Hem identificat dos nous mecanismes de regulació transcripcional; primer, demostrem que les 14-3-3 regulen la via clàssica d'NFkB afavorint l'export citoplasmàtic dels complexes p65/IkB-alfa després de l'activació per TNF-alfa. Aquest mecanisme podria jugar un paper rellevant en l'activació d'NFkB en càncer de mama. En aquest article es demostra com les 14-3-3 regulen la via clàssica d'NFkB afavorint l'export citoplasmàtic dels complexes p65/kBalfa després de l'activació per TNF-alfa.Demostrem que p65 conté dos dominis d'unió a 14-3-3 que inclouen els aminoàcids 38-44 i 278-283, i mapem el lloc d'unió d'IkB-alfa a 14-3-3 en els aminoàcids 60-65. La mutació d'aquests dominis redistribueix p65 i IkB-alfa al nucli de les cèl.lules suggerint que 14-3-3 participa en l'export d'aquestes proteïnes del nucli.El tractament amb TNF-alfa promou el reclutament de 14-3-3 i d' IkB-alfa als promotors de gens diana d'NFkB així com la unió de p65 a les 14-3-3. A l'inhibir l'activitat NFkB amb un dominant negatiu de les 14-3-3, els complexes IkB-alfa /p65 s'acumulen al nucli de les cèl.lules. En aquestes condicions s'observa una associació constitutiva de p65 als seus gens diana que dóna lloc a una falta de resposta d'aquests gens a l'activació induïda per TNF-alfa. Així demostrem que les 14-3-3 són necessàries per la correcte regulació de la via d' NFkB ja que facilita l'export del nucli dels complexes IB/p65.En segon lloc mostrem com la proteïna IkB-alfa, descrita clàssicament com l'inhibidor de la via d' NFkB, juga un paper al nucli associant-se a la cromatina per reprimir la transcripció de gens diana de Notch com hes1 i herp2. Aquest mecanisme suposa un nou element que relaciona les vies de Notch i NFkB.En aquest article es demostra com l'inhibidor de la via d' NFkB, IkB-alfa, juga un paper nuclear associant-se a la cromatina de gens diana de Notch com hes1 i herp2, sent aquest un nou element en els mecanismes d'interrelació entre la via de Notch i la d' NFkB. Proposem que IB participa en la repressió transcripcional reclutant elements corepressors a promotors específics.En l'article es mostra com IkB-alfa interacciona amb elements repressors com corepressors nuclears i HDACs. Per immunoprecipitacions de cromatina es demostra que IkB-alfa es recluta al promotor de hes1 juntament amb HDAC1 i HDAC5. IB s'allibera temporalment del promotor de hes1 quant es tracten les cèl.lules amb TNF-alfa, aquest fet correlaciona amb un increment en l'acetilació de les histones i l'activitat transcripcional del gen. L'alliberament d'I IkB-alfa de hes1 i la seva activació transcripcional coincideix amb el reclutament d'IKK-alfa i d'IKK-beta a aquest promotor. A més a més, tant l'alliberament d' IkB-alfa de hes1 com l'increment d'acetilació de les histones induït per TNF-alfa estan afectats en els fibroblastes deficients per IKK-alfa.Al ser aquestes vies clau en la gènesi i la progressió tumoral, pensem que cal seguir estudiant els mecanismes que regulen les funcions cel.lulars normals per tal de detectar-ne els elements que es troben alterats en diferents tipus de tumor. Això ens permetrà intervenir d'una manera més eficaç al dissenyar teràpies que afecten a les vies de transducció de senyal de Nocth i d'NFkB. específiques per a cada tipus de càncer segons les alteracions identificades.

The process that gives rise to all the mature blood cells from the HSCs (Hematopoietic Stem Cells) is known as hematopoiesis. In the adult, hematopoiesis takes place in the bone marrow although the HSCs are likely generated during embryonic life (reviewed in Cumano and Godin, Ann. Rev. Immunol 2007). Mouse embryonic hematopoiesis starts at embryonic day 7-7.5 in the extraembryonic yolk sac, whereas intraembryonic hematopoiesis starts at 9.5 in the aorta surrounded by gonad and mesonephros (a region known as AGM). The current knowledge is that both hematopoietic tissues can generate either pre-HSCs or adult HSCs that will seed the fetal liver by day 12 (that expands the pool of HSCs) and finally, near birth, the bone marrow, which will sustain adult-life hematopoiesis (reviewed in Cumano and Godin, Ann. Rev. Immunol, 2007). The Notch signaling pathway regulates tissue homeostasis and development not only in the embryo but in the adult as well (reviewed in Lai, Development 2007). Notch controls proliferation, differentiation and cell death in a wide variety of tissues including the nervous system, the vascular system and the hematopoietic system. In the latter, Notch has been described to regulate HSC proliferation, cell fate decisions and inhibition/induction of programmed cell death by apoptosis (reviewed in Radtke, Febs Letters 2006). Our results from the analysis of knock-out mice for some of the members of the Notch signaling pathway such as RBPjk (Oka, Development 1995), Jagged1 (Xue, Hum Mol Genet 1999) and Jagged2 (Jiang, Genes Dev 1998) and the usage of pharmacological inhibitors such as DAPT or L-685, indicate that Notch is dispensable for yolk sac hematopoiesis, although induces cell death by apoptosis in the compartment of erythroid Ter119+ cells generated in this tissue (Robert-Moreno, Leukemia 2007). On the other hand, Notch signaling pathway is required for the generation of hematopoietic progenitors and HSCs in the AGM since directly regulates the expression of the hematopoietic transcription factor GATA2 (Robert-Moreno, Development 2005). Finally, we propose that Notch activation through the ligand Jagged1 (but not Jagged2) is required for the activation of GATA2 expression and the generation and/or amplification of a pool of HSCs with high repopulation ability (Robert-Moreno, manuscript in preparation). / El procés de generació de cèl.lules sanguínies madures a partir de les cèl.lules mare hemopoètiques o HSCs (de l'anglès Hematopoietic Stem Cells) rep el nom d'hemopoesi. A l'adult, l'hemopoesi ocòrre en el moll de l'òs tot i que es creu que les HSCs es generen durant el desenvolupament embrionari (revisat a Cumano y Godin, Ann. Rev. Immunol 2007). En el ratolí l'hemopoesi embrionària comença a dia 7-7.5 de gestació, en el sac extraembrionari, mentres que a dia 9.5 comença l'hemopoesi intraembrionària en l'aorta rodejada de gònada i mesonefros (regió denominada AGM). Actualment, es creu que ambdós teixits hemopoètics són capaços de generar pre-HSCs o HSCs adultes, que