Las funciones del hígado son importantes debido a su localización estratégica, entre el sistema digestivo y el resto del cuerpo (la circulación sistémica). La generación de los anticuerpos contra los transportadores de nucleósidos sodio-dependientes rCNT1 (pirimidina preferente) y rCNT2 (purina preferente) permitieron identificar la presencia de estos dos transportadores en hígado. El primer objetivo de esta tesis es establecer la localización y la distribución subcelular de rCNT1 y rCNT2 en hepatocitos de rata. Los hepatocitos representan un 60-80% de la masa celular total del hígado; son células altamente polarizadas y se caracterizan por tener una membrana plasmática diferenciada en tres dominios funcionales diferentes: la membrana basal la apical y la lateral. Por estas características y por ser muy activos metabolitamente, las células hepáticas son un buen modelo para el estudio de las rutas endocíticas. Examinamos la localización subcelular de tres maneras distintas. Primero, detectamos por técnicas de transporte y por Western blot la expresión de CNT1 y CNT2 en fracciones enriquecidas en membranas plasmáticas canaliculares y basolaterales. Segundo, determinamos la cantidad proteica y la distribución de CNT1 y CNT2 en fracciones purificadas de endosomas de hígado de rata, mediante utilización de anticuerpos contra estos transportadores. Tercio, por técnicas de microscopía electrónica. Estos estudios indican que el transportador de nucleosidos CNT1 llega en la membrana canalicular, en la cual el transportador es biológicamente activo, por una ruta indirecta a través de la membrana basolateral. Su inserción se realiza cerca de microdominios especializados enriquecidos en caveolas. CNT2 se detecta de manera casi exclusiva en preparaciones enriquecidas en membranas plasmáticas basolaterales en las cuales el transportador es activo. Estos estudios nos indican que los dos transportadores CNT1 y CNT2 tienen una ubicación diferente en células hepáticas, por lo que estos dos transportadores parecen estar diferencialmente regulados. En la segunda parte de esta tesis examinamos las interacciones entre el transportador concentrativo de adenosina CNT2 y los receptores purinérgicos. Las células hepáticas previamente tratadas, a corto plazo, con el agonista del receptor A1, (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine (RPIA) produce el incremento de la actividad de transporte de CNT2. Este efecto se inhibe en presencia de inhibidores de los canales KATP y se mimetiza en presencia de activadores de dichos canales. Estos estudios revelan que en células hepáticas, la actividad de transporte de CNT2 se regula por activación de los receptores A1, vía los canales KATP. Se ha demostrado también que la inducción de la actividad de transporte de CNT2 mediante la apertura de los canales KATP es dependiente de la activación de la PKC. Por ultimo, observamos que la glicemia y el metabolismo de la glucosa podrían afectar la regulación purinérgica de CNT2 ya que la inducción de la actividad de CNT2 mediante el receptor A1 puede ser modulada con la concentración en glucosa del medio. Estudiamos en la tercera parte de esta tesis el papel del óxido nítrico y de la PKC en la activación post-traduccional de CNT2 en células hepáticas. Medimos la actividad de transporte de CNT2 en células Fao y en cultivo primario de hepatocitos después de incubar las células con diferentes activadores e inhibidores de la óxido nítrico sintasa (NOS). El resultado fue que la inhibición de la NOS provoca un aumento de la actividad de transporte de CNT2 de un 60%. Mediante inhibidores de la actividad de la PKC y bloqueadores de los canales KATP, determinamos que la disminución de la concentración intracelular de óxido nítrico contribuye en la activación, a corto plazo, del transportador CNT2 mediante la activación, independientemente de la PKC, de los canales KATP. / INGLÉS:The first part of this these study of the subcellular localization and trafficking of CNT1 and CNT2 in rat hepatocytes. These studies indicated that the Na+-dependent nucleoside transporter CNT1 is present in a caveolin-enriched plasma membrane fraction (CEF), in transcytotic endosomes, and in canalicular membranes isolated from quiescent rat liver in which the transporter appears to be biologically active. Plasma membrane preparations enriched in basolateral markers showed Na+-dependent nucleoside transport activity that is mostly, if not exclusively, accounted for by CNT2, a transporter protein that it is not detected in CEF nor in the endosomal fractions. The two CNT transporters are spatially segregated and that this is due to their localization being regulated by distinct trafficking pathways in hepatocytes. CNT1 as being the first transporter that follows the transcytotic pathway for insertion into the apical side of liver parenchymal cells. The second part is focused on interactions between CNT proteins and purinergic receptors. These studies reveal a novel mechanism of regulation of the high affinity concentrative adenosine transporter, CNT2, via activation of adenosine A1 receptor in liver. This regulation is mediated by the activation of ATP-sensitive K(+) (K(ATP)) channels. The transient increase in CNT2-mediated transport activity triggered by (-)-N(6)-(2-phenylisopropyl)adenosine is fully inhibited by K(ATP)-channel blockers and mimicked by a K(ATP) channel opener. The extent of the purinergic modulation of CNT2 can be modulated by the glucose concentration, a finding that indicates that glycemia and glucose metabolism may affect this cross-regulation among A(1)R, CNT2, and K(ATP) channels. The third part involves a study of the effects of endogenous nitric oxide (NO) synthesis on the concentrative adenosine transporter, CNT2. Inhibition of endogenous NO synthesis (using either L-NAME and L-NMMA) in hepatoma FAO cells and in primary cultures of rat hepatocytes increases the functional activity of CNT2. This effect can be reversed by the addition of NO donors. Unlike the purinergic-mediated response, the activation triggered by NO inhibitors is poorly dependent on extracellular glucose, although interestingly, it can still be inhibited by the addition of K(ATP) channels blocker, glibenclamide.

