DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

Fins el present treball es creia que el sistema glc estava implicat únicament en la capacitat de creixement a expenses de glicolat com a font externa de carboni i energia. S'ha pogut comprovar, però, que aquest juga un paper molt important en el control de la concentració del metabolit intermediari glioxilat. En el locus glc, situat al minut 64.5 del cromosoma d'Escherichia coli, s'han localitzat i seqüenciat un total de sis gens. Entre ells es troben els que codifiquen les subunitats de la glicolat oxidasa (glcD, glcE, glcF), l'activador transcripcional dels gens estructurals del sistema (glcC), una proteïna de funció encara per determinar (glcG) i el possible gen del transport del glicolat (glcT).La glicolat oxidasa (enzim localitzat a la membrana citoplasmàtica que catalitza l'oxidació de glicolat per formar glioxilat) ha resultat ser un enzim heteroligomèric, format per tres subunitats catalítiques: dues subunitats (els productes gènics de glcD i glcE) semblen formar el nucli catalític de l'enzim, mentre que la tercera (producte gènic de glcF) sembla ser una subunitat ferrosulfürada a la qual es transfereixen els electrons provinents de l'oxidació de glicolat a glioxilat. La possible implicació del producte gènic de glcG en l'anclatge de les subunitats catalítiques a k membrana citoplasmàtica i el paper del producte gènic de glcT en el transport de glicolat i altres molècules estructuralment relacionades no han pogut ser definitivament determinades.Els gens del locus glc estan organitzats en una unitat transcripcional que engloba tots els gens estructurals (glcDEFGBT) i que es troba sota el control del producte gènic de glc (GlcC), que es transcriu divergentment als gens estructurals i comparteix amb ells zona promotora. Els gens estructurals del locus glc tenen una estructura gènica d'opero: existeix un únic promotor funcional situat en posició 5' del gen glcD que regula l'expressió simultània de tots ells (glcDEFGBT). L'expressió dels gens estructurals és totalment dependent del regulador específic del sistema, GlcC, que és una proteïna amb funció dual: és activador transcripcional de glcDEFGBT i repressor de glcC.L'expressió del promotor de glcDEFGBT és induïble per diferents fonts de carboni, principalment glicolat i en menor grau glioxilat (per se o per la formació intracel.lular de glicolat en una reacció de reducció catalitzada per l'enzim constitutiu glioxilat reductasa). Altres molècules estructuralment relacionades amb el glicolat (p.e. D-lactat, glicerat, acetat) són capaces d'induir l'expressió de l'operó glc. En creixements en glucosa l'operó glc està reprimit, tot i que la seva expressió no és nul.la. La repressió exercida en creixements en glucosa no és reversible per l'addició d'AMP cíclic (cAMP) al medi de cultiu, indicant que aquesta no està mediada pel complex CRP-cAMP (Catabolite Repressor Protein).S'ha demostrat que existeixen diferents factors de transcripció globals que regulen l'expressió dels gens estructurals del sistema glc. D'una banda, s'ha pogut comprovar que l'expressió de glcDEFGBT és totalment dependent del factor de transcripció IHF (Integration Host Factor). Tant experiments in vivo com in vitro han mostrat la completa dependència en IHF per la formació del correcte complexe nucleoproteic capaç d'iniciar la transcripció, i l'anàlisi in silico de la seqüència del promotor ha permès identificar possibles seqüències consens d'unió d'IHF. D'altra banda, s'ha demostrat que la repressió anaeròbica del locus glc està mediada a nivell transcripcional pel sistema de dos components ArcB/ArcA. En el promotor de glcDEFGBT s'han pogut localitzar les seqüències consens d'unió del regulador transcripcional ArcA. En relació a l'estudi de la unió d'ArcA als seus promotors diana, s'han dut a terme experiments de mutagènesi dirigida de la seqüència consens per ArcA del promotor d'un altre gen relacionat amb el sistema glc: el gen aldA. El promotor d'aquest gen mostra una seqüència conservada 10/10 respecte al consens per ArcA. S'ha pogut demostrar, tant in vivo com in Vitro, la validesa d'aquest consens, que havia estat proposat i establert anteriorment en base a estudis in vitro de diferents sistemes diana d'ArcA.Existeix una inducció creuada entre els sistemes glc i ace (que codifica els enzims del cicle del glioxilat, entre ells la malat sintasa A, isoenzim de malat sintasa G, necessaris pel creixement d'Escherichia coli en acetat). Sobre tots dos sistemes, els factors IHF i ArcA exerceixen una regukció del mateix signe. El sistema glc està induït en creixements en acetat i s'ha comprovat per l'anàlisi de mutants dels dos sistemes que cadascuna de les dues malat sintases pot suplir la funció de l'altra.El fet que els enzims glicolat oxidasa i malat sintasa G es sintetitzin conjuntament, l'observació que la seva expressió mai no és completament nul·la i que mutants glicokt oxidasa (que són incapaços de transformar glicolat en glioxilat) sobreexpressen el sistema, pot respondre a un mecanisme de seguretat enfront k toxicitat del glioxilat. Quan es sintetitza glicolat oxidasa es sintetitza malat sintasa G, la qual cosa assegura l'eliminació de I'aldehid tòxic per formació de malat. El glioxilat es forma a nivell intracel.lular per oxidació de glicolat, degradació de purines, creixements en acetat i en hidrolitzat de caseina. Aquest serà ràpidament metabolitzat per acció de la glioxilat reductasa, dels enzims de la via del D-glicerat, per la malat sintasa G i per la malat sintasa A. Per tant, la importància del sistema glc va més enllà de la capacitat de creixement en presència de glicolat i es situa a nivell de les modulacions en les concentracions de l'intermediari metabòlic glioxilat, ja que codifica enzims que intervenen en la seva formación (glicolat oxidasa) i en el seu metabolisme (malat sintasa G).

