus, j'ai caractérisé par SPR (Surface Plasmon Resonance) les interactions entre AMSH et CHMP1A, 1B et 3 et déterminé les résidus clefs du dernier complexe. Cela a montré que les surfaces d'interaction employées par le domaine MIT d'AMSH ne sont pas les mêmes pour CHMP3 et CHMP1A/1B. J'ai aussi découvert que l'activité enzymatique d'AMSH seule est très faible ce qui impliquerait une auto-inhibition en solution. L'hydrolyse des chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63 pourrait alors être activée par une construction de STAM comprenant le domaine SH3 ainsi que les domaines liant l'ubiquitine VHS et/ou UIM. / The endosomal pathway targets plasma membrane receptors for lysosomal degradation. Briefly, receptors are tagged by an ubiquitin, delivered to the early endosome and sorted into intraluminal vesicles by the ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery, composed of ESCRT-0, -I, -II- -III and the VPS4 complex. Some ESCRts are also recruited during topologically similar processes such as cytokinesis and budding of some enveloped viruses. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) is an ESCRT associated ubiquitin-hydrolase which hydrolyses K63-linked ubiquitin chains. AMSH interacts directly with the ESCRT-0 subunit STAM and ESCRT-III members CHMP1A, CHMP1B and CHMP3. Although AMSH may either recruit these ESCRTs are maybe recruited by these ESCRTs, little is known about the activation mechanism of its hydrolase activity. In order to understand the structural basis for AMSH activation I attempted to analyze recombinant forms of AMSH by X-ray crystallography and SAXS, which produced low resolution models of AMSH. I further characterized AMSH interactions with CHMP1A, CHMP1B and CHMP3 by SPR and determined the key residues for interaction. This showed that the AMSH MIT domain employs two different surfaces for CHMP3 and CHMP1A/B interactions. I also found that recombinant AMSH has very poor enzymatic activity on its own, which indicates an auto-inhibited state in solution. K63-linked uibiquitin hydrolysis could be activated by STAM constructs containing the SH3 and ubiquitin binding domains (UIM and/or VHS), which were shown to interact directly with AMSH via SPR. Thus activation of the hydrolase activity by STAM corroborates indirectly the autoinhibited native state.

La maladie d’Alzheimer est souvent précédée de troubles cognitifs légers (MCI) associés à la lésion du cortex entorhinal, une région interconnecté avec l’hippocampe. Cependant, un tiers des patients MCI présentent une rémission cognitive suggérant l’action de mécanismes compensatoires. Ces mécanismes pourraient être déficitaires chez les patients porteurs de l’allèle APOE4 présentant un MCI plus agressif.Par des approches multidisciplinaires chez la Souris, ce travail a démontré que la lésion entorhinale induit des déficits comportementaux et une hyperactivité de l’hippocampe. Or, le bourgeonnement des fibres cholinergique dans l’hippocampe compense ces déficits. Comme le bourgeonnement cholinergique est inhibé en présence de l’APOE4, cela pourrait contribuer au déclin cognitif exacerbé de ces patients. Par conséquent, l’inhibition de l’hyperactivité hippocampique chez les 50% de patients APOE4 représente une alternative prometteuse pour le traitement symptomatique du MCI. / Mild Cognitive Impairments (MCI) often precedes Alzheimer’s disease (AD) and is characterized by the loss of entorhinal neurons leading to a hippocampal disconnection. However, MCI patients also revert to normal cognition, suggesting compensatory mechanisms that alter the disease progression. This compensation may be impaired in patients bearing the APOE4 allele that are more prone to MCI, present less cognitive reversion and faster transition to AD.This work in mice, demonstrated that the sprouting of cholinergic fibers compensates entorhinal lesions through the reduction of the related hippocampal hyperactivity. As in APOE4 mice the cholinergic sprouting was altered in association with cognitive impairments, such impaired synaptic compensation may contribute to the faster cognitive decline of these patients. Therefore, supporting or mimicking the cholinergic control on hippocampal hyperactivity may represent a promising alternative therapeutic strategy for APOE4-carriers.

