Los mecanismos moleculares implicados en la progresión de la leucemia mieloide crónica (LMC) a la crisis blástica (CB) permanecen en gran medida por dilucidar. De cara a profundizar en el estudio de estos mecanismos, en la presente tesis se estudiaron las alteraciones de los genes p16 y survivina en esta enfermedad. Así, en el primer trabajo se analizó mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real y de PCR convencional semicuantitativa la presencia de deleciones de p16 en una serie de 42 pacientes con LMC Ph-positiva estudiados de forma secuencial en su fase crónica y en la CB. Además, se determinó el estado de metilación de p16 en las distintas fases de la enfermedad y se investigó la posible relación de las alteraciones del citado gen con las características clínico-hematológicas de los pacientes y el pronóstico de la CB. Los resultados mostraron que 6 de las 21 muestras (29%) de pacientes con CB linfoide tenían deleciones homocigotas de p16, frente a la ausencia total de éstas en la fase crónica y en la CB mieloide. Por otra parte, ninguno de los casos analizados presentó hipermetilación del promotor de p16. A su vez, no se observó la existencia de un perfil clínico-hematológico característico de la CB con deleción de p16, a excepción de su fenotipo linfoide exclusivo. Por último, la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes con CB linfoide no dependió de la existencia de deleciones de p16. El objetivo del segundo trabajo fue analizar mediante la técnica de PCR cuantitativa a tiempo real el patrón de expresión del gen de survivina en una serie de 16 pacientes con LMC Ph-positiva estudiados de forma secuencial en las distintas fases evolutivas de la enfermedad. Asimismo, se investigaron las posibles correlaciones entre la expresión de survivina, el índice de proliferación celular y el perfil clínico de la LMC. Los resultados evidenciaron una sobreexpresión significativa de survivina tanto en la fase crónica como en la CB de la LMC, en comparación con los niveles detectados en granulocitos de donantes sanos. Con todo, los niveles de expresión de survivina fueron considerablemente mayores en la CB que en la fase crónica, con una mediana siete veces superior, siendo el incremento de expresión más pronunciado en las CB de estirpe mieloide que en las linfoides. Por otro lado, se observó un incremento significativo de la proliferación celular en la CB, con una mediana de expresión de Ki-67 casi tres veces superior a la de la fase crónica, sin registrarse diferencias significativas en función del fenotipo de la CB. A pesar de que tanto survivina como Ki-67 experimentaron un incremento de expresión en la CB, no se observó una correlación significativa entre ambos parámetros. Tampoco se observó una asociación significativa entre los niveles de survivina y el perfil clínico-hematológico de la CB.Los trabajos que conforman la presente tesis han permitido ampliar el conocimiento acerca de dos alteraciones moleculares (deleción homocigota de p16, sobreexpresión de survivina) que se asocian frecuentemente con la progresión de la LMC a la CB, lo que sugiere su posible implicación en la patogénesis de la CB. / The molecular abnormalities involved in the evolution of chronic myeloid leukemia (CML) to the blast crisis (BC) are poorly understood. The aim of the present thesis was to contribute to a better knowledge of the mechanisms involved in CML progression. In the first study, a sequential assessment by both quantitative real-time PCR and conventional semiquantitative PCR of p16 exon 2 deletions was performed in 42 CML patients in whom paired DNA samples from the chronic phase and the BC were available. The methylation status of the promoter region of p16 gene was also studied by methylation-specific PCR. Homozygous p16 deletions were detected in 6 of 21 patients with lymphoid BC, whereas they were not observed in chronic phase CML nor in 21 patients with myeloid BC. Hypermethylation of p16 gene was not detected in any of the lymphoid BC cases. The clinical profile, therapeutic response and survival did not significantly differ in p16 deleted and p16 germline lymphoid BC patients.In the second work, the expression of the survivin gene was studied by quantitative real-time PCR in the chronic phase of CML and at BC in 16 patients in whom sequential RNA samples from the two phases of the disease were available. Survivin was significantly overexpressed both in the chronic phase and the BC as compared to granulocytes from controls. In BC, survivin expression was 7-fold higher than in chronic phase, with such an increase being more pronounced in the myeloid than in the lymphoid cases. Despite overexpression of both survivin and Ki-67 at BC, no significant correlation between their expression levels was observed. These data support a possible role for p16 gene deletions and survivin overexpression in the pathogenesis of the progression of CML.