Els gens estan sotmesos a forces selectives diferents. Un dels objectius de la Biologia Evolutiva és entendre els factors que determinen aquestes diferències. Els gens rarament actuen de manera aïllada, sinó que normalment funcionen com a elements de xarxes complexes formades per un gran nombre de molècules que interactuen entre si. Tot i la rellevància d’aquestes xarxes per entendre l’evolució dels gens, les propietats evolutives d’aquestes xarxes són encara poc conegudes. En aquesta tesi hem estudiat les forces selectives (selecció positiva i negativa) que han actuat sobre els gens implicats en la via de la insulina/TOR, i hem relacionat aquestes forces amb la posició dels gens a la via. Aquest estudi s’ha realitzat en 12 espècies del gènere Drosophila (primer article de la tesi), i en 6 espècies de vertebrats (humà, ratolí, vaca, opòssum, ornitorinc i pollastre) (segon article). A aquests efectes, s’han identificat i anotat els gens implicats a la via en totes les espècies estudiades, s’ha reconstruït la seva història evolutiva mitjançant tècniques d’anàlisi filogenètica, i s’han caracteritzat les forces evolutives que hi han actuat a partir de la relació la divergència no sinònima (dN) i sinònima (dS), ω = dN/dS. Totes les famílies gèniques estudiades tenen almenys un representant a totes les espècies estudiades. A més, tots els gens estudiats estan sotmesos a selecció purificadora, la qual cosa indica que aquests gens són funcionals. Per tant, tots els organismes estudiats presenten una via de la insulina/TOR completa i funcional. Tant a Drosophila com a vertebrats, observem que el nivell de limitació funcional (o selecció purificadora) sota el que evolucionen els gens es correlaciona amb la posició dels gens a la via (mesurada com el nombre de passos des del receptor de la insulina –posició 0– fins la resta de components –posicions 1 a 10), essent els gens de la part downstream els que evolucionen sota un major grau de limitació funcional. El sentit d’aquesta correlació és contrari al que s’ha trobat generalment en rutes metabòliques, on són els gens de la part upstream es que estan sotmesos a un major grau de limitació funcional. Vam avaluar l’impacte d’una sèrie de factors que es correlacionen amb ω (selecció positiva, nivell d’expressió gènica, nombre de teixits en què un gen s’expressa, grau d’esbiaix en l’ús de codons, longitud de les proteïnes codificades, i connectivitat en la xarxa d’interaccions proteïna-proteïna) sobre aquesta correlació. Aquesta anàlisi demostra que la correlació entre la posició a la via i els graus de limitació funcional és independent d’aquests factors. A més, observem que els gens que codifiquen proteïnes que interactuen físicament evolucionen sota seleccions selectives semblants, la qual cosa indica que aquestes proteïnes co-evolucionen. En global, aquests resultats indiquen clarament que els nivells de limitació funcional als què estan sotmesos els gens de la via de la insulina/TOR depenen de la posició que les proteïnes codificades ocupen a la via. Per tant, l’arquitectura de la via té un impacte sobre l’evolució dels seus gens. / Genes are subject to disparate evolutionary forces. One of the goals in Evolutionary Biology is to understand the factors underlying these differences. Genes rarely act in isolation, but they rather operate as elements of complex networks of interacting molecules. Despite the relevance of these networks for understanding gene evolution, the evolutionary properties of these networks remain poorly understood. In this thesis we have studied evolutionary forces (positive and negative selection) that acted on genes involved in the insulin/TOR pathway, and we have related these forces to the position that genes occupy in the pathway. This study has been performed in 12 species of the genus Drosophila, and in 6 vertebrate species. For that purpose, we have (1) identified and annotated the genes involved in this pathway in these species; (2) reconstructed their evolutionary history using phylogenetic analysis; and (3) characterized evolutionary forces that have acted on these genes from the nonsynonymous (dN) to synonymous (dS) divergence ratio (ω = dN/dS). All the studied gene families have at least one representative in all studied species. Furthermore, all studied genes evolve under purifying selection, indicating that they are functional. Therefore, all studied organisms have a complete and functional insulin/TOR pathway. In both Drosophila and vertebrates, we observed that the strength of purifying selection acting on genes correlates with their positions in the pathway, with downstream genes evolving under stronger selective constraint. We evaluated the impact of a number of factors (positive selection, gene expression level and breadth, codon bias, protein length, and connectivity in the protein-protein interaction network) on the observed correlation. This analysis shows that the correlation between pathway position and the strength of purifying selection is independent of these factors. Furthermore, we observed that genes encoding proteins that physically interact evolve under similar selective pressures, which indicates that these proteins co-evolve. Taken together, these results clearly indicate that levels of selective constraint acting on genes of the insulin/TOR pathway are affected by the position that their encoded products occupy in the pathway. Therefore, the structure of the pathway has an effect on the patterns of molecular evolution of its components.

Els dos principals objectius d'aquesta tesis són: (1) la realització d'un estudi global, (2) anàlisi i caracterització d'alteracions recurrents, en els canvis de metilació genòmica associats al càncer de còlon. Amb la finalitat d'assolir aquests objectius, vàrem desenvolupar una nova tècnica d'anàlisi dels canvis de metilació. Amplification of InterMethylated Sites (AIMS). A partir de la descripció d'aquesta tècnica, la tesis consta de dos grups de resultats, obtinguts a partir de la mateixa tècnica AIMS, i clarament diferenciats. Un primer bloc de resultats on realitzem dos estudis globals (objectiu número 1), i un segon bloc format per dos estudis específics (objectiu número 2) . En el primer treball global es va analitzar la contribució dels guanys i les pèrdues de la metilació genòmica en el procés tumoral. La principal conclusió d'aquest treball va ser el paper independent que juguen els dos tipus de canvi, tant a nivell de característiques tumorals (fisiològiques i genètiques), com de valor pronòstic i contribució al llarg de la progressió tumoral. En el segon estudi global, ens vàrem centrar més amb les pèrdues de metilació genòmica. En aquest, mostrem l'estreta associació entre aquestes pèrdues amb el grau de dany genòmic i mal pronòstic. El segon bloc de resultats ve constituït per els estudis específics. En un primer treball, descrivim el silenciament epigenètic del gen sintasa de prostaciclines (PTGIS). Aquest silenciament, es dona en una freqüència elevada de tumors i presenta una associació estadísticament significativa amb el grau d'aneuploidia del tumor. Finalment, un segon treball específic on mostrem el silenciament epigenètic de tota una banda citogenètica, concretament 2q14.2. En aquest silenciament no tant sols s'hi troba implicada la metilació genòmica, sinó que també descrivim un efecte general de silenciament a través de la modificació post-transcripcional de les histones. / The main focus of this thesis is to better understand the role of genomic methylation changes in colorectal cancer. We approached it at two different levels: (1) global assessment and (2) analysis of specific recurrent changes. A new technique called Amplification of InterMethylated Sites (AIMS) was developed to obtain information at both levels. At global level we report the relative contribution of losses and gains of DNA methylation on the tumour progression. DNA methylation signatures associate with different tumour features, including physiological, genetic and clinical characteristics. Furthermore, we demonstrate that global genomic demethylation correlates with cumulated genomic damage and poor prognosis. At specific level we show the epigenetic silencing of the prostacyclin synthase gene (PTGIS) in 43% of colorectal cancers. PTGIS inactivation is associated with the aneuploid status of the tumour, suggesting a possible role of this gene in the maintenance of the genomic integrity. Finally, we have detected a new type of epigenetic alteration affecting a large proportion of colorectal cancers. It consists in a long range epigenetic silencing due DNA methylation and Histone modification changes and affects an entire cytogenetic band (2q14.2). All the genes and transcripts present in this region showed downregulation independently of the promoter methylation status suggesting that the regional condition prevails over the local status.