Els nucleòsids poden ser modificats estructuralment amb l'objectiu de generar compostos farmacològicament actius en el tractament de tumors sòlids i malalties limfoproliferatives. Aquests fàrmacs són internalitzats a través dels transportadors de nucleòsids, pel que la dotació de transportadors en les cèl.lules tumorals pot determinar la seva acció citotòxica. En base a aquestes dades l'objectiu d'aquesta tesi doctoral ha estat analitzar el paper dels transportadors de nucleòsids en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids, especialment en el tractament de malalties limfoproliferatives. La primera part de l'estudi va suposar la caracterització cinètica dels transportadors presents en la línia cel.lular derivada de leucèmia pro-limfocítica JVM-2, així com dels transportadors responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid fludarabina. Posteriorment, l'estudi es va estendre a la determinació dels nivells d'ARNm, proteïna i activitat dels transportadors de nucleòsids presents en cèl.lules de pacients de leucèmia limfàtica crònica. Paral.lelament, es va mesurar la seva sensibilitat a la fludarabina amb l'objectiu de determinar si existia algun tipus de correlació entre el transport i la citotoxicitat. Les dades obtingudes van demostrar que els nivells de proteïna d'hENT2 podien ser predictius de la sensibilitat a la fludarabina en la leucèmia limfàtica crònica. Per complementar els resultats obtinguts, es va realitzar un estudi equivalent amb línies cel.lulars derivades de limfoma de mantell, amb l'objectiu de comprovar el paper diferencial dels transportadors de nucleòsids equilibratius en la sensibilitat a anàlegs de nucleòsids en funció del tipus de malaltia i del fàrmac administrat. En aquest cas, va ser el transportador hENT1 el que es correlacionava amb la sensibilitat a la gemcitabina. Així doncs, atenent al paper que juguen els transportadors equilibratius en la sensibilitat a fàrmacs derivats de nucleòsids es va avaluar el paper del transportador hENT1 en la resposta transcripcional associada a la teràpia amb fluoropirimidines mitjançant la utilització de microarrays d'ADN. Com a model es va utilitzar la línia cel.lular derivada de tumor de mama MCF7, pel que inicialment es va realitzar una caracterització dels transportadors de nucleòsids presents en la línia, així com de les isoformes responsables de la captació de l'anàleg de nucleòsid 5'-desoxi-5-fluorouridina. L'avaluació del paper d'hENT1 es va realitzar mitjançant la inhibició farmacològica de la seva activitat amb NBTI. Els canvis d'expressió gènica obtinguts mitjançant els experiments de microarrays d'ADN van demostrar que la inhibició d'hENT1 bloqueja total o parcialment els canvis transcripcionals associats a l'acció del 5'-DFUR. Per tant, els resultats obtinguts demostren que els transportadors de nucleòsids equilibratius juguen un paper important en la sensibilitat a fàrmacs antineoplàsics derivats de nucleòsids. / ROLE OF EQUILIBRATIVE NUCLEOSIDE TRANSPORTERS IN SENSITIVITY TO ANTINEOPLASIC DRUGSNucleoside-derivatives are currently used in the treatment of tumours and hematological malignancies. Although intracellular events involved in the pharmacological action of these compounds have been extensively studied, the role of plasma membrane transporters in nucleoside-derived drug bioavailability and action in cancer cells has not been comprehensively addressed. We examined the expression patterns and activity of nucleoside transporters in chronic lymphocytic leukaemia (CLL) patients and correlated them with in vitro fludarabine cytotoxicity. Among the known plasma membrane transporters, we observed a significant correlation between fludarabine uptake via ENT carriers and ex vivo sensitivity of CLL cells to fludarabine. Moreover, western blot results suggested a role of hENT2 in fludarabine responsiveness in CLL patients. A similar study was performed using mantle cell lymphoma (MCL) cells. In this case we found a significant correlation between protein and mRNA levels of hENT1, drug uptake and sensitivity to gemcitabine. Finally, we addressed the question of whether equilibrative nucleoside transporters contribute to the transcriptomic response associated with nucleoside-derived drug therapy. For this reason, we used a pharmacogenomic approach to determine which are the intracellular targets of 5'-DFUR action in breast cancer cell line MCF7 and how inhibition of hENT1 function contributes to the transcriptomic response. The study identified selected gene targets of 5'-DFUR action in a breast cancer cell model, and highlighted the relevant role hENT1-mediated drug uptake plays in drug action. Therefore, the results obtained further support that equilibrative nucleoside transporters are implicated in the therapeutic response to nucleoside analogues.

