Introducció: Les malalties que afecten el sistema locomotor produeixen una gran limitació en la funcionalitat de la població, especialment en les edats avançades de la vida. Per progressar en el coneixement de l'artrosi es va engegar el treball que presentem, com a model experimental que permetés estudiar tractaments en un model animal per a les fases inicials d'aquesta malaltia.Material i Mètode: Per portar a terme l'estudi es van utilitzar 15 bens adults de 3 anys d'edat. En condicions d'asèpsia, el grup d'animals és sotmès a una intervenció al genoll esquerre per crear una lesió condral amb una llima als dos còndils femorals i ròtula sense lesionar tot el gruix de cartílag. En cap cas es pretén arribar a l'os subcondral. El genoll dret, que no es toca, servirà de control. Es divideix els animals en 3 subgrups per ser sacrificats a les 28, 48 i 104 setmanes. Es preparen mostres histològiques osteocartilaginoses per a l'estudi histològic. L'estudi de les mostres ha inclòs una part histològica qualitativa i quantitativa, un estudi bioquímic i l'estudi de la línia osteocondral. Resultats: En el cartílag lesionat es produeix una necrosi cel·lular amb un augment del metabolisme de les cèl·lules restants que es tradueix en un augment en l'activitat replicativa donant lloc als clusters, que en conjunt determinen un augment de la cel·lularitat total a les capes superficials. S'observen canvis histològics i bioquímics típics de l'artrosi com ara disminució de glucosamina (que indica una disminució del queratan sulfat) i augment de galactosamina (que indica un augment de condroitin sulfat). L'estudi de la línia osteocondral no va mostrar diferències en els animals en els que es va crear la lesió respecte als controls. Els resultats s'han analitzat estadísticament per conèixer la significació de les diferències observades entre els grups.Conclusions: L'escarificació de la superfície del cartílag articular del genoll en el be produeix canvis histològics i bioquímics típics de l'artrosi que no guareixen espontàniament. Als dos anys de produir la lesió s'observa una progressió de les lesions que no permet incloure el grup corresponent dins el model d'artrosi precoç. Així doncs, els experiments que utilitzin aquest model per estudiar el tractament de l'artrosi precoç hauran de realitzar-se abans dels dos anys de crear la lesió del cartílag articular.

La enfermedad de Parkinson (EP) se caracteriza desde el punto de vista clínico por la presencia de temblor de predominio en reposo, lentitud de movimientos (bradicinesia), rigidez en extremidades y cuello y trastorno progresivo de la marcha, constituyendo el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente, después de la enfermedad de Alzheimer. A pesar de los avances producidos en las últimas décadas en el conocimiento de los mecanismos fisiopatológicos y en el tratamiento de la EP, la causa de la enfermedad es todavía desconocida en la inmensa mayoría de los casos, si bien se cree que determinados factores ambientales y genéticos podrían estar involucrados en el desarrollo de la enfermedad. Por ese motivo, en la presente tesis doctoral se parte de las siguientes premisas: 1) Los factores genéticos juegan un papel importante en el desarrollo de EP. 2) Es posible identificar rasgos clínicos diferenciadores entre los casos familiares y los casos esporádicos de EP.

La radioterapia a dosis bajas (RT-DB) actúa sobre células que participan en la respuesta inflamatoria, produciendo un efecto antiinflamatorio, siendo efectiva para el tratamiento de diferentes enfermedades degenerativas óseas e inflamatorias. A pesar de su efectividad, existe poca información sobre la dosis óptima y el fraccionamiento de RT y también tenemos poca información acerca de los mecanismos radiobiológicos implicados en la acción terapéutica antiinflamatoria de la RT-DB.En el primer estudio de la tesis doctoral, mediante un modelo experimental de inflamación aguda y sistemática inducida por lipopolisacárido (LPS) en ratones, en los que se ha irradiado la región abdominal con dosis única de 0.1 Gy, 0.3 Gy, 0.6 Gy, y se han estudiado las interacciones leucocito-endotelio, se demuestra que las tres dosis utilizadas tienen un potente efecto antiinflamatorio en el intestino, siendo la dosis de 0.3 Gy la dosis eficaz más baja. En cuanto a los mecanismos implicados en la sobreexpresión del TGF-Beta1, muestra que es uno de los factores responsables del efecto antiinflamatorio de la RT-DB.En el segundo estudio se demuestra que este efecto antiinflamatorio se mantiene hasta 48 horas después de la irradiación, existiendo una correlación con los niveles de TGF-Beta1, las primeras 24 horas.