Se ha estudiado la evolución molecular de los genes del sistema olfatorio OS-E y OS-F en especies del subgénero Sophophora de Drosophila, concretamente en especies de los grupos melanogaster y obscura. Los genes OS (olfactory-specific) codifican para proteínas de la familia de las OBPs (Odorant Binding Proteins), proteínas de unión a odorantes (i/o feromonas), que debido a su función en el sistema de reconocimiento del medio externo podrían, a priori, haber sufrido cambios de tipo adaptativo. El objetivo ha sido estudiar el posible impacto de la selección natural positiva en la evolución de estos genes en Drosophila. Los resultados se han descrito en cuatro artículos:En el primer artículo se describe el análisis de la variabilidad nucleotídica en una región de unas 7kb que incluye los genes OS-E y OS-F en cuatro especies del subgrupo melanogaster de Drosophila, Drososphila melanogaster, D. simulans, D. mauritiana y D. erecta, así como en una población natural de Drosophila melanogaster. Los resultados indican que los genes OS-E y OS-F están presentes en las cuatro especies investigadas y mantienen su estructura génica. Las estimas de polimorfismo y divergencia nucleotídica soportan la hipótesis de que ambos genes son funcionales, aunque presentan diferencias en su tasa evolutiva y en su constricción funcional. Algunas de las observaciones no son compatibles con el modelo neutro.En el segundo artículo se describe la caracterización, secuenciación y análisis de la variabilidad nucleotídica de la región genómica que incluye los genes del sistema olfativo OS-E y OS-F en una población europea y en otra africana de la especie D. simulans. Las estimas de variación silenciosa y de la tasa de recombinación son mayores en D. simulans. que en D. melanogaster. Además, la población europea de D. simulans. presenta una estructura haplotípica inusual, donde la mitad de las secuencias son prácticamente idénticas (difiriendo en tan sólo una sustitución nucleotídica). Esta estructuración es incompatible con las predicciones de la teoría neutralista para poblaciones en equilibrio estacionario. En el tercer artículo se investiga la variación nucleotídica de la región que incluye los genes OS-E y OS-F en dos ordenaciones cromosómicas (O[3+4] y O3+4+23), presentes en dos poblaciones naturales de Drosophila subobscura. El análisis de los niveles y patrón del polimorfismo de DNA son consistentes con un origen monofilético de la inversiones. A pesar de que las dos ordenaciones cromosómicas están fuertemente diferenciadas, existen evidencias de que ha habido flujo genético entre las mismas, probablemente provocado por eventos de conversión génica. Los tests basados en la distribución de las frecuencias de las mutaciones indican que las ordenaciones cromosómicas no se encuentran en equilibrio. Bajo una hipótesis de expansión, se ha estimado que la inversión O23 se originó hace unos 0.25 millones de años.En el último artículo se analiza la evolución molecular de las secuencias codificadoras de los genes OS-E y OS-F en 14 especies del subgénero Sophophora de Drosophila. El trabajo se ha realizado combinando análisis por máxima verosimilitud de la variabilidad sinónima y no sinónima (mediante el uso de modelos evolutivos de codones), con la información de la putativa estructura tridimensional de la proteína. Se ha estimado que la duplicación que originó los dos genes pudo ocurrir hace unos 43-94 millones de años. Los resultados indican que a pesar de que ambos genes presentan una gran y similar constricción funcional, el gen OS-E presenta una tasa evolutiva global significativamente más alta. Los resultados de este capítulo, así como del trabajo en general, sugieren que la selección natural positiva actuó sobre posiciones concretas de la zona codificadora de estos dos genes, y pudo tener un papel importante en la preservación de los dos genes duplicados en el genoma. / We have studied the molecular evolution (at intraspecific and interspecific levels) of two members of the OBP (Odorant Binding Protein) gene family (the OS-E and OS-F genes) in different Drosophila species. These genes likely originated by an old gene duplication event, still maintaining a high conservation at the gene structure, amino acid, and nucleotide levels. In this study, we detected significant differences in the evolutionary rate and functional constraint between the two genes. The results are unlikely for a neutral evolving region. We also found that levels of silent variation and recombination rates are significantly higher in "Drosophila simulans" than in "D. Melanogaster". Additionally, we detected that the European population of "D. Simulans" is highly structured, with a very unusual haplotype configuration that deviates significantly from the neutral expectations.In "D. Subobscura" this region maps on the O chromosome. In particular, the OS-region is located close to one of the breakpoints of the inversion O23. The analysis of the patterns of nucleotide variation at the OS-E and OS-F genes in "D. Subobscura" in two different chromosomal inversions showed that nucleotide variation is not at the steady-state equilibrium, but reflects the expansion process caused by the increase in frequency of the inversion. Finally, we analyzed nucleotide variation at the OS-E and OS-F genes in a number of Drosophila species to understand the evolutionary forces underlying their molecular evolution in this genus. We applied random and fixed-effects models, integrating information of DNA polymorphism, amino acid and nucleotide-based divergence, and 3D structure data to determine the selective constraint levels, and the putative role of positive selection in the evolutionary history of these genes, and especially in the maintenance of these duplicated gene copies. The results of these analyses allows concluding that positive selection is likely involved in the evolution of these genes in Drosophila.