colonitzaran el fetge fetal a dia 12 de gestació (amplificant-se el nombre de HSCs) i finalment, prop del naixement, el moll de l'òs, on donaran lloc als diferents tipus cel.lulars hemopoètics durant la vida adulta (revisat a Cumano y Godin, Ann. Rev. Immunol, 2007). La via de senyalització cel.lular a través del receptor de membrana Notch regula processos d'homeostasi i desenvolupament de teixits, tant en l'embrió com en l'adult (revisat a Lai, Development 2007). La via de Notch controla processos de proliferació, diferenciació i mort cel.lular en teixits tant diferents com el sistema nerviós central, sistema vascular o el sistema hemopoètic. En aquest últim, s'ha descrit funcions de Notch en la proliferació de cèl.lules mare, presa de decisions de destí cel.lular o prevenció i/o inducció de mort cel.lular per apoptosi (revisat a Radtke, Febs Letters 2006). Els nostres resultats mitjançant l'anàlisi de ratolins mutants en alguns dels components de la via de Notch, com RBPjk (Oka, Development 1995), Jagged1 (Xue, Hum Mol Genet 1999) i Jagged2 (Jiang, Genes Dev 1998) i l'ús d'inhibidors farmacològics de la via de Notch (tals com DAPT i L-685) indiquen que la via de Notch no és indispensable per l'hemopoesi del sac embrionari, tot i que regula l'homeostasi en el compartiment de cèl.lules eritroides Ter119+ que es generen en aquest, mitjançant la inducció de mort cel.lular programada o apoptosi (Robert-Moreno, Leukemia 2007). En canvi, la via de Notch és requerida per la generació de progenitors hemopoètics i HSCs en la regió de l'AGM i demostrem que aquest procés és degut a que Notch1 regula directament l'expressió del factor de transcripció GATA2 en les cèl.lules endotelials de la paret ventral de l'aorta (Robert-Moreno, Development 2005). Finalment, també proposem que l'activació del receptor Notch a través del lligand Jagged1 (però no Jagged2) és necessària per l'activació de l'expressió de GATA2 i la generació i/o amplificació de HSCs amb gran capacitat repobladora (Robert-Moreno, manuscrit en preparació).

Sp1 i Sp3 pertanyen a la família de factors de transcripció Sp que controla la transcripció de gens implicats en gairebé tots els processos cel.lulars. Estudis previs al nostre grup van estudiar la regulació del promotor del gen Sp1 i van demostrar que la transcripció de Sp1 estava regulada principalment de forma positiva per Sp1 i NF-Y, i que Sp3 era capaç de contrarrestar l'activació produïda per Sp1 sobre el seu propi promotor. Donat que la relació Sp1/Sp3 a la cèl·lula és important per a la regulació dels gens diana, en aquest treball ens vam proposar estudiar la regulació del promotor de Sp3.Vam clonar una regió de 546 bp que corresponia al promotor de Sp3 i vam procedir a la seva caracterització. Sp3 presenta múltiples inicis de transcripció localitzats entre les posicions -132 i -70 respecte de l'inici de traducció i la seva màxima activitat promotora es localitza a la regió fins a -281bp respecte de l'inici de traducció. Mitjançant les tècniques de retardament de la movilitat electroforètica (EMSA) i Immunoprecipitació de la Cromatina (ChIP) hem demostrat la unió dels factors Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb i c-Jun al promotor de Sp3. D'altra banda hem estudiat l'efecte de la sobreexpressió i la inhibició d'aquestes proteïnes sobre l'activitat d'aquest promotor utilitzant assajos d'activitat luciferasa, i sobre els nivells endògens de mRNA utilitzant RT-Real Time-PCR. Sp3 activa la transcripció del seu propi promotor. El promotor de Sp3 també és activat de forma més potent per Sp1, Sp3 i NF-Y; tot i que NF-1, c-Myb, B-Myb, c-Jun i c-Fos també poden activar aquest promotor. Un altre fet remarcable és que E2F1 es comporta com a repressor del promotor de Sp3. Tots els resultats observats a nivell de l'activitat del promotor es van confirmar amb la mesura dels nivells endogens de mRNA per Sp3.Addicionalment, s'ha estudiat la interacció de Sp1 amb diferents proteïnes implicades en la regulació del cicle cel·lular i s'ha caracteritzat l'efecte de la seva sobreexpressió sobre l'activitat del promotor de Sp1, ja que està regulat per Sp1. Utilitzant un array d'anticossos, es va fer un cribatge de proteïnes que poguessin interaccionar amb Sp1, i algunes d'elles es van confirmar per co-immunoprecipitació. Això ens va permetre demostrar que Sp1 és capaç d'interaccionar amb CDK4, p21, SKP2 i BRCA2. Posteriorment, vam analitzar l'efecte d'aquestes i altres proteïnes que interaccionen amb Sp1 sobre el promotor de Sp1, i vam observar que el promotor de Sp1 és regulat de forma positiva per la sobreexpressió de CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 i Stat3; mentre que és reprimit per la sobreexpressió de p53 i NFB. Per tal d'analitzar si hi havia una correlació entre els efectes sobre el promotor de Sp1 i una alteració dels nivells endogens de Sp1, vam confirmar tots els efectes observats a nivell de l'activitat del promotor tot emprant la tècnica de RT-Real Time-PCR. A més, els efectes sobre el promotor de Sp1 es produeixen mentre aquestes proteïnes estan unides, directa o indirectament, al promotor tal com van demostrar els assajos de ChIP. També vam estudiar l'efecte de la sobreexpressió d'aquestes proteïnes sobre un promotor que només contenia caixes Sp1 i, en general, vam observar efectes equivalents als observats per al promotor de Sp1. La interacció entre Sp1-p21 va ser objecte d'estudi en més detall i vam determinar que l'expressió de p21 en cèl·lules de fibrosarcoma indueix el promotor de Sp1 així com els nivells de mRNA, però, al mateix temps, indueix la degradació de Sp1.Com a conclusió final, hem vist que el procés de transcripció és un mecanisme molt complex que involucra un gran número de factors de transcripció, així com d'altres proteïnes que puguin interaccionar amb aquests factors. / Sp1 and Sp3 belong to the Sp family of transcription factors that controls transcription of genes involved in almost all processes in the cell. We performed a detailed analysis of the promoter region of the Sp3 transcription factor, including the identification of its transcriptional start sites and the putative binding sites for transcription factors. Multiple transcriptional starts sites were located at position sranging from -70 to -132 relative to the translational start of the gene. We defined the minimal