DE LA TESI:El diagrama complet de les pertorbacions genètiques i epigenètiques que afecten el càncer colorectal (CCR) està lluny de ser totalment conegut. L'LOH és una de les alteracions més recurrents en CCR així com en d'altres neoplàsies. Acostuma a ser un bon indicador de la presència de gens rellevants per a la carcinogènesi. L'estudi de les alteracions somàtiques en gens situats en aquestes regions recurrents de desequilibri al·lèlic ha estat fonamental en el passat per la identificació d'alguns dels gens supressors tumorals més coneguts, com és el cas de p53, Smad4, p16, APC o Rb. Els desequilibris al·lèlics a 4p s'han associat amb una major agressivitat i un pitjor pronòstic en pacients de CCR, malgrat que els gens diana d'aquests alteracions resten encara per ser identificats. En aquesta tesi s'ha dut a terme un treball d'anàlisi genètica integral per a una regió crítica situada a 4p15 am la intenció de localitzar-hi els gens que més probablement estiguin contribuint a la progressió tumoral. Hem realitzat un exhaustiu treball d'al·lotipat mitjançant la utilització de marcadors microsatèl·lit, sobre un model de tumors xenoempeltats en ratolins atímics. Hem identificat una regió crítica en al que els gens candidats han estat analitzats d'acord a les seves possibles alteracions somàtiques genètiques i/o epigenètiques. També hem analitzat els patrons d'expressió dels gens candidats per tal d'identificar possibles alteracions transcripcionals. Mitjançant prediccions de regulació transcripcional bioinformàtiques hem trobat que PI4K2B i STIM2 són dos gens regulats per TCF4/B-catenina. Això ha estat confirmat mitjançant immunoprecipitació de cromatines. Hem avaluat el valor pronòstic de les alteracions en aquests dos gens i el seu valor com predictors de la resposta al tractament basat en el 5-FU de pacients de CCR. A més, hem realitzat experiments de depleció mitjançada per siRNA sobre línies cel·lulars de CCR, alhora que hem transfectat de forma estable aquests dos gens. Finalment hem realitzat assajos de formació de tumors en ratolins immunodeprimits per comprovar si la sobreexpressió dels nostres gens candidats té o no un efecte en la formació dels tumors generats a partir de línies cel·lulars. Els patrons de LOH identificats a 4p descarten que, com s'havia proposat, es doni en l'estadi metastàtic una acumulació d'aquestes alteracions. L'LOH detectat no correlaciona amb la dosi gènica, és a dir que les pèrdues d'heterozigositat no comporten una pèrdua de material genètic i probablement són la conseqüència de processos de recombinació mitòtica i/o pèrdua i duplicació associats a un escenari d'inestabilitat cromosòmica. Els gens d'aquesta regió crítica no són portadors de mutacions, microdelecions ni delecions en homozigosi, ni tampoc presenten alteracions en els patrons de metilació de les seves regions promotores. Per contra, vam trobar que PI4K2B i STIM2 estaven significativament sobreexpressats en pacients afectes de CCR i metàstasi hepàtiques (MH) independentment de la presència o no d'LOH, i que, a més, la seva transcripció estava sot control del complex TCF4/B-catenina. Els nivells elevats de PI4K2B, tant de proteïna com d'mRNA estan assocats a un millor pronòstic i una millor resposta al tractament quimioteràpic dels pacients de CCR. Finalment, els estudis de depleció amb siRNA han demostrat que el silenciament d'aquests dos gens comporta un increment significatiu de la proliferació cel·lular i que la sobreexpressió en línies cel·lulars de STIM2 resulta en una disminució del volum tumoral i per tant té un efecte de supressió de la proliferació. Conclusions: Hem identificat PI4K2B i STIM2 com a gens diana de les alteracions recurrents a 4p15 i hem demostrat que són dianes transcripcional de la via de B-catenina. La sobreexpressió d'aquests dos gens té un efecte supressor de la proliferació cel·lular, que alhora, té un impacte en el pronòstic i el tractament dels pacients de càncer colorectal.