La trombofilia és la tendència genètica al tromboembolisme venós. Amb la finalitat d'aprofundir en les bases genètiques de la trombofília hereditària, l'objectiu principal d'aquesta tesi és la identificació dels factors genètics que determinen la variabilitat dels nivells de FVII a la població espanyola. En primer lloc, es va calcular l'heretabilitat dels nivells de FVII en un 53%, i mitjançant una anàlisi global del genoma es va localitzar el gen responsable de la variabilitat dels nivells de FVII en la zona 13q, just on es localitza el gen estructural del FVII (F7). Aquest resultat indica que els factors genètics que determinen la variabilitat de FVII en plasma es troben en el gen estructural. A continuació es va realitzar una anàlisi genètica exhaustiva i es van obtenir 49 posicions polimòrfiques al llarg del gen (F7), la majoria canvis d'una sola base (SNPs). A més, mitjançant una anàlisi de l'organització haplotípica de la variació en la seqüència del (F7), es va observar que existeixen tres clars llinatges d'haplotips que s'han mantingut paral·lelament en la població espanyola per selecció estabilitzadora, molt probablement per un avantatge dels individus heterozigots. L'anàlisi d'associació entre aquests llinatges i els nivells de FVII indica que un d'ells, caracteritzat pels al·lels [-670C, -630G, -402A] està associat a nivells elevats en la població, i un altre, caracteritzat pels al·lels [-2989A, -401T, -323ins10, -122C] està associat a nivells reduïts.Les anàlisis posteriors de transfecció in vitro amb els diferents al·lels utilitzant un sistema reporter GFP (Green Fluorescent Protein) van permetre determinar que les variants -323ins10 i -122C tenen un efecte reductor sobre els nivells de proteïna, i que la variant -402A provoca un augment significatiu dels nivells de FVII. Finalment, la nova variant -2989A incrementa també de forma molt significativa els nivells d'expressió. Aquests resultats es confirmen a més en un estudi cas-control amb pacients amb trombosi venosa profunda, així com en dues famílies amb deficiència de FVII. El disseny, l'estratègia i la metodologia emprades són un bon exemple de com localitzar i identificar loci implicats en caràcters complexes. / There is a definite genetic predisposition to venous thromboembolism. The levels of FVII in plasma has been clearly implicated in thrombophilia. The aim of this thesis was to identify and characterize the genetic factors that determine the variability of FVII plasma levels in the Spanish population. First, the heritability of FVII levels was calculated as 53%indicating a substantial genetic component. A Genome Wide Scan allowed the localization of the responsible gene on the long arm of chromosome 13, exactly where the FVII "(F7)" structural gene has been located. This indicates that the genetic factors that determine FVII variability are localized in the structural gene.Second, from an exhaustive genetic analysis, we obtained 49 polymorphisms (variants) in the "F7" gene. Further, by an analysis of sequence variations and haplotype organization, three main haplotype lineages were detected that have been maintained presumably by balanced selection, probably due to an advantage of heterozygous individuals. The association analysis among these lineages and the FVII levels indicates that one of these lineages, containing allelic variants [-670C, -630G, -402A] was associated with elevated FVII levels. Also, another lineage, containing allelic variants [-2989A, -401T, -323ins10, -122C] was associated with reduced levels of FVII. Posterior functional analyses of "in vitro" transfection of the different variants in a "reporter" system with GFP "(Green Fluorescent Protein)" showed that allelic variants -323ins10 i -122C significantly reduce expression levels while allelic variant -402A significantly increases them. The new allelic variant -2989A also increases expression levels significantly. Finally, these results have been confirmed in a case-control study with patients with deep venous thrombosis and in a study of two families with a FVII deficiency. The strategy and methodology of the present work are good examples of how to localize and identify genes implicated in complex human diseases.

INTRODUCCIÓN. La leucemia mieloide aguda (LMA) es una enfermedad heterogénea desde el punto de vista clínico y biológico. En los últimos años se vienen reconociendo diversas alteraciones moleculares que definen entidades específicas. En este contexto, la LMA con translocación t(8;16)(p11;p13) y reordenamiento MYST3 (MOZ)/CREBBP (CBP) es una variedad infrecuente mal caracterizada desde el punto de vista biológico. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS. La proteína quimérica MYST3-CREBBP, resultante de la translocación t(8;16)(p11;p13), podría conferir a este subtipo de LMA una individualidad biológica propia, con rasgos diferenciados respecto al resto de leucemias. Para confirmar esta hipótesis general los objetivos de la presente tesis doctoral fueron: 1) diseñar una técnica de PCR para el diagnóstico rápido y específico del reordenamiento MYST3-CREBBP; 2) caracterizar el punto de ruptura de los genes implicados en la translocación en una serie de pacientes y 3) estudiar el perfil de expresión génica de las LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP y compararlo con el de otros subtipos bien definidos de LMA.PACIENTES Y MÉTODOS. Se estudió una serie de pacientes con LMA y reordenamiento MYST3-CREBBP (n=7) y se compararon sus características biológicas con otros casos de LMA. Para ello se diseñó una técnica de PCR nueva para la detección del reordenamiento MYST3-CREBBP, mientras que los puntos de ruptura de los genes implicados en la translocación se estudiaron mediante secuenciación directa. El estudio del perfil de expresión génica de la LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP se abordó utilizando microarrays de oligonucleótidos (Affymetrix HU133A). La diferencia entre la expresión génica entre diferentes subtipos de leucemia se analizó con diversas técnicas estadísticas (ANOVA, t-test), utilizando diferentes programas informáticos. Los resultados de este análisis se validaron en una serie independiente de pacientes estudiados mediante RT-PCR cuantitativa utilizando arrays de baja densidad. RESULTADOS. Los pacientes afectos de LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP presentaron un inmunofenotipo característico (CD34-, HLA-DR-, CD117-, CD56+, expresión de marcadores mielomonocíticos). Por otro lado, el análisis molecular reveló que el tránscrito tipo I del gen quimérico MYST3-CREBBP es el más común en estos pacientes. Por otra parte, el análisis sobre el perfil de expresión génica mostró una firma característica para las LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP, consistente en la sobreexpresión de determinados genes HOX (HOXA9, HOXA10), de los oncogenes RET y PRL y la infraexpresión de genes como CCND2, STAT5 y WT1. Por otro lado, se observó una similitud en la expresión de algunos genes entre las leucemias MYST3-CREBBP y las LMA con reordenamiento de MLL, lo que sugiere un mecanismo de leucemogénesis parcialmente compartido por los dos tipos de leucemia.CONCLUSIONES. La técnica de RT-PCR implementada es útil para la detección rápida del reordenamiento MYST3-CREBBP. El denominado tránscrito tipo I del gen quimérico MYST3-CREBBP es el más común en la LMA con t(8;16). La LMA con reordenamiento MYST3-CREBBP posee un perfil de expresión característico, con sobreexpresión de diversos oncogenes como RET y PRL y la presencia de un patrón específico de expresión de los genes homeobox.