Le bourgeonnement est l'étape finale du cycle viral du virus VIH. Les particules virales vont devoir modifier la topologie de la membrane plasmique afin de promouvoir leur libération dans le milieu extracellulaire ; cette étape est réalisée par le recrutement de protéines ESCRT (en particulier CHMP4 et CHMP2) au point de bourgeonnement. A ce jour, les détails moléculaires de ce recrutement sont méconnus. Lethal Giant Discs (LgD) a été décrite dans la littérature comme un régulateur du traffic endosomal, et une interaction avec CHMP4B a été proposée pour l'orthologue humain CC2D1A. Un point majeur de ce travail aura été de caractériser l'interaction CC2D1A.CHMP4B, mais également de mieux comprendre l'organisation de la protéine. En particulier j'ai résolu la structure d'un fragment de LgD à 2.4 Å, comprenant une région hélicale et un domaine C2 en c-terminal. En outre, nous montrons que CC2D1A inhibe la capacité de CHMP4B à polymériser in vitro. A partir d'une structure cristallographique de CHMP4B et de données biochimiques, nous montrons que le site d'interaction de CC2D1A sur CHMP4B est impliqué dans la polymérisation de CHMP4B, et important pour la fonction de la protéine dans le contexte du bourgeonnement du HIV. Un projet parallèle m'a également conduit à définir un protocole de purification de la protéine CHMP2B recombinante sous forme monomérique, cet isoforme ayant été récemment impliqué dans la formation de structures tubulaires à la membrane plasmique et dans des activités de scission membranaire. En particulier, j'ai pû caractériser la protéine en présence de liposomes et préciser de nouveaux partenaires cellulaires. / Budding is the final step of HIV infection. Viral particles will have to modify the topology of the plasma membrane in order to achieve their correct release from the infected cell, by recruiting ESCRT proteins at the budding point, and among them CHMP4 and CHMP2 isoforms. So far, the molecular details of this recruitment are not precisely known.. Lethal Giant Discs (LgD) has been descibed in the litterature as a regulator of endosomal trafficking, and an interaction with CHMP4B has been proposed. A major point of this research is to propose a structural basis for this interaction, as well as a better understanding of the role and general organization of LgD/CC2D1A. The crystal structure of a LgD fragment (comprising a predicted coiled-coil motif and a c-terminal C2 domain) was solved in our lab at 2.4 A. Moreover, we show that CC2D1A impairs in vitro the ability of CHMP4B to polymerize. Based on a crystallographic structure of CHMP4B and biochemical data, we also show that the binding site of CC2D1A on CHMP4B is itself involved in polymerization, in the context of HIV budding. As a side project, I've also set up a protocole to obtain pure monomeric CHMP2B, which has been shown to polymerize at the plasma membrane, and I've characterized the protein in the presence of liposomes, along with new partners.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les cellules épithéliales possèdent deux domaines membranaires distincts: le domaine apical, qui fait face à la lumière de l'organe, et le domaine basolatéral, qui interagit avec les cellules adjacentes et la matrice sous-jacente. Ces deux régions membranaires sont formées, entre autres, par la distribution particulière des protéines et des lipides membranaires. Les protéines membranaires sont transportées vers un domaine précis par l'intermédiaire de vésicules. Ce transport vésiculaire est contrôlé par des protéines spécialisées responsables d'étapes spécifiques de ce tri moléculaire. Parmi ces protéines spécialisées, les protéines "adaptrices" reconnaissent des structures ou des séquences d'acides aminés retrouvées sur les protéines membranaires. Ces signaux de transport servent d'adresses qui permettent à la machinerie cellulaire de reconnaître les protéines et de les transporter à destination. Les virus enveloppés utilisent ce processus de transport pour bourgeonner à des régions spécifiques de la cellule; notamment, à l'un ou à l'autre des domaines membranaires des cellules épithéliales. Il a précédemment été démontré que le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) bourgeonne à la surface basolatérale des cellules épithéliales, et que le signal responsable de ce phénomène se trouve dans la partie cytoplasmique des glycoprotéines. Cependant, les structures ou acides aminés impliqués dans le signal n'étaient pas identifiés. Cette étude décrit le processus par lequel le signal de transport basolatéral des glycoprotéines du VIH a été identifié. Un système d'expression transitoire prenant avantage de cellules épithéliales MDCK directement cultivées sur membranes semi-perméables est utilisé. Une analyse de mutagénèse dirigée a démontré que la