La hiperplasia suprarrenal congénita (HSC) comprende un conjunto de trastornos hereditarios de la esteroidogénesis, causados por la deficiencia de alguna de las enzimas necesarias para la conversión del colesterol en cortisol. El más frecuente es el déficit en 21-hidroxilasa, responsable de cerca del 90% de los casos de HSC. El déficit en 21-hidroxilasa es una enfermedad hereditaria autosómica recesiva, causado por una alteración genética en el gen CYP21B que codifica la enzima.Esta enfermedad presenta un espectro muy amplio de manifestaciones clínicas; desde formas severas que se presentan al nacimiento, en las que la virilización puede ir o no acompañada de un síndrome pierde sal, hasta formas más leves en que los signos de virilización se presentan más tardíamente. La incidencia de las formas clásicas de este déficit, oscila alrededor de 1:10.000-15.000 nacimientos, mientras la de las formas no clásicas se ha estimado en 1:1.000 en la población blanca, con marcadas variaciones étnicas.El objetivo ha sido la caracterización clínica, biológica y genética de la HSC por déficit en 21-hidroxilasa de una población de la Comunitat Autònoma de Catalunya, con el fin de poder realizar un diagnóstico etiológico concluyente y establecer el consejo genético familiar completo.Han colaborado 53 familias (106 cromosomas no emparentados) con al menos un hijo diagnosticado de HSC por déficit en 21-hidroxilasa, siendo el total de individuos estudiados de 214. De este total, 71 son pacientes que según los síntomas clínicos fueron clasificados en: 13 SW; 5 SV y 53 NC; 102 son progenitores y 41 son hermanos de dichos pacientes, ninguno de ellos clínicamente afecto.Para la determinación de la función hormonal se practicó una prueba de estimulación con corticotropina (test de ACTH), con valoración de las concentraciones plasmáticas de 17-hidroxiprogesterona antes y tras 30 minutos de la inyección. La determinación de los antígenos de Clase I y Clase II del Sistema HLA, se realizó mediante la técnica de Microlinfocitotoxicidad. El análisis genético consistió en la detección de grandes reordenamientos mediante la técnica de "Southern blot", y la detección de nueve de las mutaciones puntuales más comunes mediante el diseño de una nueva metodología en la que se emplean dos estrategias según la mutación a detectar: ganancia o pérdida de al menos una diana de restricción en el producto de PCR amplificado a partir de DNA genómico o creación de una diana de restricción por amplificación (ACRS-PCR) y posterior digestión con una enzima de restricción apropiada.El test de ACTH se confirma como fiable, ya que no se observaron falsos positivos ni falsos negativos en los valores obtenidos de 17-hidroxiprogesterona post estimulación. El nomograma de 17-hidroxiprogesterona proporciona un patrón hormonal que facilita, en la mayoría de los casos, el diagnóstico de las distintas formas de presentación clínica del déficit. No se observó la presencia del antígeno HLA-Bw47 en ninguno de los grupos analizados. Las formas no clásicas se encuentran significativamente asociadas al haplotipo HLA-B14-DR1, mientras que las formas clásicas al antígeno HLA-B5(w51).La metodología utilizada para el análisis molecular del gen ha permitido detectar la mutación causal en el 89,62% de los cromosomas afectos, evaluados globalmente, consolidándose ésta como altamente efectiva en el diagnóstico de esta patología. Las mutaciones más frecuentes observadas han sido: Intrón 2 (50%) en SW; Intrón 2 (50%) y I172N (16,6%) en SV y V281L (61,5%) en NC. El análisis de los pedigrees ha permitido diagnosticar veintiséis formas crípticas y revelar en dos casos la presencia de mutaciones originadas de novo. La concordancia hallada entre el genotipo y el fenotipo ha sido del 97,2%, de ahí, que las predicciones desde el genotipo han de ser hechas todavía con gran cautela.