promoter region cooresponding to 281 bp relative to the translational start. Along the promoter sequence we demonstrated the binding of Sp1, Sp3, NF-Y, NF-1, c-Myb, B-Myb and c-Jun. Moreover, we studied the effect of the overexpression or knocking down of these factors on the Sp3 promoter activity and the endogenous mRNA levels. Sp3 is positively autoregulated and it is also activated by Sp1, NF-Y, Myb, AP-1 and NF-1. On the contrary, Sp3 transcription is repressed by E2F/DP1 overexpression.Additionally, we studied the interaction of Sp1 with other proteins involved in the cell cycle regulation and we characterized the effect the overexpression of these proteins on the Sp1promoter activity, given that this promoter is regulated by Sp1. Sp1 is able to interact with CDK4, p21, SKP2 and BRCA2. The Sp1 promoter is positively regulated by the overexpression of CDK4, SKP2, BRCA2, Ciclina D1, E2F1/DP1 and Stat3 whereas the overepression of p53 and NFB represses the promoter. The effects of all these proteins were also analyzed at the Sp1 mRNA level and by using an artificial promoter containing only Sp1 binding sites. The interaction between Sp1 and p21 was further analyzed and we demonstrated that, in fibrosarcoma cells, p21 induces the Sp1 promoter and its mRNA expression but, at the same time, it induces the degradation of Sp1 protein.The process of transcription is a very complex mechanism that involves a great number of transcription factors and other proteins interacting with these factors.

Els gens que formen el cluster ParaHox són factors de transcripció, que a l'origen dels metazous s'originaren per duplicacions d'un gen ancestral comú amb homeodomini. A l'origen dels vertebrat i per duplicacions cromosòmiques o del genoma sencer, aquest cluster es duplicà formant fins a quatre clusters. En el genoma humà trobem un cluster sencer format pels gens Cdx2/3, Pdx1 i Gsh1 en el cromosoma 13 humà. El gen Gsh2 es troba en el cromosoma 4. Cdx4 en el cromosoma X i Cdx1 en el cromosoma 5. La hipòtesi de treball a l'inici d'aquesta recerca (abans de la seqüenciació del genoma humà) era que existien, molt probablement, d'un a tres gens paràlegs a Pdx1 en el genoma humà, que no havien estat identificats. Les estratègies utilitzades basades en la cerca per homologia de seqüència entre els gens duplicats, portà a l'aillament repetides vegades de Pdx1. Finalment la publicació del genoma humà confirmà la no existència de gens Pdx1 duplicats identificables en el genoma humà. Ja que la majoria d'estudis fets sobre l'expressió dels gens ParaHox s'havien realitzat en embrions, es va decidir analitzar l'expressió dels gens ParaHox en diversos teixits adults de ratolí. Això va permetre descriure l'expressió de Pdx1 en testicle; Cdx1 s'expressa a pulmó i muscle i a nivells baixos a cervell; Cdx2/3 a testicle, fetge, pulmó, muscle i també, a nivells baixos a cervell; Cdx4 s'expresa en tots els teixits adults analitzats menys en muscle; finalment tan Gsh1 com Gsh2 s'expressen a testicle i a cervell. Per tal de veure si els gens ParaHox podien estar implicats en la regulació de l'homeostasi de la glucosa de l'organisme adult, es va analitzar la seva expressió en el pàncrees del ratolí adult, utilitzant les tècniques de hibridació in situ, i es va confirmar la seva expressió en el pàncrees endocrí. Per analitzar en quin tipus cel.lular dels illots s'expressava es va realitzar una doble immunodeteció amb els anticossos anti-insulina i anti-glucagó i es va confirmar l'expressió en cèl.lula "alfa" de tots els gens ParaHox. El gen Pdx1 a més d'expressar-se en les cèl.lules "beta" tal com ha estat ampliament descrit, s'expressa en cèl.lules de la perifèria positives pel glucagó, i en algunes cèl.lules aquest marcatge queda retingut a nucli proposant un procés de regulació postranscripcional o pretraduccional. Finalment per tal d'analitzar l'acció que els gens ParaHox podien tenir sobre la regulació del promotor del gen de la insulina, es van realitzar construccions de tots els gens ParaHox en vectors d'expressió i es van cotransfectar -en cultius de cèl.lules alfa-TC1 i beta-TC6- juntament amb el promotor del gen de la insulina que dirigia l'expressió del gen reporter de la luciferasa. Les transfeccions es realitzaren a dues concentracions diferents de glucosa (0'5 mM i 25 mM) i a diferents concentracions de factors de transcripció. En les cèl.lules beta-TC6, CDX1 és capaç d'activar aquest promotor a elevades concentracions, independentment de la concentració de glucosa. CDX2/3, a elevades dosis transactiva el promotor en presència de glucosa, mentre que CDX4 provoca una forta inhibició depenent de dosi. Ni CDX2/3, ni CDX4 afecten la transactivació del promotor a baixes concentracions de glucosa. En les cèl.lules alfa-TC1, CDX1, a elevades concentracions, transactiva moderadament el promotor en presència de glucosa, i no té cap efecte aparent en absència. CDX2/3 té un efecte inhibidor en absència de glucosa i cap efecte aparent en presència de glucosa. L'efecte més rellevant és l'observat amb CDX4 que, en presència de glucosa, provoca una forta activació del promotor del gen la insulina, més evident a baixes concentracions de factor de transcripció. / ParaHox genes, homeobox transcription factors, are expressed at different stages during mouse development and in different adult tissues. In the adult mouse pancreas, all ParaHox genes are expressed in  cells, the only exception being Pdx1, that is expressed in beta-cells. In some cells, localised at the periphery of the islets, Pdx1 mRNA is retained at the nucleus and does not always colocalise with PDX1 protein, suggesting a postranscriptional regulatory mechanism. In some cells, PDX1 colocalise with glucagon staining. We transfected all ParaHox genes with the insulin promoter in alpha-TC1 and beta-TC6 cultured cells and we show that they can act as activators or repressors on the insulin promoter. The most interesting result is observed with the transfection of CDX4, where we observe a strong inhibition at high glucose concentration, whereas the opposite result is observed when we transfected CDX4 at high glucose concentration in alpha-TC1 cultured cells. We proppose that ParaHox genes expressed in adult pancreas may be involved in glucose homeostasis regulation, hence they may be good candidates to be involved in diabetes.