tyrosine amino-terminale de la région cytoplasmique est une composante essentielle du signal de transport. Cette étude suggère aussi qu'une structure locale en tours 13 contribue à la reconnaissance du signal. Enfin, les glycoprotéines mutantes ne démontrent aucune perte de fonction (infection, cinétiques de réplication virales), mais sont distribuées de façon non-polarisée à la surface cellulaire. Des observations préliminaires sur les glycoprotéines des virus de la leucémie T-lymphotropique humaine (HTLV) et de la leucémie mutine (MuL,V) suggéraient qu'elles possèdent des signaux de transport basolatéral. L'effet des glycoprotéines mutantes de ces deux virus sur le bourgeonnement polarisé du VIH a donc été étudié. Les signaux de transport de ces glycoprotéines ont été identifiés; ils se retrouvent dans la région cytoplasmique de ces glycoprotéines et une tyrosine est essentielle à chacun. La conservation d'un tel signal dans plusieurs rétrovirus suggère que le bourgeonnement polarisé est un phénomène important dans la biologie de ce groupe de virus. Enfin, étant donné que l'incorporation des glycoprotéines dans la particule virale est essentielle au bourgeonnement polarisé du VIH, les mécanismes gouvernant ce phénomène ont été étudiés. Il a été démontré que la délétion de la partie cytoplasmique des glycoprotéines du VIH permettait leur incorporation à l'intérieur de particules rétrovirales hétérologues. Ces observations sont ici reproduites en tenant compte de l'utilité de ces vecteurs en thérapie génique. Les vecteurs rétroviraux ayant incorporé les glycoprotéines tronquées transduisent spécifiquement un gène dans les cellules CD4+ d'une population mixte de lymphocytes. L'ensemble de ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'assemblage des rétrovirus et le transport intracellulaire de leurs protéines.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central.<br />Il agit sur trois grands types de récepteurs ionotropiques, les récepteurs AMPA, NMDA et<br />kainate. Les récepteurs AMPA sont les principaux médiateurs de la transmission synaptique<br />excitatrice dans le système nerveux. Récemment, ce rôle a également été attribué aux<br />récepteurs kainate mais dans des conditions d'activation synaptique intense lorsque de<br />grandes quantités de glutamate sont libérées. La question s'est alors posé de savoir si ces<br />récepteurs participaient à la transmission synaptique excitatrice dans des conditions d'activité<br />plus physiologiques.<br />La première partie de ce travail a consisté à réexaminer les conditions d'activation des<br />récepteurs kainate post-synaptiques dans les cellules pyramidales de la région CA3 et dans les<br />interneurones de la région CA1 de l'hippocampe de rat contrôle. Nos résultats montrent que<br />les récepteurs kainate peuvent être activés par de faibles quantités de glutamate libéré dans<br />ces deux types cellulaires. Nos quantifications révèlent que, dans ces conditions de faible<br />libération de glutamate, leur participation à la transmission synaptique excitatrice est très<br />significative. Nous montrons également que dans les cellules pyramidales de CA3 les<br />récepteurs AMPA et KA sont spécifiquement co-activés au niveau post-synaptique au niveau<br />des fibres moussues en provenance des cellules granulaires.<br />Un bourgeonnement pathologique des fibres moussues est observé dans les modèles<br />animaux et chez les patients atteints d'épilepsie du lobe temporal, une des formes les plus<br />fréquentes d'épilepsie chez l'homme. Après bourgeonnement, les fibres moussues viennent<br />former des synapses aberrantes sur les cellules granulaires. Dans une seconde partie de ce<br />travail nous nous sommes demandés si ce bourgeonnement pouvait modifier la transmission<br />synaptique portée par les récepteurs kainate dans les cellules granulaires dans un modèle<br />animal d'épilepsie du lobe temporal. Nos résultats montrent que, contrairement aux cellules<br />granulaires de rats contrôles, la transmission synaptique excitatrice passe par l'activation de<br />récepteurs kainate dans les cellules granulaires d'animaux épileptiques chroniques. Nos<br />quantifications montrent que dans ces cellules la transmission synaptique portée par les<br />récepteurs kainate est très significative et est directement liée au bourgeonnement des fibres<br />moussues caractéristique des épilepsies du lobe temporal.<br />En conclusion, ces travaux montrent le rôle important des récepteurs kainate dans la<br />transmission synaptique dans des conditions physiologiques. Nos travaux montrent également<br />que la plasticité post-lésionnelle peut induire une transmission synaptique aberrante portée par l'activation des récepteurs kainate dans un modèle animal d'épilepsie du lobe temporal.