Este trabajo se centra en el estudio de la implicación de los genes MAPT y PGRN en la degeneración lobar frontotemporal (DLFT). Se describen 2 nuevas mutaciones en estos genes (P301T en el gen MAPT y la A303AfsX57 en el gen PGRN) y no se encontraron variaciones en el número de copias del gen MAPT en las muestras estudiadas, apoyando que la existencia de alteraciones en la dosis génica de MAPT no seria una causa de DLFT. El mecanismo patogénico de la mutación P301T es potencialmente múltiple e incluye la reducción de la capacidad de promover el ensamblaje entre tau y los microtúbulos, la estimulación del ensamblaje de filamentos anómalos de tau y la creación de un nuevo sitio de fosforilación en la proteína tau. El mecanismo patogénico de la mutación A303AfsX57 es la haploinsuficiencia. Respeto al fenotipo clínico los pacientes con mutaciones en el gen MAPT presentan una historia familiar con patrón autosómico dominante de inicio precoz, siendo el diagnóstico clínico más frecuente el de demencia frontotemporal, si bien en ocasiones pueden presentar sintomatología similar a la degeneración corticobasal o la parálisis supranuclerar progresiva. El examen neuropatológico muestra una DLFT con presencia de depósitos de filamentos de proteína tau hiperfosforilada. Los pacientes con mutaciones en el gen PGRN suelen presentar una edad de inicio más tardía que los pacientes con mutaciones en el gen MAPT. El fenotipo clínico de estos pacientes suele ser también similar a la demencia frontotemporal, si bien la importante alteración del lenguaje puede conducir a un diagnóstico de afasia progresiva no fluente. El examen neuropatológico muestra una DLFT con inclusiones ubiquitin positivas (DLFT-U) con presencia de inclusiones neuronales intranucleares. Estas inclusiones, sin embargo no son patognomónicas de la presencia de mutaciones en PGRN. La proteína depositada en las inclusiones neuronales ubiquitinadas presentes en los pacientes con mutaciones en PGRN es la TDP-43. Por otro lado se describe que la frecuencia del genotipo H1/H1 de MAPT en pacientes con DLFT no es significativamente diferente de la frecuencia en controles sanos en nuestro estudio. Tampoco encontramos diferencias en la ratio cerebral 4R/3R de RNAm de MAPT en pacientes con DLFT. Estos hallazgos sugieren que los eventos post-traduccionales podrían ser el principal factor que causa el depósito de isoformas específicas de tau en algunas taupatías, como algunos subtipos de la DLFT. Sin embargo, el incremento de la ratio 4R/3R de RNAm de MAPT en los portadores del genotipo H1/H1 sugiere que esta alteración podría ser el mecanismo a través del cual este genotipo incrementa el riesgo para desarrollar una taupatía. Finalmente se realizó un estudio de correlación clínico-genético-patológica en 32 casos con DLFT confirmada patológicamente. En este estudio se hallaron un amplio espectro de entidades clínicas y neuropatológicas, si bien se pudo establecer alguna asociación clínico-genética-patológica: el sustrato patológico de la demencia frontotemporal es impredecible, las mutaciones en el gen MAPT y los fenotipos clínicos de afasia progresiva no fluente y degeneración corticobasal se asocia a DLFT tau-positiva, mientras que la presencia de signos de motoneurona, la demencia semántica o las mutaciones en PGRN se asocian a DLFT-U. / In this work we describe two new mutations. The first is a mutation (P301T) in the MAPT gene in a patient with familial frontotemporal dementia and parkinsonism, and a pattern of autosomal dominant inheritance. The fact that this new mutation is located in the same codon that other missense mutations (P301L and P301S) associated with tau pathology, highlights the importance of this site for the physiological function of tau protein. The second is a mutation in the PGRN gene (A303AfsX57) associated with late-onset frontotemporal dementia and with "cat's eye" shaped intranuclear and cytoplasmatic ubiquitin immunoreactive inclusions in the neuropathological exam. The A303AfsX57 mutation is consistent with a nucleotide deletion in exon 8 (c908delC). This deletion causes a frameshift at codon 303 that introduces a premature termination codon (A303AfsX57). Furthermore we determine that MAPT gene copy number variation is not involved in 70 patients with clinical diagnosis of FTLD.On the other hand we evaluated the 4R/3R tau mRNA ratio in 18 patients with frontotemporal lobar degeneration (FTLD), and the effect of the H1/H1 genotype on this ratio. The 4R/3R mRNA ratio in frontal cortex was similar in FTLD patients and controls. The H1/H1 genotype carriers showed a significant increase in 4R/3R mRNA ratio, suggesting that this genotype could modulate the tau mRNA splicing.Finally we performed a clinicopathological correlation and genetic analysis in 32 consecutive patients with neuropathological diagnosis of FTLD or CBD. According to previous studies, we described a broad spectrum of clinical and pathological features in these patients. However, we found certain degree of association of some clinical subtypes to specific pathological substrates: pathology underlying sporadic FTD is heterogeneous and not predictable. MAPT mutations and clinical diagnosis of PNFA and CBD were associated to tau-positive pathology. The presence of signs of lower MND and SD correlated with FTLD-U.