Genomic microarray analysis is rapidly replacing conventional chromosome analysis by molecular karyotyping due to the significant increase in the power to detect causative CNVs. Here, we extensively validated the HumanHap550 and Human610-Quadv1_B Illumina platforms for potential diagnostic application by using patients with undiagnosed intellectual disability (ID). The first and foremost goal of our application study was to use these arrays for reliable genome wide detection of rare CNVs in patients of three different cohorts: 1) patients with unexplained intellectual disability 2) patients with unknown diffuse congenital hyperinsulinism (CHI) and 3) a family with a distinctive diagnosis of Holt-Oram syndrome (HOS). We showed that SNP-based arrays allow the detection of intragenic deletions and duplications. The identification of a disease-CNV affecting only a single gene allowed us to consider that particular gene as a candidate for intellectual disability. This was the case for three unrelated patients with moderate intellectual disability, global developmental delay, and severe speech and language disorders in which a de novo deletion encompassing solely the FOXP1 gene was detected. To prove further the causality of the FOXP1 deletion following-up investigations were based on a screening of the entire coding region of FOXP1 for nucleotide changes in a panel of 883 probands with intellectual disability. Eight non-synonymous coding changes, three synonymous and nine non-coding variants were identified. In addition to the de novo cases of ID, also patients suffering from an autosomal recessive form of ID were found in our cohort. We detected three partial heterozygous deletions of the COH1 gene at locus 8q22 which is mutated in Cohen syndrome. After sequencing the entire coding region and the exon/intron boundaries of COH1 we identified a stop mutation, a frameshift and two missense mutations in the remaining allele, respectively. Therefore, three compound heterozygous mutations were identified in the COH1 gene, thus providing a distinctive Cohen Syndrome diagnose to three unrelated patients of our ID cohort. We studied the genetic basis of a rare human autosomal disorder such as diffuse Congenital Hyperinsulinsm (CHI) in a cohort of 40 patients with inconspicuous mutation screening of ABCC8 and KCNJ11 genes. Chromosomal abnormalities detected by SNP oligonucleotide arrays accounted for 20% of the studied cases. The most interesting rearrangement was a 970kb deletion at the chromosomal band 1p31.1 which was found to encompass the PTGER3 and ZRANB2 genes and the last exon of the NEGR1 gene. We hypothesized that the haploinsufficiency of PTGER3 gene induces a 50% reduction of the stimulation by PGE2, thus diminishing the inhibition of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) and resulting in elevated insulin secretion. The screening for point mutations in the candidate gene PTGER3 did not reveal any pathogenic variant neither in the second allele of the patient in which a de novo deletion was detected nor in a cohort of 39 unrelated patients with unexplained CHI. Instead we identified a novel polymorphic variant which was also detected in 18 individuals of our control cohort. CNV analysis in a family with both atypical Holt-Oram syndrome and additional mammary glands was performed allowing the detection of a contiguous heterozygous duplication at the chromosomal band 12q24.21. The maximal duplication size could be estimated as aproximately 345,6kb including the whole coding region of the TBX5 and TBX3 genes. Gene dosage assessment at specific genetic loci demonstrated the cosegregation of the duplication and the Holt-Oram syndrome/supernumerary mammary glands phenotype in this pedigree, this being a strong indicator of its pathogenecity. Up to date, this is the first report of a heterozygous duplication encompassing both TBX5 and TBX3 genes, and consequently the first report of a combined phenotype of Holt-Oram syndrome and supernumerary mammary glands.

