La tasa de proliferación celular resulta de un balance entre varios procesos celulares: mitosis, diferenciación celular y la muerte celular apoptótica. La regulación de este balance es fundamental durante el desarrollo embrionario, la regeneración celular y el envejecimiento, así como en distintos procesos degenerativos y patológicos. Recientemente se ha clonado un gen, designado Zac1, el cuál codifica un factor de transcripción que regula la apoptosis y el paro del ciclo celular, mediante vías independientes. Se ha determinado que en ratones adultos Zac1 se expresa en la glándula pituitaria, en el cerebro, y en distintos tejidos periféricos, así como en el tubo neural de embriones de ratón con 9 días. Distintos estudios han demostrado que Zac1 está implicado en el desarrollo tumoral, en la diabetes mellitus neonatal transitoria, en la activación y/o represión de receptores nucleares, en la coactivación de la vía apoptótica p53/Apaf-1, etc. Sin embargo, su función en el sistema nervioso central es aún desconocida.La presente tesis tiene como objetivo general, determinar el papel de Zac1 en el sistema nervioso central del ratón. En este sentido, se determinó el patrón de expresión de Zac1 durante el desarrollo embrionario del neuroectodermo y mesodermo, así como, durante la maduración del sistema nervioso central (mediante técnicas de hibridación in situ e inmunohistoquímicas). Además, se caracterizó el fenotipo de las poblaciones celulares que expresan Zac1 durante el desarrollo. En el desarroollo del neuroectodermo, los resultados obtenidos muestran que Zac1 se expresa en las células madre/progenitoras del sistema nervioso central, tanto en desarrollo como en el animal adulto (zonas germinativas). Su expresión en células diferenciadas se restringe a subpoblaciones neuronales de naturaleza GABAérgica y catecolinérgica. En el desarrollo del mesodermo, los resultados revelaron que Zac1 se expresa durante todas las fases del ciclo de vida de los condrocitos (condrogénesis) y del desarrollo de las células musculares (miogénesis), sugiriendo que Zac1 puede jugar un papel importante en el desarrollo del esqueleto y del músculo esquelético.Por otra parte, se estudió el papel de Zac1 en el sistema nervioso central, analizando el fenotipo neural de los ratones mutantes para Zac1, y estudiando el papel de Zac1 en los procesos neurodegenerativos asociados con la muerte celular apoptótica. Los animales mutantes para Zac1 presentan tasas de proliferación neural superiores a la de los animales salvajes, reforzando el papel de Zac1 en el control de la tasa de proliferación celular (ciclo celular y apoptosis). Además, los resultados obtenidos muestran que la expresión regional de Zac1 es imprescindible para la selección y/o diferenciación de distintos progenitores neurales (tales como en los oligodendrocitos, las neuronas, los astrocitos, etc). En los modelos neurodegenerativos, los resultados obtenidos muestran que Zac1 es imprescindible para activar los procesos apoptóticos que conducen a la fragmentación del DNA, apuntando a su implicación en las fases tempranas de la activación de las cascadas apoptóticas.Por tanto, los novedosos resultados obtenidos en este trabajo de tesis abren distintas líneas de enfoque sobre el papel de zac1 en el sistema nervioso central, concretamente en los procesos de proliferación y diferenciación celular, en los procesos apoptóticos y en los mecanismos de plasticidad neural que ocurren durante el desarrollo temprano del organismo, así como, tras la activación neural que se desarrolla en los procesos de neurodegeneración. / The proliferative rate results from a balance between cell division (mitosis), cell differentiation, and programmed cell death (apoptosis). Controlling this balance is fundamental during embryonic development, tissue regeneration, and aging, as well as in neurodegenerative process. In 1997, Spengler and collaborators cloned Zac1, a new zinc-finger transcription factor induces the cellular cycle arrest and the apoptosis, by means of independent routes, like p53. Zac1 is high expressed in the pituitary gland and in some brain areas. However, their role in the central nervous system had not been studied. In this way, this work, we study the pattern of expression of Zac1 during the maturation of the central nervous system (Valente and Auladell, 2001), as well as during the early development of neuroectoderm and mesoderm (Valente et al., 2005), in mice. In addition, we characterized these neural populations that express Zac1 during the development, demonstrating that initially (embryonic and postnatal mice) its expression is strong in neural cells with high mitotic activity (progenitors and stem cells) and later (adult mice) in interneurons of the GABAergic system. These results took to us to analyze if the strong expression of Zac1 in the central nervous system would be related to its apoptotic function. In this way, our results in neurodegenerative processes, as much in normal mice (Valente et al., 2004) as in mutant mice for Zac1 (Valente et al., 2005; results in preparation), show that although the expression of Zac1 is important in the induction of the apoptosis, is not their main function in the development and maturation of central nervous system, suggesting that Zac1 more would be implied in controlling the cellular cycle that in inducing the apoptosis. Moreover, a detail immunohistological study of the Zac1 mutant mice brain shows that the expression of Zac1 is important for the differentiation of the oligodendrocytes, interneurons and astrocytes, and suggest an important role of Zac1 in the differentiation and/or selection process of the progenitors/stem cells of the nervous system.