Els mecanismes de regulació de l'expressió gènica a bactèries, i concretament a "E.coli", han estat àmpliament estudiats, no nomès per la seva importànica per la comprensió del funcionament de la cel.lula bacteriana, sinó també pel seu interès en el desenvolupament de sistemes d'expressió i producció de proteïnes clonades. És evident que el coneixement dels mecanismes que regulen l'expressió gènica a "E.coli" pot facilitar la manipulació d'aquesta bactèria per tal d'utilitzar-la com a hoste amb la finalitat de produir determinades proteïnes d'interès biotecnològic.El treball que es presenta en aquesta Tesi comprèn diferents aspectes relacionats amb la mutació "hha", especialment pel que fa referència al seu paper regulant l'expressió gènica a "E.coli" i a la utilització d'aquesta mutació i d'altres amb la finalitat d'augmentar la producció de proteïnes heteròlogues.Una part del treball es va centrar en l'estudi de diferents aspectes del gen "hha". Aquest gen ha estat identificat en funció del seu paper en la modulació de l'expressió de l'alfa-hemolisina clonada al plàsmid multicòpia pANN202·312 (Godessari el al., 1988). Les soques portadores de mutacions en el gen "hha" lenen incrementada la sinlesi d'hemolisina, Aquesta mutació és pleotròpica, causant efectes similars sobre l'expressió d'algunes proteïnes heteròlogues clonades (Nieto et al., 1987; Blanco et al., 1991; Carmona, Tesi Docloral, 1992). El gen "hha" codifica per la proteïna Hha, d'un pes molecular d'aproximadament 8 kDa. Aquesta proteïna està implicada en els mecanismes de regulació de l'expressió de l'hemolisina, acluant a nivell transcripcional. Els darrers estudis sobre el mecanisme pel qual la proteïna Hha modula l'expressió de l'hemolisina suggereixen que la regulació està relacionada amb canvis en la topologia del DNA (Carmona, Tesi Doctoral, 1992). La comparació de les seqüències d'aminoàcids de la proteïna YmoA de "y. enterocolitica" (Cornelis et al" 1991) i de la proteïna Hha va permetre trobar un elevat grau d'homologia. La proteïna YmoA exerceix un paper en la regulació per temperatura de l'expressió de determinats gens implicats en la virulència d'aquesta bactèria. Resultats preliminars semblen indicar que aquesta regulació es produiria per canvis en el grau de superenrotllament del DNA.S'ha postulat que aquestes dues proleïnes, Hha i YmoA, formarien part d'una nova familia de proteïnes que modularien l'expressió gènica per canvis conformacionals en el DNA (De La Cruz et al., 1992).En aquest treball s'han completat i comprovat diferents aspectes relacionats amb la caracterització del gen Ma. Mitjançant la utilització de sondes del gen marcades i les tècniques d'amplificació de DNA per la metodologia de la PCR, s'ha localitzat el gen "hha" al cromosoma d'E.coli. A més a més, s'han realitzat estudis enfocats a determinar quina és la distribució d'aquest gen entre diferents soques d'E. coli i d'altres géneres d'enterobactéries: S. typhimurium, S. marcescens, K. pneumoniae i Y. enlerocolitica. Els resultats mostren una distribució pràcticament homogénia entre les soques d'E.coli que s'han utilitzat, mentre que no és detectable a pràcticament cap altra soca d'enterobacléria. El gen "hha" només ha estat detectat a la soca C3 de K. pneumoniae i a la soca V754 de y. enterocolitica. Tenint en compte que tolo i que les proteïnes Hha i YmoA presenten un elevat grau d'homologia, les sondes del gen "hha" no proporcionen senyals d'hibridació amb el cromosoma de Y.enterocolitica, es qüestiona la utililzació de les tècniques d'hibridació de tipus "Southern" i de PCR com a sistemes de detecció de la producción de proteïnes semblants a Hha o YmoA en els microorganismes analitzats.Donat l'efecte pleotrópic de la mutació "hha", i amb la finalital de modificar el fons genétic d'una soca d'E.coli per tal d'optimitzar l'expressió de proleïnes clonades, es va plantejar l'obtenció de la mutació "hha" a una soca d' E.coli amb genotip recA, ja que les soques "hha" de les que es disposava fins el moment no eren delicients per les funcions de recombinació homòloga, el que pot implicar la inestabilitat dels plàsmids portadors dels gens que es volen expressar. Utilitzant el transposó TnS com a element mutagènic, es van obtenir mutants hha derivats de la soca HB l01. La caracterització d'aquests clons va conduir a l'observaci6 d'un fenomen inesperat. En les successives ressembres de clons "hha" apareixien colònies no productores d'hemolisina. L'estudi d'aquest tipus de clons va permetre determinar que el seu origen es devia a transposicions secundàries de TnS des de la inserció inicial al gen hha cap al gen hlyA, gen estructural de l'hemolisina clonada a pANN202·312. Aquestes insercions impedeixen la sintesi de la toxina i causen el fenotip no productor d'hemolisina.L'expressió de proteïnes clonades a E.coli és dependent dels mecanismes de regulación de l'expressió gènica d'aquest microorganisme, Aquests mecanismes poden actuar a nivell transcripcional, a nivel d'estabilitat del missatger, a nivel traduccional i a nivell post-traduccional. En aquest darrer nivell s'inclouen els mecanismes de modificactó post-traduccional, que condueixen a la formació de la proteïna activa, o el transport de la proteïna a la seva localització especifica. Però en aquest mateix nivell també es produeixen fenòmens de degradació proteolitica; aquests mecanismes tenen especial importànica quan es volen expressar proteïnes heteròlogues clonades a E.coli, ja que majoritàriament aquestes proteïnes són degradades. A E.coli es coneixen diferents proteases, però se'n sap molt poc del seu paper en la degradació de proteïnes helerologues, i a més en pocs casos s'han relacionat amb el gen que les codifica (Miller, 1987; Gotessman, 1987). Amb la finalitat d'optimitzar una soca d'E.coli per l'expressió de proteïnes heteròlogues, una part d'aquest treball ha consistit en l'intent de localitzar per mutagènesi gens que codifiquin per proteases intracel.lulars. Per això es va triar un model de proteïna heteròloga que és degradada