La inestabilitat genòmica, característica intrínseca de la majoria de cèl·lules tumorals, es defineix com la capacitat que presenta una cèl·lula de generar alteracions genètiques a un ritme elevat, tenint com a conseqüència la generació d'una elevada heterogeneïtat cel·lular. Des de l'inici de l'estudi de la inestabilitat genòmica, el càncer colorectal ha esdevingut un estereotip del comportament de les cèl·lules tumorals. El càncer colorectal pot ser subdividit en dues formes diferents: els que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) i són majoritàriament diploides, i els caracteritzats per cariotips poliploides i amb inestabilitat cromosòmica (CIN). Una part important del treball ha estat basat en l'ús de línies cel·lulars de càncer de còlon humanes. Una de les línies més utilitzades com a model de CIN és la línia cel·lular SW480. L'aplicació de les tècniques M-FISH, la cenM-FISH i mMCB va permetre descriure el cariotip molecular amb alteracions que prèviament no havien estat identificades i definir els punts de trencament (Camps et al., 2004, Oncol Rep).Per estudiar la interrelació entre la inestabilitat de microsatèl·lits i la inestabilitat cromosòmica vam utilitzar les línies de càncer de còlon KM12 com a model cel·lular, concloent que ambdós subtipus d'inestabilitats podien coexistir en una mateixa cèl·lula (Camps et al., 2004, Int J Cancer). Aquest model també ens va servir per demostrar l'evolució cariotípica de les cèl·lules originàries del tumor de còlon i les poblacions altament metastàtiques a fetge, concloent que la tetraploïdia era un fenomen genotípic clau per explicar les condicions fenotípiques de la metàstasi.Mitjançant tècniques de citogenètica molecular vam quantificar la inestabilitat cromosòmica, tant la numèrica com l'estructural, de dues línies cel·lulars de càncer de còlon, la HCT-116 (amb MSI), i la SW480 (amb CIN). Per abordar la inestabilitat cromosòmica estructural, ens vam centrar en l'estudi de les reorganitzacions cromosòmiques no clonals per cada divisió cel·lular. Per altra banda, per l'estudi de la inestabilitat numèrica vam recórrer a l'obtenció de cèl·lules binucleades. Aquests experiments ens van donar una idea del dinamisme amb el qual les alteracions numèriques tenien lloc en la línia cel·lular SW480 i els seus subclons. Alhora, ens van permetre deduir quin era l'origen més freqüent de les aneuploïdies en aquestes cèl·lules, la no-disjunció o la pèrdua anafàsica. La línia cel·lular HCT-116, cromosòmicament estable, presentava unes taxes d'alteracions estructurals i d'aneuploïdia molt baixes. Els resultats d'aquest treball ens van permetre demostrar que la inestabilitat cromosòmica numèrica era invariable entre la línia cel·lular parental SW480 i els seus subclons, però per altra banda, la taxa d'inestabilitat cromosòmica estructural augmentava dràsticament quan es generaven els sublcons a partir d'una sola cèl·lula (Camps et al., 2005, FASEB J). Aquests resultats explicarien l'heterogeneïtat estructural que presenten les cèl·lules tumorals in vivo, possible origen de les diferents subpoblacions cel·lulars, i l'elevada taxa d'aneuploïdia.Finalment, vam utilitzar un total de trenta-un tumors de còlon per analitzar les diferències genòmiques i els patrones d'expressió entre tumors que presentaven inestabilitat de microsatèl·lits i tumors que no la presentaven. La utilització de la hibridació genòmica comparada convencional i sobre microxips de cDNA van permetre descriure alteracions genòmiques amb una gran precisió i identificar gens que podrien estar involucrats en la carcinogènesis colorectal (Camps et al., 2006, Carcinogenesis). Alguns dels gens proposats i associats per primera vegada amb el càncer de còlon són RASA1 y FER, y DPEP1, localitzats en les bandes citogenètiques 5q13q21 y 16q24.3, respectivament.

L'interès de l'estudi de la regulació dels gens de proteïnes de reserva de cereals prové del fet que són gens específics de llavor, amb una expressió lligada al desenvolupament del gra, i molts d'ells mostren una gran eficiència transcripcional. Els patrons d'expressió d'aquests gens suggereixen l'existència de complexes reguladors constituïts per diferents activadors transcripcionals que reconeixen els elements en cis- implicats en la seva expressió. Tot i els nombrosos estudis fets, els mecanismes moleculars implicats es coneixen poc. A blat de moro, el nostre model d'estudi, les proteïnes de reserva s'acumulen majoritàriament a l'endosperma i, en menor mesura, a l'embrió. A endosperma s'acumulen les zeïnes (les prolamines de blat de moro), mentre que a embrió trobem globulines i oleosines. Tant les zeïnes com les globulines s'acumulen en orgànuls derivats del reticle endoplasmàtic anomenats cossos proteics, mentre que les oleosines s'acumulen en cossos lipídics. L'interès del nostre grup se centra en el gen gamma-Z, que codifica per una proteïna de reserva d'endosperma, la gamma-zeïna. El gen gamma-Z està present en una o dues còpies per genoma haploide i, en canvi, el seu producte representa fins al 15% del contingut proteic del gra, suggerint una fina regulació gènica.L'objectiu general d'aquest treball era caracteritzar nous factors de transcripció implicats en la regulació de l'expressió del gen gamma-Z i altres factors reguladors de l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específics d'endosperma però també lligats al desenvolupament de la llavor.Els objectius concrets així com els resultats obtinguts es descriuen breument a continuació:1) Caracterització funcional del factor proteic PBF com a regulador positiu del gen gamma-Z. Identificació del domini activador de PBF. PBF és un activador transcripcional del promotor del gen gamma-Z i volíem caracteritzar el domini responsable d'aquesta funció mitjançant estudis d'activació per expressió transitòria en endospermes joves de blat de moro. Aquests estudis van revelar que el domini activador de PBF es localitza en el seu domini C-terminal, però que l'activitat d'aquest factor proteic depèn de la seva capacitat d'unió al DNA. 2) Recerca de nous factors de transcripció responsables de l'expressió del gen gamma-Z i implicats en el reconeixement de seqüències presents a la regió proximal del seu promotor: clonatge del gen GAMYB de blat de moro i estudis d'immunolocalització. Caracterització d'aquest factor com a regulador transcripcional del gen gamma-Z. El gen ZmGAMYB codifica per un factor de transcripció de tipus Myb R2R3, que s'uneix de forma específica a la caixa AACA del promotor del gen gamma-Z i que és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. ZmGAMYB s'expressa específicament a endosperma de blat de moro en desenvolupament, coincidint amb el patró d'expressió de PBF i concordant amb la possibilitat de que reguli l'expressió del gen de la gamma-zeïna. El factor mGAMYB s'acumula a les capes més superficials d'aquest teixit (aleurona i subaleurona).3) Recerca de nous factors de transcripció implicats en l'expressió de gens de proteïnes de reserva no específiques d'endosperma: clonatge del gen FUSCA3 de blat de moro, estudis d'immunolocalització a gra de blat