La información disponible acerca de los transportadores de nucleósidos concentrativos en cerebro es muy limitada, mientras que existen varios estudios acerca de los transportadores equilibrativos. La primera parte de esta tesis se centra en la localización del transportador de nucleósidos concentrativo preferente por adenosina CNT2 en cerebro y su posible regulación transcripcional, ya que su afinidad por este neuromodulador es mayor que el resto de transportadores. Se ha visto que el transcrito de CNT2 se localiza en un gran número de regiones del sistema nervioso central, principalmente en poblaciones neuronales. En concreto, se han detectado niveles moderados del transcrito en hipocampo, amígdala, capas profundas de la corteza cerebral, corteza retrosplenial y piriforme, así como en la capa molecular del cerebelo. Estudios de regulación indican que el transcrito de esta proteína varía en situaciones donde la adenosina interviene vía el receptor de adenosina A1, por ejemplo, se han realizado estudos de privación de sueño prolongado donde los niveles de adenosina son muy elevados. Así mediante muestras de cortezas cerebrales de rata a las que se les tuvo en vigilia durante 24 horas, se valoraron los niveles de transcrito de CNT2, observando una disminución de hasta un 25% respecto al control. Tras ocho horas de recuperación los niveles iniciales sólo se recuperaban de forma parcial. También mediante modelos animales a los que se les había tratado con ácido kaínico para la inducción de convulsiones, los niveles del transportador aumentan a medida que pasa el tiempo tras el tratamiento. Esto sería consistente con el hecho de que la adenosina incrementa sus niveles en situaciones patológicas vía el receptor A1 en su función de neuroprotección.La segunda parte de esta tesis consiste en el estudio de la expresión de los transportadores de nucleósidos en tejidos tumorales. Para esto se han generado y desarrollado anticuerpos específicos contra las isoformas humanas de estas proteínas que se han utilizado en el análisis de un gran número de pacientes de tumores ginecológicos y de mama. Los resultados obtenidos nos indican que la pérdida de expresión de hCNT1 es más común que la de los transportadores equilibrativos en tumores ginecológicos y esta disminución se asocia a subtipos histológicos de peor pronóstico como pueden ser tumores de célula clara o adenocarcionomas. En tumores de mama, la expresión citoplasmática y sobre todo nuclear de hCNT1 se encuentra asociada a un por pronóstico, además de encontrar correlaciones positivas entre el número de células positivas para el transportador de nucleósidos hCNT1 y algunos marcadores del metabolismo de nucleótidos como DPD y TS, y correlaciones negativas con marcadores de baja proliferación celular como bcl2 y MIB. Si tenemos en cuenta el estado del nódulo linfático y lo asociamos al número de células positivas para hCNT1 observamos que estos dos factores combinados son indicativos de un mayor riesgo de recaída. / In this study, we analysed the concentrative transporter CNT2 in the rat brain and compared it with that of ENT1. Furthermore, we evaluated their changes in a situation of increased extracellular levels of adenosine, such as sleep deprivation. CNT2 mRNA was most prevalent in the amygdala, the hippocampus, specific neocortical regions and the cerebellum. Total sleep deprivation dramatically diminished the amounts of CNT2 mRNA, whereas ENT1 mRNA remained unchanged. This decrease in CNT2 transcript suggests a new physiological role for the transporter in the modulation of extracellular adenosine levels.In this part of the study we report the characterization of 2 new antibodies raised against hENT1 and hENT2. These 2 antisera, along with a previously characterized antibody against hCNT1 have been used to analyze NT expression in gynecologic cancers: hCNT1 was by far the isoform whose expression was most frequently reduced or lost in the types of gynecologic tumors analyzed. NT expression is related to the type of gynecologic tumor and its specific subtype, hCNT1 protein loss being highly correlated with poor prognosis histotypes. We also studied ninety breast cancer patients who were treated with CMF after surgery. hCNT1 and enzymes associated with nucleotide metabolism were assessed immunohistochemically. CNT1 expression was mostly cytoplasmic, with some nuclear staining.. Nuclear staining correlated negatively with decreased disease-free survival, whereas the percentage of hCNT1-positive cells correlated positively with reduced long term survival, the hCNT1-positive index being indicative of poor prognosis. A relative risk of relapse was associated with high hCNT1-positive indexes, whereas when this parameter was combined with the nodal status (positive) a high risk of relapse was found, suggesting that both parameters may reflect a poor prognosis.