quan s'expressa a E.coli, la proteïna quimèrica ABI508 clonada al plàsmid pJMKam4 (Bishai el al., 1987). Per l'expressió d'aquesta proteïna es va utilitzar la soca d' E.coli Hha·2 ("hha"), ja que l'expressió de la proteïna ABIS08 també és afectada per la pleotropia d'aquesta mutació, produïnt·se un increment de la seva síntesi (Carmona, Tesi Doctoral, 1992). S'ha posat a punt una metodogia de detecció de clons defectius en activitats proteolitiques intracel.lulars. Malgrat els resultats no han conduït a la identificació de cap mutació que afecti alguna proteasa intracel.lular, la metodologia s'ha mostrat vàlida per aquesta finalitat.D'altra banda es pretenia cercar altres mutacions, diferents d'hha, que afectin gens que modulin l'expressió de proteïnes heteròlogues, de manera que mutacions en aquests gens puguin proporcionar un augment de la seva expressió. Es va triar un model de proteïna heteròloga expressada a E.coli, l'aerolisina d'Aeromonas hydrophila, toxina amb activitat hemolitica, clonada al plàsmid multicòpia pHPC3·700 (Chakraborty el al., 1986; Nieto el al., 1987). Aquesla toxina és secretada al medi extern a "Aeromonas hydrophila" seguint la via de la seqüència senyal. Quan s'expressa a E.coli, l'aerolisina s'acumula al periplasma (Chakraborty el al., 1986; Howard i Buckley, 1986).Es van fer experiments de mulagènesi de la soca d' E.coli 5K (pHPC3·700) amb Tn5, amb la finalitat de trobar mutacions que poguessin afectar la sintesi o secreció de l'aerolisina. Els experiments de mutagènesi van conduir a l'obtenció de dos mutants, denominats hap-6 i hap-9 (hap per "high aerolysin production"), que presentaven, a diferència de la soca parental, grans halos d'hemòlisi en plaques d'agar-sang. La caracterització preliminar i el mapatge aproximat de les dues mutacions va mostrar que es tractava de mutacions diferents, pel que es va decidir caracteritzar únicament la mutació hap-9, S'ha estudiat l'expressió d'aerolisina per part de la soca mutant CM209 (hap·9). S'ha comprovat que aquesta mutació modifica tant la sintesi d'aquesta proteïna com la seva secreció al medi extern. S'ha demostrat que la sortida d'aerolisina al medi extern no és deguda a una secreció real de la proteïna, ja que va acompanyada de la presència de determinats enzims periplasmàtics al medi extern. S'ha constatat que l'augment en la producción és moderat, aproximadametl de 1,35 vegades més respecte la soca parental. D'altra banda, l'anàlisi de les envoltes de la soca mutant ha permès constatar que a la membrana externa de les cèl.lules de la soca CM209 hi manca la proteïna LamB, present als extractes de la soca parental.Així mateix, s'ha pogut observar que l'expressió de l'aerolisina, en el cas de la soca CM209, altera la composició de la membrana externa, afectant la presència i quantitat d'algunes proteïnes de baix pes molecular. També ha estat evidenciada la pleotropia de la mulació "hap-g", demostrant que l'expressió d'una altra proteïna heteróloga, una endoglucanasa de Bacillus polymyxa, està incrementada a la soca CM209.El mapatge de la mutació "hap-g" per conjugació amb soques Hfr::Tn10 i cotransducció de marcadors amb PI , va permetre localitzar la mitació al minut 16,7 del mapa de lligament del cromosoma d'E.coli, L'estudi dels gens censats en aquesta regió va suggerir que els unics gens que podrien estar relacionats amb la mutació "hap·g" eren els gens tolQRAB. Ha estat descrit que mutacions en aquests gens presenten diversos efectes pleotròpics, entre els que cal destacar l'alliberament de proteïnes periplasmàtiques al medi extern (mutacions "Leary", Webster, 1991). Tant l'anàlisi de l'expressió de l'aerolisina a soques mutants pels gens tolA i tolB, com l'espectre de resistències a colicines de la soca CM209, suggereix que la mutació hap-9 correspon a una mutació en un dels gens tolQ, tolR o tolA. Ja ha estat descrit que mutacions en aquests gens poden causar efectes pleotrópics en l'alliberament de proteïnes periplasmàtiques, i que aquesl electe ptl anar acompanyat d'un moderat increment en la seva sintesi (Fognini-Lelebvre i Ponalier, 1984).Com a part final del treball, s'ha intentat la construcció d'una soca d'E.coli en la que fa combinació de les mutacions hha i hap·9 pugui contribuir a optimitzar l'expressió de proteïnes heterólogues clonades. / In this work we have studied different aspects concerning the "hha" mutation, and other mutations that could cause an increase in the expression of heterologous proteins cloned into "Escherichia coli". The "hha" gene is involved in regulatory mechanisms of gene expression by changing DNA topology. We have studied the "hha" gene distribution between different strains of "E.coli" and other enteric bacteries: S. typhimurium, S. marcescens, K .pneumoniae and Y. enterocolitica. There is a homology of 83% between the Hha protein and YmoA protein of Y. enterocolilica. Using hybridization and PCR techniques, we have detected the "hha" gene in most of "E.coli" strains, in C3 strain of K. pneumoniae and Y754 strain of Y.enterocolilica. Furthermore, we have isolated mutants "hha" in HB101 (recA), by Tn5 mutagenesis. This study has allowed us to determine a phenomenon of instability of Tn5 insertions in the "hha" gene.On the other hand, we have developed a methodology in order 10 select mutants in intracellular protease activity. In this work we have isolated a mutation, named "hap-9", that increases the expression of the aerolysin of Aeromonas hydrophila cloned into E. coli. This mutation, which causes a leaky phenotype, was mapped near minute 17.This suggests us a relation between this mutation and tolQRAB genes. The sensibility to colicins of CM209 strain (hap-9) and the expression of aerolysin in mutant strains in "Tol" genes, indicates that the "hap-9" mutation is caused by an insertion of Tn5 in the gene cluster tolQRA. In addition, we have constructed a strain carrying both the "hha" and the "hap-g" mutations, in order to obtain a strain with optimized expression of heterologous proteins cloned into "E.coli".