de moro i posterior caracterització d'aquest factor.El gen ZmFUSCA3 codifica per un factor de transcripció de tipus B3 i s'expressa majoritàriament a embrió de blat de moro en desenvolupament. El factor mFUSCA3 s'acumula massivament a l'aleurona i a l'embrió, suggerint que sigui un regulador de l'acumulació de productes de reserva en aquests teixits. FUSCA3 és capaç d'unir-se a la caixa RY-like present a la regió proximal del promotor del gen gamma-Z, tot i que de forma poc específica, però no és capaç d'activar l'expressió d'aquest gen a partir del seu promotor. / In cereals, major seed storage proteins are called prolamins and accumulate primarily in the endosperm. Prolamin genes are tissue specific and show high efficiency levels, suggesting tight genetic regulation. In maize, our model specie, prolamins are accumulated in ER derived structures called protein bodies, whereas other storage proteins such as globulins or oleosins accumulate in the aleurone layer and in the embryo. The interest of our group resides in the gamma-zein, an endosperm specific storage protein, which constitutes the 15% of the proteic content of the grain, whereas its gen is present in only one or two copies per haploid genome. The object of the present work was to characterize new transcription factors implicated in seed storage gene expression linked to grain development, especially those involved in gamma-Z gene expression. Specific objectives as well as results achieved are briefly described bellow. 1) Functional characterization of PBF as a positive regulator of gamma-Z gen. PBF is a transcriptional activator of gamma-Z gene and its activation domain is located in the C-terminal region of the protein, but its activity depends on its binding to DNA.2) New transcription factors involved in gamma-Z gene expression: cloning of GAMYB gene in maize and immunolocazation assays. Characterization of this factor as a transcriptional regulator of gamma-Z gene.ZmGAMYB encodes a Myb R2R3 transcription factor that specifically binds to the AACA box of the gamma-Z gene promoter and activates gamma-zein expression from this promoter. ZmGAMYB is specifically expressed in maize developing endosperm, as other gamma-Z regulators do. The proteic factor accumulates in the more superficial layers of this tissue (aleurone and subaleurone).3) New transcription factors related to seed storage gene expression: cloning of FUSCA3 gene in maize, immunolocazation assays and characterization of this factor.ZmFUSCA3 encodes a B3 transcription factor highly expressed in maize developing embryo. The proteic factor accumulates massively in the aleurone layer as well as in the embryo, suggesting a regulatory role in seed storage products accumulation in these tissues. FUSCA3 binds RY-like motives of the gamma-Z gene promoter, with weak specificity, but does not activate expression from this promoter.

La expressió en plantes transgèniques representa una alternativa interessant per a la producció de proteïnes d'interès terapèutic. Els baixos costos de producció a gran escala, la capacitat de modificació postraduccional dels vegetals y la seguretat biològica del producte final son alguns del atractius d'aquest emergent sistema de producció.El T-20 es un nou fàrmac antiviral contra el VIH-1 que actua inhibint el procés d'entrada del virus dins la cèl·lula diana impedint que les membranes del virus i cèl·lula es fusionin. Actualment, la producció d'aquest pèptid de 36 aminoàcids es realitza per síntesis química en un procés extraordinàriament complex que condiciona el elevat preu del producte final.En aquest treball s'ha adoptat una estratègia per acumular el T-20 a plantes consistent en la seva expressió mitjançant una fusió amb diferents dominis rics en prolina de gamma-zeïna, proteïna de reserva de 27 kDa del blat de moro. Anteriors estudis han demostrat que aquests dominis tenen la capacitat de quedar retinguts dins el reticle endoplàsmic y induir la formació de cossos proteics en plantes transgèniques de tabac.S'ha utilitzat dos espècies vegetals, tabac i arròs, per tal de testar el nivell d'acumulació del T-20 en fusió en diferents teixits. En plantes de tabac s'ha escollit una expressió constitutiva mitjançant el promotor 35S per acumular a fulla el T-20 fusionat amb quatre seqüències riques en prolina diferents (Rx3, R3, P4 i X10), Els resultats han demostrat que, tant per transformació estable com transitòria, la fusió Rx3-T20, que conté tota la regió N-terminal de la gamma-zeïna, és la que s'acumula millor en fulles de tabac. A demés, en una línia transgènica s'ha comprovat que aquesta proteïna de fusió no només es estable enfront la dessecació de la fulla, sinó que la seva expressió s'activa durant aquest procés degut segurament al lloc d'inserció dins el genoma de la planta. També s'han obtingut línies transgèniques d'arròs per tal d'acumular el T-20 específicament a gra, beneficiant d'aquesta forma l'estabilitat y emmagatzemament del fàrmac. Després de comprovar que el promotor de la gamma-zeïna era actiu però no específic en plantes transgèniques d'arròs, es va optar per la utilització d'un promotor endogen, RP5, per tal d'expressar la proteïna de fusió Rx3-T20 específicament a gra d'arròs. Es van assolir alts nivells d'acumulació específica a gra, comparables amb els generats amb un promotor constitutiu 35S.Tant a tabac com a arròs es van portar a terme experiments de fraccionament subcel·lular mitjançant gradients de sacarosa que van mostrar que les proteïnes de fusió s'acumulaven en una fracció densa on sedimenten els cossos proteics de blat de moro. A demés, mitjançant inmunolocalització al microscopi confocal s'ha pogut visualitzar l'acumulació de la proteïna de fusió Rx3-T20 en fulles de tabac en unes estructures esfèriques compatibles amb cossos proteics. En arròs, la localització sota el microscopi electrònic ens ha demostrar l'acumulació d'aquesta proteïna dins els cossos proteics de tipus I naturals de l'arròs.Amb l'objectiu de demostrar que el sistema l'expressió en plantes permetia obtenir el fàrmac T-20 actiu es va desenvolupar un procés de purificació a partir de fulles de tabac consistent en una precipitació amb sulfat d'amoni, cromatografia de bescanvi aniònic, digestió amb proteasa y purificació per HPLC. Es va demostrar que el producte final corresponia per espectrometria de masses al T-20 y que, mitjançant experiments en cultiu cel·lular, presentava la mateixa activitat antiviral que el T-20 produït per síntesis química. D'aquesta manera es conclou que l'expressió en plantes transgèniques representa un sistema de producció de T-20 alternatiu a la síntesis química. / "PRODUCTION OF A HIV-1 FUSION INHIBITOR IN TOBACCO AND RICE PLANTS": Plants provide convenient systems for the production of valuable recombinant proteins. Compared with the traditional production systems (i.e. microbial fermentation and mammalian cell cultures), plants have advantages in terms of cost, scalability and safety. Plants can be grown on an agricultural scale reducing the production costs of the recombinant protein and have similar post-translational