La caquexia es un síndrome frecuentemente asociado al crecimiento tumoral, así como también a otros estados patológicos como son sepsis, SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida), diabetes, etc. La caquexia se caracteriza por una importante y progresiva pérdida de peso corporal debida principalmente a la desaparición de las reservas de grasa y a la disminución de masa muscular. Está acompañada también de anorexia, náuseas, astenia, debilidad, alteración de la homeostasis hormonal e inmunodepresión.Sobre los factores de transcripción que podrían estar involucrados en el proceso de desgaste muscular observado en la caquexia (in vivo), se sabe muy poco, pero aparecen algunos factores como posibles candidatos tanto en el desencadenamiento como en la regulación de este proceso. NF-kappa-B y AP-1 son dos factores de transcripción que están activados en distintos tejidos en procesos inflamatorios. Se ha descrito que NF-kappa-B y AP-1 tienen una regulación diferencial en músculo esquelético de rata durante el proceso de sepsis. El mismo grupo ha determinado que C/EBP, otro factor de transcripción involucrado en el proceso de inflamación, aumenta su actividad de unión al DNA en músculo de ratas sépticas, y que este proceso es dependiente de glucocorticoides.Los objetivos de este estudio son: 1) analizar la regulación de algunos factores de transcripción en el músculo esquelético durante la caquexia inducida por el crecimiento tumoral. 2) revertir el desgaste muscular asociado al crecimiento tumoral mediante estrategias basadas en factores de transcripción desde un punto de vista farmacológico. 3) aproximaciones a una terapia contra la caquexia mediante un adenovirus para la transferencia génica de un dominante negativo de AP-1. Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el factor de transcripción AP-1 presenta una regulación diferencial en el músculo esquelético durante el crecimiento tumoral, lo que sugiere que este factor está implicado en el desarrollo de la caquexia asociada al cáncer. Por el contrario, otros factores de transcripción estudiados (NF-kappa-B, C/EBP y Sp-1) no parecen estar implicados directamente en el desarrollo del proceso caquéctico, al menos a nivel muscular. El factor miogénico MyoD presenta importantes cambios en sus niveles en el músculo esquelético de diferentes modelos experimentales de tumores caquécticos, así como en el músculo de pacientes con cáncer de páncreas. La administración aguda de LPS a ratas también afecta marcadamente los niveles musculares de MyoD. Estos datos sugieren una implicación de dicho factor en el desarrollo de la caquexia asociada al crecimiento tumoral y otros procesos patológicos. La administración de SP100030, inhibidor de NF-kappa-B y AP-1, logra revertir parcialmente los efectos asociados al crecimiento del hepatoma ascítico Yoshida AH-130. Este efecto está asociado a una inhibición de la actividad de unión de AP-1 al DNA, un aumento en la expresión de MyoD, y una disminución en la proteólisis muscular. El tratamiento con GW1929, agonista de PPAR-gamma, induce una recuperación en el peso de los músculos extensor digitorum longus de ratones portadores de carcinoma pulmonar de Lewis, asociado a un restablecimiento de los niveles de MyoD. Este compuesto también induce una disminución en la proteólisis de estos músculos in vitro. La sobreexpresión de Tam67, dominante negativo de AP1, revierte totalmente los efectos causados por la adición de TNF-alfa al medio de cultivo de mioblastos C2C12 en diferenciación. Este efecto es producido por el restablecimiento del programa de diferenciación muscular, mediado por una disminución de ciclina D1, una recuperación de los niveles de MyoD y un aumento de la proteína MHC en estas células. La transferencia génica in vivo de dominante negativo de AP-1 Tam67 mediante adenovirus, produce una recuperación en el peso de los músculos y una atenuación en la caída de los niveles de MyoD en el músculo gastrocnemius de animales portadores de tumor. / (ENGLISH)One of the most common manifestation of advanced malignant disease is the development of cancer cachexia. Indeed, cachexia occurs in the majority of cancer patients before death, and it is responsible for the death of 22% of cancer patients. The abnormalities associated with cancer cachexia include anorexia, weight loss, muscle loss and atrophy, anemia and alterations in carbohydrate, lipid and protein metabolism. The degree of cachexia is inversely correlated with the survival time of the patient and it always implies a poor prognosis. Perhaps one of the most relevant characteristics of cachexia is that of asthenia (or lack of muscular