INTRODUCCIÓ: Les neoplàsies limfoides agrupen un conjunt de malalties que, tot i compartir certes característiques comunes, presenten una gran heterogeneïtat en la seva biologia i manifestacions clíniques. En la present tesi s´han estudiat els mecanismes moleculars implicats en el desenvolupament i progressió de diferents entitats que s´inclouen dins del grup dels Limfomes No-Hodgkin de cèl·lula B (NHL, de l´anglès Non-Hodgkin Lymphoma), especialment el limfoma de cèl·lules del mantell (MCL, de l´anglès Mantle Cell Lymphoma) i la leucèmia limfàtica crònica (CLL, de l´anglès Chronic Lymphocytic Leukemia), els quals són limfomes de cèl·lula B petita. MATERIAL I MÈTODES: En aquest treball s´han emprat una gran diversitat de tècniques experimentals, de les que destaquen la hibridació genòmica comparada (CGH, de l´anglès Comparative Genomic Hybridization) per estudiar les alteracions cromosòmiques dels tumors, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR, de l´anglès Polymerase Chain Reaction) i la cromatografia líquida desnaturalitzant (DHPLC, de l´anglès Denaturing High Perfomance Liquid Chromatography) per determinar l´adquisició d´alteracions en el material genètic a nivell de DNA; així com la PCR quantitativa a temps real (qPCR) i la realització de microarrays d´oligonucleòtids d´alta densitat per analitzar l´expressió gènica a nivell de mRNA.RESULTATS I CONCLUSIONS: L´estudi de gens implicats en la proliferació de MCL ha permès la construcció d´un model predictor de la supervivència dels pacients basat en l´expressió dels cinc gens RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 i SLC29A2. Aquest model es pot aplicar tant en material congelat com en teixits biològics fixats amb formol i inclosos en parafina (FFPE, de l´anglès Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded tissue), podent ésser útil en la presa de decisions terapèutiques1. També s´ha estudiat el gen MDM2, implicat en les vies de resposta al dany del DNA. S´ha observat que, a part de les alteracions del gen p53, l´augment de l´expressió gènica de MDM2 es correlaciona directament amb una disminució de la supervivència en MCL. En alguns casos aquest augment de l´expressió pot donar-se per guany del locus genòmic del gen, mentre que la presència del SNP309 al seu promotor no es relaciona amb els canvis d´expressió (2).La desregulació dels mecanismes implicats en la mort cel·lular programada o apoptosi també juga un paper clau en els processos de tumorogènesi. S´ha observat que els receptors de mort TNFRSF10A i TNFRSF10B es troben poc mutats en neoplàsies limfoides, indicant que la seva alteració no és rellevant per explicar la resistència a l´apoptosi observada en aquests tipus de limfomes. Tot i això, la presència del polimorfisme A1322G al domini de mort de TNFRSF10A s´associa amb un augment de risc a patir MCL i CLL; mentre que la presència del polimorfisme C626G al domini d´unió a lligand de TNFRSF10A sembla jugar un paper protector en MCL; suggerint un possible paper de dits polimorfismes en la resistència a la mort mediada per TRAIL (3).Finalment, l´estudi global de les alteracions que participen en els fenòmens de progressió clínica primerenca de la CLL ha permès determinar la modulació de l´expressió d´un petit grup de gens (58) que participen en diferents vies cel·lulars. Destaca un subconjunt de gens que actuen en la inhibició de l´adhesió i motilitats cel·lulars, els quals presenten una disminució de la seva expressió. També s´ha observat que la progressió clínica de les CLL s´associa, en alguns casos, amb la inactivació de certs gens supressors de tumors. Per altra banda, l´evolució primerenca d´aquest tips de leucèmia sembla implicar poca inestabilitat cromosòmica (4).ARTICLES GENERATS PER LA PRESENT TESI:(1). Hartmann E, Fernandez V, Moreno V, Valls J, Hernandez L, Bosch F, Müller-Hermelink HK, Ott G, Rosenwald A, Campo E. A five-gene model to predict survival in mantle cell lymphoma and its application to formalin-fixed paraffin-embedded tissue. J Clin Oncol, under revision (Journal impact factor 2006: 13.598).(2). Hartmann E, Fernandez V, Stoecklein H, Hernández L, Campo E, Rosenwald A. Increased MDM2 expression is associated with inferior survival in mantle cell lymphoma, but not related to the MDM2 SNP309, Haematologica, 92:574-575 (Journal impact factor 2006: 5.032).(3). Fernandez V, Jares P, Bea S, Salaverria I, Guino E, de Sanjose S, Colomer D, Ott G, Montserrat E, Campo E. Frequent polymorphic changes but not mutations of TRAIL receptors DR4 and DR5 in mantle cell lymphoma and other B-cell lymphoid neoplasms. Haematologica. 2004 Nov;89(11):1322-31 (Journal impact factor 2006: 5.032).(4). Fernandez V, Jares P, Salaverria I, Giné E, Beà S, Aymerich M, Colomer D, Villamor N, Bosch F, Montserrat E, Campo E. Gene expression profile and genomic changes in disease progression of early-stage chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, accepted (Journal impact factor 2006: 5.032). / "ANALYSIS OF THE MOLECULAR MECHANISMS IMPLIED IN THE DEVELOPMENT AND PROGRESSION OF SMALL B CELL LYMPHOMAS" INTRODUCTION:Different molecular mechanisms implied in the development and progression of distinct subtypes of small B cell lymphomas that belong to Non-Hodgkin´s Lymphomas (NHL) have been studied in the present work, specially focusing on Mantle Cell Lymphoma (MCL) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).MATERIALS AND METHODS:Comparative genomic hybridization (CGH) has been aplied to study the chromosomal alterations of the tumors. Polymerase chain reaction (PCR) and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) techniques have been performed to detect nucleotide alterations in certain genes; whereas real time quantitative PCR (qPCR) and high density oligonucleotide microarrays have been used to analyse gene expression.RESULTS AND DISCUSSION:The gene expression model composed of the five genes RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 and SLC29A2 allows the survival prediction of MCL patients with widely disparate clinical outcome and is superior to the immunohistochemical marker Ki-67. The predictor is applicable to fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor samples. On the other side, the study of the MDM2 gene has shown that increased gene expression correlates with inferior survival in MCL. MDM2 overexpression is associated with copy number gains of the MDM2 locus in single tumors, but not with the recently reported MDM2 promoter SNP309.The study of the death receptors TNFRSF10A and TNFRSF10B has shown that mutations in these genes are uncommon in lymphoid neoplasms, but the presence of certain TNFRSF10A polymorphisms (A1322G in the death domain and C626G in the extracellular binding domain) can contribute to the pathogenesis of these malignancies. The study of early clinical progression in CLL has allowed the identification of a significant modulation of the gene expression of 58 genes, with a particular downregulation of genes that are inhibitors of cell adhesion and motility. On the other side, our results indicate that clinical progression of early stage CLL is associated with karyotype evolution and inactivation of certain tumor suppressor genes.