La voie endo-lysosomale dirige les récepteurs membranaires vers le processus de dégradation lysosomale. En bref, les récepteurs sont marqués par l'ubiquitine, envoyés vers les endosomes précoces puis, pris en charge pas le système ESCRT (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) et intégrés dans des vésicules intraluminales. Ce système est composé des complexes ESCRT-0, I, II, II et VPS4. Certaines protéines ESCRT sont aussi recrutées lors de processus topologiquement similaires comme la cytokinèse ou le bourgeonnment viral de certains virus enveloppés. AMSH (Associated Molecule of the SH3 domain of STAM) est une ubiquitine-hydrolase associée au système ESCRT qui hydrolyse les chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63. Elle interagit directement avec ESCRT-0 via la sous-unité STAM et avec les membres CHMP1A, 1B et 3 d'ESCRT-III. Bien qu'AMSH pourait recruter ces protéines ESCRT ou être elle-même recrutée par celles-ci, le mécanisme d'activation de son activité d'hydrolase est encore méconnu. Afin de mieux comprendre les bases structurales de l'activation d'AMSH, j'ai essayé danalyser des formes recombinantes de cette protéine par cristallographie aux rayons X et par diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) ce qui m'a permis d'obtenir deux modèles à basse résolution. De plus, j'ai caractérisé par SPR (Surface Plasmon Resonance) les interactions entre AMSH et CHMP1A, 1B et 3 et déterminé les résidus clefs du dernier complexe. Cela a montré que les surfaces d'interaction employées par le domaine MIT d'AMSH ne sont pas les mêmes pour CHMP3 et CHMP1A/1B. J'ai aussi découvert que l'activité enzymatique d'AMSH seule est très faible ce qui impliquerait une auto-inhibition en solution. L'hydrolyse des chaînes d'ubiquitine liées par leur lysine K63 pourrait alors être activée par une construction de STAM comprenant le domaine SH3 ainsi que les domaines liant l'ubiquitine VHS et/ou UIM.

Le bourgeonnement est l'étape finale du cycle viral du virus VIH. Les particules virales vont devoir modifier la topologie de la membrane plasmique afin de promouvoir leur libération dans le milieu extracellulaire ; cette étape est réalisée par le recrutement de protéines ESCRT (en particulier CHMP4 et CHMP2) au point de bourgeonnement. A ce jour, les détails moléculaires de ce recrutement sont méconnus. Lethal Giant Discs (LgD) a été décrite dans la littérature comme un régulateur du traffic endosomal, et une interaction avec CHMP4B a été proposée pour l'orthologue humain CC2D1A. Un point majeur de ce travail aura été de caractériser l'interaction CC2D1A.CHMP4B, mais également de mieux comprendre l'organisation de la protéine. En particulier j'ai résolu la structure d'un fragment de LgD à 2.4 Å, comprenant une région hélicale et un domaine C2 en c-terminal. En outre, nous montrons que CC2D1A inhibe la capacité de CHMP4B à polymériser in vitro. A partir d'une structure cristallographique de CHMP4B et de données biochimiques, nous montrons que le site d'interaction de CC2D1A sur CHMP4B est impliqué dans la polymérisation de CHMP4B, et important pour la fonction de la protéine dans le contexte du bourgeonnement du HIV. Un projet parallèle m'a également conduit à définir un protocole de purification de la protéine CHMP2B recombinante sous forme monomérique, cet isoforme ayant été récemment impliqué dans la formation de structures tubulaires à la membrane plasmique et dans des activités de scission membranaire. En particulier, j'ai pû caractériser la protéine en présence de liposomes et préciser de nouveaux partenaires cellulaires.