strenght), which reflects the important muscle waste that takes place in the cachectic cancer patient. Asthenia is also characterized by a general weakness as well as physical and mental fatigue. In addition, lean body mass depletion is one of the main trends of cachexia and it involves not only skeletal muscle but it also affects cardiac proteins, resulting in important alterations in heart performance.Little is known about the transcription factors that may be involucrated in cancer cachexia at the level of skeletal muscle. Among the main candidates that could have a role in such pathological state are nF-kB abd AP-1. These two transcription factors have already been involucarted in skeletal muscle during sepsis. The objectives of the present study were: 1) to analyze the regulation of some transcription factors in skeletal muscle during cancer cacchexia. 2) reverse muscle wasting associated with tumour burden using strategies based on transcription factors. 3) to introduce an approximation to a therapy against cachexia based on the introduction of an adenovirus using the gene transfer of a dominant negative of AP-1.The results obtained clearly demonstrate that while AP-1 and Myo D are clearly associated with muscle wasting during cancer cachexia, others such as NF-kB,C/EBP and Sp-1 do not seem do be involved.Daily treatment of rats bearing the cachectic Yoshida AH-130 ascites hepatoma with the double inhibitor (NF-kB and AP-1) SP 100030 at a dose of 1 mg/kg of body weight resulted in a clear amelioration of the cachectic effect, especially at the level of skeletal muscle. Thus, tumour-bearing rats treated with SP100030 showed a significant recovery in the weights of gastrocnemius, EDL, tibialis and cardiac muscles. In addition, treatment with the inhibitor also affected both liver and kidney weights. The amelioration in muscle weight was accompanied by an increase in MyoD gene expression -the main transcription factor of muscle tissue involved in muscle differentiation-- in gastrocnemius muscle. At the dose used in this study SP 100030 was an effective inhibitor of AP-1, however, the nF-kB transcription factor was not affected. Interestingly, the effects of the inhibitor seem to be at the level of proteolysis since lower total proteolytic rates were found when incubating of isolated rat muscles in the presence of SP100030. Interestingly, the inhibitor influenced the gene expression of the E2 enzyme in skeletal muscle of tumour-bearing rats; this protein seems to be the main regulator of the activity of the main proteolytic system during cancer cachexia, the ubiquitin-proteasome system. In conclussion, treatment of cachectic tumour-bearing rats with SP 100030 results in an amelioartion of the muscle wasting effect suggesting that the AP-1 signalling cascade plays a very important role in the signalling of muscle wasting associated with disease.The aim of the overexpression of TAM-67 study was to investigate a possible role of the AP-1 signaling cacscade in the process of wasting associated with cancer cachexia at the level od skeletal muscle. Bearing this in mind, an experimental design involucrating adenoviral trasnduction of the TAM-67 protein -a blocker of the AP.1 protein was used in both in vivo and in vitro experimental setups. Interestingly, the injection of virus expressing the TAM-67 protein to tumour-bearing rats, resulted in a significat recovery of the muscle mass -which is dramatically reduced as a result of tumour burden--, therefore suggesting that AP-1 is certainly involved in the signalling associated with muscle protein accretion. Although, several mediators have been suggested for the muscle wasting associated with cancer cachexia, many investigations suggest an important role for TNF (Tumour Necrosis factor). Indeed, addition of TNF to C2C12 cells resulted in a decreased content of both MyoD and MHC. Interestingly, in this muscle cell system, it was also observed that blockage of the AP-1 signalling cascade buy means of adenovirus (containing TAM-67) infection resulted in an improvement in the amount of myofibrillar protein (MHC) following TNF treatment, therefore suggesting that AP-1 signalling is involved in the intraceellular action of the cytokine oin skeletal muscle. In fact, from the results presented here, it may be suggested that AP-1 is involved in skeletal muscle proliferation since blocking the trancription factor sems to lead to an increased differentiation. In conclussion, the gene therapy approach presented here clearly suggests an important role for AP-1 in muscle signalling during catabolic states and may constitute the basis for a future sucessful therapeutic approach.