Els transportadors de nucleòsids són fonamentals en la regulació de molts processos fisiològics, modulant els nivells extra- i intracel·lulars dels substrats que internalitzen però a la vegada representen el camí d'entrada de molts anàlegs citotòxics utilitzats en la quimioteràpia i teràpies antivirals. En aquesta tesi s'han dut a terme diversos estudis amb l'objectiu d'intentar determinar mecanismes implicats tant en la localització subcel·lular així com en la regulació dels transportadors de nucleòsids. Així, s'ha demostrat que les diferents isoformes de transportadors de nucleòsids es regulen de manera diferencial en funció dels requeriments de la cèl·lula. Concretament, els resultats obtinguts en un model cel·lular d'epiteli intestinal han demostrat que el transportador equilibratiu ENT1 és sensible a factors proliferatius i en canvi l'expressió i activitat dels transportadors concentratius CNT1 i CNT2 responen a factors que afavoreixen la diferenciació de les cèl·lules. Addicionalment, s'ha posat de manifest que l'activitat del transportador CNT2 està regulada a curt termini per la disponibilitat dels seus substrats mitjançant un mecanisme que no depèn de canvis en la localització subcel·lular del transportador sinó que implica una disminució de la seva afinitat. D'altre banda s'ha demostrat que per l'expressió polaritzada d'aquest transportador a la membrana apical de les cèl·lules epitelials absortives és necessària una seqüència de direccionament present en el extrem N-terminal de la proteïna. Finalment, els resultats obtinguts en aquesta tesi han posat de manifest que aquests transportadors, a més de ser necessaris per mantenir les vies de recuperació o salvage podrien jugar un paper en la senyalització cel·lular. Així el transportador d'alta afinitat d'adenosina CNT2, mitjançant una relació entre el transport d'adenosina i la regulació de l'AMPK, podria participar en la complexa regulació del metabolisme energètic. / Plasma membrane transporters play a crucial role in the function of absorptive epithelia, since they mediate intestinal absorption and renal reabsorption and the secretion of numerous physiological and pharmacological compounds. Among these transport systems, nucleoside transporters are responsible for the uptake of natural nucleosides and most nucleoside-derived drugs. There are two main families of nucleoside transporters, concentrative (CNT) and equilibrative (ENT) transporters and most mammalian cells, as epithelial intestinal cells, coexpress several nucleoside transporters isoforms. In the present study, we have fully characterized the expression pattern of nucleoside transporters in two intestinal epithelial cell lines, IEC-6 and Caco-2 cells. We have analysed the regulation of these membrane transporters in IEC-6 cells upon exposure either differentiating or proliferative agents. We conclude that differentiation of intestinal epithelial cells is accompanied by an increase mature enterocytes features, such concentrative nucleoside transport (located at the brush border membrane), thus preparing the cell for its ultimate absortive function. On the contrary, proliferative stimulus up-regulate the equilibrative nucleoside transporter ENT1, known to be located at the basolateral membrane, allowing the uptake of nucleoside from the bloodstream for the increase demands of the proliferating cell. However, nucleoside transporter may not only respond to the requirement for nucleoside salvage but may also but may also play a role in cell signaling. In fact, the study shows that physiological concentrations of adenosine activate AMPK through a mechanism that requires its transport into the cell and subsequent phosphorylation, resulting in phosphorylation of the downstream AMPK target ACC. This effect is mostly dependent on the high-affinity concentrative adenosine transporter CNT2. Thus, CNT2 may therefore be considered a novel player in the complex regulation of AMPK and energy metabolism.