L'atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia autosòmica recessiva que es caracteritza per la degeneració i pèrdua de les neurones motores de la banya anterior de la medul·la espinal, el que porta a una paràlisi muscular progressiva a causa de la denervació i atròfia de les fibres musculars. La seva incidència és d'1 de cada 6000/10000 naixements i la freqüència de portadors a la població és aproximadament 1 en 50. La meitat dels casos són formes greus (tipus I) que moren abans dels dos anys d'edat. L'AME està causada per l'absència del gen SMN1 (Survival Motor Neuron) que codifica una proteïna completa i funcional. En canvi, tots els afectats tenen una forma homòloga d'aquest gen, SMN2 que codifica una proteïna incompleta que no pot evitar les manifestacions de la malaltia. Els objectius d'aquesta tesi han estat l'estudi de la malaltia durant el desenvolupament fetal i el període neonatal als teixits principalment afectats (medul·la espinal i múscul esquelètic), a fi i efecte de caracteritzar els mecanismes que porten a la pèrdua de les neurones motores i a l'afectació muscular. En primer lloc, es va poder detectar un increment de la mort neuronal per apoptosi a la banya anterior de la medul·la espinal a fetus AME tipus I respecte als controls. Les neurones motores romanents no van presentar canvis morfològics aparents. Paradoxalment, en el període postnatal es van detectar signes de degeneració neuronal però no d'apoptosi, indicant l'existència de dos mecanismes: un prenatal, amb un augment de la vulnerabilitat del DNA i un altre posterior que porta a la degeneració de les neurones motores. A les neurones motores dels fetus AME es va observar també una regulació alterada del patró d'expressió de les proteïnes anti-apotòtiques Bcl-2 i Bcl-XsubL que podria fer-les més susceptibles a la mort cel·lular programada que s'observa durant el desenvolupament. Al múscul esquelètic de fetus AME es van detectar canvis tant en la mida dels miotubs com en la distribució al comparar-los amb els control, encara que no es va detectar un augment en el nombre de cèl·lules amb el DNA fragmentat ni una alteració en l'expressió de Bcl-2 i Bcl-XsubL. La funció colinèrgica de les neurones motores fetals es va analitzar mitjançant l'enzim colina acetiltransferasa (ChAT), l'expressió del qual apareix a mida que s'estableixen les unions sinàptiques i el contacte amb el múscul. Es va observar una reducció de la seva expressió als fetus AME respecte els control encara que la proporció de neurones ChAT negatives fou similar en ambdós grups. La disminució global de ChAT a l'AME podria ser deguda al menor nombre de neurones i les neurones romanents tindrien una funció colinèrgica similar a la dels controls. Finalment, es va caracteritzar l'expressió del gen SMN2 a fetus AME comparant-se amb els controls (que presenten SMN1 i SMN2). La proteïna SMN2 té un patró d'expressió temporal i espacial similar al de SMN1 a la medul·la i al múscul, tot i que els nivells són inferiors als AME. En canvi, a teixits no afectats per la malaltia com el ronyó, pulmó o intestí, l'expressió és gairebé idèntica als dos grups. Aquí, SMN2 deu compensar l'absència de SMN1, mentre que la medul·la espinal i el múscul tindrien una regulació més específica de SMN2 que comportaria l'aparició de la malaltia.