pathways to animal. This make plants an interesting system for the heterologous production of human therapeutic proteins (Fischer, 1998). In this work we present the efficient production of the HIV-1 fusion inhibitor T20 in tobacco and rice transgenic plants.T20, a 36 amino acids peptide homologous to HR2 region of HIV-1 gp41 envelop protein, belongs to a new class of anti-HIV drugs known as fusion inhibitors (Wild et al., 1993). It has been proposed that T20 inhibits HIV-1 cell entry in T-cell lines by blocking conformational changes of gp41 (Chan et al., 1998, Liu et al., 2005) (fig.1). T20 was licensed on May 2003 by the FDA for the treatment of HIV-infected individuals.It is known that endoplasmic reticulum (ER) retention of recombinant proteins improves their accumulation and stability. Our approach to accumulate high levels of T20 in transgenic plants is based on the ability of proline-rich domains of γ-zein to self-assemble conferring stability to fusion proteins in the ER. γ-Zein is a maize storage protein that naturally accumulates in ER-derived protein bodies (PB) in endosperm cells. Previous studies demonstrated the ability of N-terminal γ-zein region to induce formation of PB in a heterologous plant system (Geli et al, 1994). Four chimeric genes were constructed coding for praline-rich-domains fused to the T20 sequence.We were interested to test the production of T20 fused to ZERATM domains in two different plant systems: tobacco and rice. The expression of the recombinant protein in tobacco provides large amounts of non-food biomass, whereas the expression in crop seeds using a specific promoter permits large storage periods.

La estructura molecular de diversos componentes celulares contiene, entre otros elementos, nitrógeno. La fuente de nitrógeno preferida por las bacterias y la mayoría de microorganismos es el amonio, el cual no siempre se encuentra disponible en el medio. Por ello, las bacterias han desarrollado mecanismos moleculares que les permiten obtener nitrógeno de fuentes alternativas como pueden ser las purinas. Este trabajo se centra en el metabolismo de las purinas como fuentes de nitrógeno en la enterobacteria Klebsiella pneumoniae. En este trabajo hemos identificado y caracterizado el sistema génico de K. Pneumoniae implicado en la asimilación de hipoxantina como fuente de nitrógeno, al cual hemos denominado hpx. El sistema hpx está formado por cuatro unidades transcripcionales. Las unidades hpxDE, hpxR y hpxO se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad (sigma-70) 70 de la RNA polimerasa, mientras que 9hpxPQT presenta un promotor dependiente de (sigma-54) 54. El operón hpxDE está implicado en la oxidación de hipoxantina a ácido úrico. Sin embargo, los productos de los genes hpxD y hpxE no se asemejan a las xantina deshidrogenasas descritas hasta el presente. En base a la similitud de HpxD y HpxE con distintos componentes de la familia de las dioxigenasas, proponemos que el operón hpxDEcodifica una dioxigenasa formada por una oxidorreductasa (HpxE) y una oxigenasa (HpxD). El producto génico del gen hpxO está implicado en la oxidación de ácido úrico a alantoína. Sin embargo, dicha proteína no presenta similitud a uricasas sino a monooxigenasas de compuestos aromáticos dependientes de FAD. Proponemos que HpxO es una FAD-monooxigenasa que catalizaría la oxidación de ácido úrico al intermediario 5-hidroxiisourato, el cual sería transformado a alantoína por la acción secuencial de las proteínas HpxT y HpxQ. El gen hpxP codifica un transportador de purinas cuyo sustrato muy probablemente es ácido úrico. El gen hpxR codifica una proteína de la familia de reguladores LysR que actúa como represor de su propia transcripción y como activador del operón hpxDE El sistema hpx está sometido a una doble regulación, la llevada a cabo por el sistema global del nitrógeno y la llevada a cabo por la regulación específica de la vía. Mientras que el gen hpxR se expresa de manera constitutiva y el gen hpxO no está fuertemente regulado, los operones hpxDE y hpxPQT son inducidos tanto por limitación de nitrógeno como por la presencia de los inductores hipoxantina (hpxDE) o ácido úrico (hpxPQT). La regulación por nitrógeno del operón hpxPQT tiene lugar a través del sistema NTR de K. Pneumoniae, el cual se activa en condiciones de nitrógeno limitantes. El promotor PhpxP depende de la subunidad (sigma-54) 54 de la RNA polimerasa y es reconocido por el activador NtrC (NiTrogen Regulatory protein C). El regulador que reconoce el ácido úrico como molécula inductora todavía no ha sido identificado. Es de destacar que la regulación por nitrógeno del operón hpxDE no tiene lugar a través del sistema NTR. Resultados preliminares sugieren la existencia de un regulador no caracterizado hasta el presente al que proponemos denominar NR (Nitrogen Repressor). Este regulador reprimiría la expresión del operón hpxDE en condiciones de exceso de nitrógeno. Esta es la primera vez que se describe en K. Pneumoniae un sistema de regulación por nitrógeno distinto de NTR, hecho que evidencia la importancia del estudio del sistema génico hpx en esta enterobacteria. La regulación específica está llevada a cabo por el regulador HpxR, el cual reconoce a la hipoxantina como molécula inductora del operón hpxDE. / Gene organization and regulation of the genetic system hpx involved in utilization of hypoxanthine as nitrogen source in Klebsiella pneumoniae"Purines play a key role in nucleic acid and nucleotide metabolism of all cells. In addition, they can be used as nitrogen sources by many microorganisms when ammonium, the preferred nitrogen source, is limiting. Purine catabolism in enterobacteria has been poorly characterized at the genetic level. In this study we identify and characterize the gene cluster (named hpx)responsible for the oxidation of hypoxanthine to allantoin in K. pneumoniae. This genetic system is essential fot the aerobic assimilation of hypoxanthine as nitrogen source under nitrogen limiting conditions.This system is composed by four transcriptional units: hpxDE, hpxR, hpxO and hpxPQT. hpxP gene encodes a purine transporter. The hpxDE operon encodes subunits of the enzyme that catalyzes the oxidation of hypoxanthine to uric acid. The structure of this enzyme is more related to class IB dioxygenases than to xanthine dehydrogenases. Genes hpxO, hpxQ and hpxT are involved in the oxidation of uric acid to allantoin. The hpxO gene product seems to be more related to FAD containing monooxygenases than to uricases. Finally, hpxR encodes a LysR-type regulator that activates hpxDE expression and represses its own gene.Metabolism of hypoxanthine as nitrogen source is regulated by nitrogen conditions and by purines. hpxDE and hpxPQT operons are the units regulated at both levels. Transcription of hpxPQT operon is induced under nitrogen starvation and by uric acid through a regulatory protein other than HpxR. Nitrogen control of this unit is mediated by the NTR system.Expression of hpxDE operon is induced under nitrogen limiting conditions, independently fromthe NTR system, and by hypoxanthine through HpxR.