La información disponible acerca de los transportadores de nucleósidos concentrativos en cerebro es muy limitada, mientras que existen varios estudios acerca de los transportadores equilibrativos. La primera parte de esta tesis se centra en la localización del transportador de nucleósidos concentrativo preferente por adenosina CNT2 en cerebro y su posible regulación transcripcional, ya que su afinidad por este neuromodulador es mayor que el resto de transportadores. Se ha visto que el transcrito de CNT2 se localiza en un gran número de regiones del sistema nervioso central, principalmente en poblaciones neuronales. En concreto, se han detectado niveles moderados del transcrito en hipocampo, amígdala, capas profundas de la corteza cerebral, corteza retrosplenial y piriforme, así como en la capa molecular del cerebelo. Estudios de regulación indican que el transcrito de esta proteína varía en situaciones donde la adenosina interviene vía el receptor de adenosina A1, por ejemplo, se han realizado estudos de privación de sueño prolongado donde los niveles de adenosina son muy elevados. Así mediante muestras de cortezas cerebrales de rata a las que se les tuvo en vigilia durante 24 horas, se valoraron los niveles de transcrito de CNT2, observando una disminución de hasta un 25% respecto al control. Tras ocho horas de recuperación los niveles iniciales sólo se recuperaban de forma parcial. También mediante modelos animales a los que se les había tratado con ácido kaínico para la inducción de convulsiones, los niveles del transportador aumentan a medida que pasa el tiempo tras el tratamiento. Esto sería consistente con el hecho de que la adenosina incrementa sus niveles en situaciones patológicas vía el receptor A1 en su función de neuroprotección.La segunda parte de esta tesis consiste en el estudio de la expresión de los transportadores de nucleósidos en tejidos tumorales. Para esto se han generado y desarrollado anticuerpos específicos contra las isoformas humanas de estas proteínas que se han utilizado en el análisis de un gran número de pacientes de tumores ginecológicos y de mama. Los resultados obtenidos nos indican que la pérdida de expresión de hCNT1 es más común que la de los transportadores equilibrativos en tumores ginecológicos y esta disminución se asocia a subtipos histológicos de peor pronóstico como pueden ser tumores de célula clara o adenocarcionomas. En tumores de mama, la expresión citoplasmática y sobre todo nuclear de hCNT1 se encuentra asociada a un por pronóstico, además de encontrar correlaciones positivas entre el número de células positivas para el transportador de nucleósidos hCNT1 y algunos marcadores del metabolismo de nucleótidos como DPD y TS, y correlaciones negativas con marcadores de baja proliferación celular como bcl2 y MIB. Si tenemos en cuenta el estado del nódulo linfático y lo asociamos al número de células positivas para hCNT1 observamos que estos dos factores combinados son indicativos de un mayor riesgo de recaída. / In this study, we analysed the concentrative transporter CNT2 in the rat brain and compared it with that of ENT1. Furthermore, we evaluated their changes in a situation of increased extracellular levels of adenosine, such as sleep deprivation. CNT2 mRNA was most prevalent in the amygdala, the hippocampus, specific neocortical regions and the cerebellum. Total sleep deprivation dramatically diminished the amounts of CNT2 mRNA, whereas ENT1 mRNA remained unchanged. This decrease in CNT2 transcript suggests a new physiological role for the transporter in the modulation of extracellular adenosine levels.In this part of the study we report the characterization of 2 new antibodies raised against hENT1 and hENT2. These 2 antisera, along with a previously characterized antibody against hCNT1 have been used to analyze NT expression in gynecologic cancers: hCNT1 was by far the isoform whose expression was most frequently reduced or lost in the types of gynecologic tumors analyzed. NT expression is related to the type of gynecologic tumor and its specific subtype, hCNT1 protein loss being highly correlated with poor prognosis histotypes. We also studied ninety breast cancer patients who were treated with CMF after surgery. hCNT1 and enzymes associated with nucleotide metabolism were assessed immunohistochemically. CNT1 expression was mostly cytoplasmic, with some nuclear staining.. Nuclear staining correlated negatively with decreased disease-free survival, whereas the percentage of hCNT1-positive cells correlated positively with reduced long term survival, the hCNT1-positive index being indicative of poor prognosis. A relative risk of relapse was associated with high hCNT1-positive indexes, whereas when this parameter was combined with the nodal status (positive) a high risk of relapse was found, suggesting that both parameters may reflect a poor prognosis.