L'atròfia muscular espinal (AME) és una malaltia autosòmica recessiva que es caracteritza per la degeneració i pèrdua de les neurones motores de la banya anterior de la medul·la espinal, el que porta a una paràlisi muscular progressiva a causa de la denervació i atròfia de les fibres musculars. La seva incidència és d'1 de cada 6000/10000 naixements i la freqüència de portadors a la població és aproximadament 1 en 50. La meitat dels casos són formes greus (tipus I) que moren abans dels dos anys d'edat. L'AME està causada per l'absència del gen SMN1 (Survival Motor Neuron) que codifica una proteïna completa i funcional. En canvi, tots els afectats tenen una forma homòloga d'aquest gen, SMN2 que codifica una proteïna incompleta que no pot evitar les manifestacions de la malaltia. Els objectius d'aquesta tesi han estat l'estudi de la malaltia durant el desenvolupament fetal i el període neonatal als teixits principalment afectats (medul·la espinal i múscul esquelètic), a fi i efecte de caracteritzar els mecanismes que porten a la pèrdua de les neurones motores i a l'afectació muscular. En primer lloc, es va poder detectar un increment de la mort neuronal per apoptosi a la banya anterior de la medul·la espinal a fetus AME tipus I respecte als controls. Les neurones motores romanents no van presentar canvis morfològics aparents. Paradoxalment, en el període postnatal es van detectar signes de degeneració neuronal però no d'apoptosi, indicant l'existència de dos mecanismes: un prenatal, amb un augment de la vulnerabilitat del DNA i un altre posterior que porta a la degeneració de les neurones motores. A les neurones motores dels fetus AME es va observar també una regulació alterada del patró d'expressió de les proteïnes anti-apotòtiques Bcl-2 i Bcl-XsubL que podria fer-les més susceptibles a la mort cel·lular programada que s'observa durant el desenvolupament. Al múscul esquelètic de fetus AME es van detectar canvis tant en la mida dels miotubs com en la distribució al comparar-los amb els control, encara que no es va detectar un augment en el nombre de cèl·lules amb el DNA fragmentat ni una alteració en l'expressió de Bcl-2 i Bcl-XsubL. La funció colinèrgica de les neurones motores fetals es va analitzar mitjançant l'enzim colina acetiltransferasa (ChAT), l'expressió del qual apareix a mida que s'estableixen les unions sinàptiques i el contacte amb el múscul. Es va observar una reducció de la seva expressió als fetus AME respecte els control encara que la proporció de neurones ChAT negatives fou similar en ambdós grups. La disminució global de ChAT a l'AME podria ser deguda al menor nombre de neurones i les neurones romanents tindrien una funció colinèrgica similar a la dels controls. Finalment, es va caracteritzar l'expressió del gen SMN2 a fetus AME comparant-se amb els controls (que presenten SMN1 i SMN2). La proteïna SMN2 té un patró d'expressió temporal i espacial similar al de SMN1 a la medul·la i al múscul, tot i que els nivells són inferiors als AME. En canvi, a teixits no afectats per la malaltia com el ronyó, pulmó o intestí, l'expressió és gairebé idèntica als dos grups. Aquí, SMN2 deu compensar l'absència de SMN1, mentre que la medul·la espinal i el múscul tindrien una regulació més específica de SMN2 que comportaria l'aparició de la malaltia.

INTRODUCCIÓN: La parálisis supranuclear progresiva (PSP) se caracteriza por el depósito anormal de proteína tau hiperfosforilada en ganglios basales y tronco cerebral. Su etiología es desconocida y el único factor de riesgo genético conocido es su asociación con el haplotipo H1, que engloba un conjunto de polimorfismos en la región 17q21 incluyendo el gen tau y genes flanqueantes. Este haplotipo podría actuar modulando la expresión o el "splicing" de tau, pero existen otros genes candidatos importantes para la función neuronal o relacionados con la función de tau como saitohin, NIK y CRHR1 en esta región, o kinasas implicadas en la fosforilación de tau como GSK-3beta, en otras regiones. OBJETIVOS: Investigar el efecto de polimorfismos y mutaciones de los genes saitohin, CRHR1, región 3'-UTR de tau y GSK-3β sobre el riesgo de desarrollar PSP, y analizar la expresión de CRHR1 en el cerebro de pacientes fallecidos con PSP.METODOLOGÍA: Pacientes con criterios de PSP probable y controles sanos reclutados por la Unidad de Trastornos del Movimiento del Hospital Clínic. Se secuenció la región 3'UTR de tau, diseñando primers específicos, y la región codificante de saitohin en 3 PSP y se