La terapia génica nació a principios de los años 90 como una estrategia para la sustitución de genes defectuosos en determinadas células o tejidos en el ámbito de las enfermedades hereditarias, aunque desde entonces se han desarrollado múltiples estrategias para tratar enfermedades adquiridas, que incluyen diferentes tipos de cáncer o enfermedades autoinmunes como la esclerosis múltiple (EM). La EM es una enfermedad crónica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), mediada por células T CD4+, que produce parálisis y discapacidad. La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo animal de la EM, con la que comparte múltiples características clínicas e histopatológicas.La creación de quimerismos moleculares mediante la expresión de transgenes en el sistema hematopoyético se ha asociado a la tolerización por parte del sistema inmune frente a estos transgenes. En este trabajo proponemos expresar un autoantígeno candidato de la EM (el péptido 40-55 de la glicoproteína mielínica de los oligodendrocitos) en el sistema hematopoyético murino con la finalidad de inducir tolerancia frente a éste.Utilizando procedimientos lo más cercanos posible a la clínica humana, hemos comprobado que la creación de quimerismo molecular utilizando el autoantígeno previene muy eficazmente la enfermedad, mientras que en animales con EAE establecida, la transferencia de células hematopoyéticas expresando el autoantígeno mejora significactivamente la enfermedad, si bien en este caso observamos que no se producía quimerismo molecular estable ya que las celulas infundidas que expresaban el autoantígeno eran rechazadas, probablemente debido a la inmunización previa.Esto nos indujo a hipotetizar que la mieloablación no es necesaria y que el efecto terapéutico no era debido a células con capacidad de repoblación sino a células mieloides que expresan el autoantígeno y que tendrían capacidad tolerogénica in vivo.Así, comprobamos experimentalmente que el beneficio terapéutico se producía también en ratones con EAE no sometidos a mieloablación alguna, lo que permitiría obviar por completo el uso de tratamientos de acondicionamiento y haría más factible la aplicabilidad clínica de este tipo de estrategia terapéutica.Para investigar los mecanismos por los cuales se induce tolerancia específica en este modelo, se estudió el patrón de citocinas de los ratones tratados terapéuticamente. Se hallaron niveles más elevados de IL-10 e IL-5 en los cultivos deesplenocitos de los ratones tratados con el autoantígeno, dos citocinas que, entre otras, son secretadas por células T reguladoras de tipo 1 (Tr1). Estos resultados nos sugieren una posible implicación de este tipo celular en la inducción de tolerancia conseguida en este modelo.Además, a raíz de estos experimentos hemos descubierto que el nivel de expresión de un transgén potencialmente inmunogénico (EGFP) en el contexto del trasplante hematopoyético en ratones sometidos a mieloablación parcial encondiciones parcialmente mieloablativas pero en ausencia de inmunosupresion, puede ser determinante en la induccion de una respuesta inmune frente a las células transducidas. También hemos demostrado que la respuesta celular in vitro frente a células transducidas es igualmente dependiente del nivel de expresión del transgén. / Hematopoietic gene therapy is a promising strategy to treat hereditary diseases. In addition, many strategies have been developed to induce tolerance in autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS). MS is a chronic, inflamatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS) mediated mainly by CD4+T cells, that produces discapacity and paralysis. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model for MS, shares clinical and histopathological features with the human disease.Molecular chimerism using hematopoietic cells expressing transgenes is usually associated with tolerance induction to transgene products. In this work we hypothesized that the expression of a candidate autoantigen (the MOG40-55 peptide) inthe murine hematopoietic system would induce specific tolerance in the EAE model.We found that EAE was strongly prevented when molecular chimerism was established prior to EAE induction. On the other hand, when EAE was already established, the transfer of BMC expressing the autoantigen ameliorated EAE clinical outcome and the CNS histopathological lesions. In this therapeutic approach, molecular chimerism was not detected, probably because cells expressing the MOG40-55 peptide were rejected due to the pre-established immune response to this antigen.These results suggested that myeloablation was not necessary to induce specific tolerance. Indeed, clinical amelioration was also observed in mice with EAE infused with BMC expressing the MOG peptide in the absence of any conditioning treatment.This approach is more feasible for human clinical application, it circumvents the risks ofmyeloablation and those of insertional mutagenesis since the transduced cells do not survive in vivo.Regarding the potential mechanisms involved, we analyzed the cytokine pattern upon antigen exposure in the treated mice. Higher levels of IL-10 and IL-5 were found in mice treated with bone marrow cells expressing the autoantigen. Both cytokines are secreted by many cell types, including type 1 regulatory T cells (Tr1). These results suggest a role of transduced cells inducing Tr1 cells in vivo as a potential mechanism of tolerance induction in our model.In the second part of this work we demonstrated that the level of expression of a potentially immunogenic transgene such as EGFP in the context of bone marow transplantation into partially myeloablated mice in the absence of immnuosupression is determinant to induce immune responses towards the transduced cells.