genotipó el polimorfismo Q7R en 57 PSP y 83 controles usando métodos previamente descritos. Se secuenció la región codificante de NIK en 3 PSP con métodos previamente descritos y se genotipó el polimorfismo 2839G/C en 40 PSP y 35 controles mediante el enzima de restricción HphI. Se cuantificó la expresión génica de CRHR1 en globus pallidus con PCR a tiempo real en 12 PSP, 10 Alzheimer, 5 pacientes con enfermedad cerebrovascular y 6 controles. Se secuenció la región codificante de CRHR1 en 2 PSP y se genotipó el polimorfismo -16C/T en 40 PSP y 51 controles mediante SSCP. Se genotipó el polimorfismo -50T/C de GSK-3beta en 93 PSP y 125 controles. Los análisis estadísticos se hicieron con el programa SPSS 11.5, usando el test chi-cuadrado para comparar las frecuencias genotípicas y alélicas y el test de Kruskal-Wallis para la comparación de los niveles de expresión génica.RESULTADOS: No se hallaron mutaciones en la región 3'-UTR de tau ni en la región codificante de los genes saitohin, NIK y CRHR1. El genotipo QQ de saitohin fue más frecuente en PSP que en controles (91.2% vs 47%) y cosegregaba con el genotipo CC del polimorfismo G(-221)C del promotor de tau. No se hallaron diferencias entre PSP y controles en la frecuencia genotípica del polimorfismo de NIK. La expresión de mRNA de CRHR1 en globus pallidus fue similar en PSP y el resto de sujetos. El genotipo CC del polimorfismo de CRHR1 fue más frecuente en PSP que en controles (80% vs 53%). El genotipo CC del polimorfismo-50 T/C de GSK-3-betafue algo menos frecuente (p=0.048) y el alelo T más frecuente (p=0.033) en PSP que en controles, y no se detectó interacción con el haplotipo H1/H1.CONCLUSIONES: Nuestros resultados no apoyan que la región 3'UTR de tau presente variantes génicas que puedan explicar el riesgo proporcionado por el haplotipo H1 para sufrir PSP. El genotipo QQ de saitohin y el genotipo CC del polimorfismo de CRHR1 están asociados a PSP en nuestra población y forman parte del haplotipo H1. El gen NIK no está incluído en el haplotipo H1 y no incrementa el riesgo de PSP. La ausencia de mutaciones y de alteración en la expresión génica en ganglios basales no apoya un papel funcional del gen CRHR1 en la PSP. El alelo T del polimorfismo -50T/C GSK-3β está sobrerepresentado en PSP y podría ser un factor de riesgo adicional independiente del haplotipo H1; alternativamente, el genotipo CC podría ser un factor protector. / Progressive supranuclear palsy (PSP) is characterised by abnormal deposition of hyperphosphorylated tau protein in basal ganglia and brainstem. The only known genetic risk factor is the H1 haplotype in the tau gene region, but there are other candidate genes related to tau or neuronal function like saitohin, NIK and CRHR1 in this region or tau-kinases like GSK-3beta in other regions. The aim of this work was to analyse variations of these genes and CRHR1 brain expression in PSP. Patients and controls were recruited by the Hospital Clínic Movement Disorders Unit. Sequencing of tau-3'UTR region and coding region of saitohin were performed in 3 PSP patients, and the Q7R saitohin polymorphism was genotyped in 57 PSP and 83 controls. The coding region of NIK was sequenced in 3 PSP and the 2839G/C polymorphism was genotyped in 40 PSP and 35 controls. CRHR1 gene expression was quantified in globus pallidus using real-time PCR in 12 PSP, 10 Alzheimer, 5 stroke patients and 6 controls. The coding region of CRHR1 was sequenced in 2 PSP and the -16C/T polymorphism was genotyped in 40 PSP and 51 controls. The GSK-3beta -50T/C polymorphism was genotyped in 83 PSP and 125 controls. Genotype and allelic frequencies were compared using the chi-square test and gene expression levels with the Kruskal-Wallis test. No mutations were found. The saitohin QQ genotype and the CRHR1 CC genotype were more frequent in PSP than in controls (91.2% vs 47%; 80% vs 53%), and the NIK genotype frequencies were similar. CRHR1 mRNA expression in globus pallidus was similar in PSP and the rest of subjects. The T allele of the GSK-3polymorphism was more frequent in PSP than in controls (p=0.033), and no interaction was detected with the H1/H1 haplotype. Our results do not support a role of tau-3'UTR and CRHR1 in PSP. The saitohin and CRHR1 polymorphisms are associated with PSP in the context of the H1 haplotype. The NIK gene is not included in the H1 haplotype and does not increase the risk of PSP. GSK-3β genetic variations could be an additional genetic risk factor indepedent of the H1 haplotype.