The mesoderm is the third germ layer, which is formed at gastrulation between the endoderm and the ectoderm in triploblastsc animals (Bilateria). The mesoderm differentiates into muscles, connective tissues and coelomic cavities. These structures have been key evolutionary innovations that prompted the enormous radiation of the bilaterians that at present make up for the 90% of animal species. As such, understanding the evolution of the mesoderm and its derivatives it is pivotal to understand the evolution of animals. In this thesis I have characterized the molecular patterning of the mesoderm and its derivatives (mainly muscles) in two different acoel species: Symsagittifera roscoffensis and Isodiametra pulchra. The acoels belong to the phylum Acoelomorpha (togheter with nemertodermatids and Xenoturbella). The phylogenetic placement of the Acoelomorpha is highly debated between a position basal to the bilaterians or nested inside the deuterostomes. The Acoelomorpha are morphologically simple animals and a trait sometimes considered a direct link to the cnidarians, the Bilateria sister group. With them they the acoelomorphs share a blind gut and a non centralized nervous system. Within the acoelomorphs, the acoels present the most derived body plan, however it is still rather simple if compared to other bilaterians. The nervous system for example is condensed anteriorly but not clear dorso ventral centralization exists as in most of the remaining bilaterians (the nerve cords are distributed circumferentially around the body). The mesoderm only develops from endodermal precursors, and this might be ancestral, since it is thought that the mesoderm evolved from the endoderm of a diploblastic, cnidarian-like ancestor. The muscles are the only mesodermal derivative in most basal acoelomorphs taxa, although in more advanced ones a parenchymal tissue, stem cells, and gonads also occupy the mesodermal space. The embryonic origins of the latter though, are at present still unknown. Thus acoelomorphs present most of traits considered to be eumetazoan ancestral traits (i.e. most of traits are also part of the cnidarians ground pattern), but still that the possibility that their body plan evolved in consequence of a secondary reduction must be considered as they could be more related to other deuterostomes than cnidarians. I have first investigated the molecular architecture of the muscles in the acoel Symsagittifera roscoffensis and found that although they have a smooth ultrastructural aspect they are molecularly more similar to the bilaterian striated muscles given that tey express key genes that control the contraction in the striated cells. This could be considered a first step into the evolution of the striated musculature without fully reaching it. Indeed, cnidarians have smooth epithelio muscular cells likely regulated by the same bilaterian smooth muscle proteins. However, the possibility of a secondary loss of the striation pattern cannot be discarded given that this already happened in some other bilaterians. Second, I have analyzed the expression of bilaterian mesodermal genes during embryogenesis and postembryonic development of Isodiametra pulchra and found that all but one (a FoxA ortholog) are expressed at the anterior pole, the site where the first myocytes start to differentiate. In juveniles and adults these genes are all expressed in muscles or at least a subset of them. Moreover the same genes are expressed in the gonads of I. pulchra and therefore it suggests that they could orginate in the endo-mesoderm of the worm. The cnidarians orthologues of these genes are expressed in the endoderm, which is moreover the site of the gametes differentation. The similarity between cnidarians endoderm and acoels mesoderm are astonishing, however before drawing conclusions we need a solid phylogenetic frame. / Los acelos son unos gusanos, principalmente marinos, de simetría bilateral y aplastados según el eje dorso ventral, que pertenecen al grupo de los acelomorfos (acelos +nemertodermatidos+xenoturbellidos), cuya posición filogenética es tema de debate entre los biólogos evolucionistas. Los acelomorfos carecen de cavidades corporales, su sistema digestivo es ciego y su sistema nervioso consiste de una concentración neuronal anterior y cuerda nerviosas no claramente desplazadas hacía el lado dorsal o ventral. La simplicidad morfológica de los acelos, entremedia entre la de cnidarios y bilaterales superiores, les hace buenos candidatos para el estudio de la transición de animales radiales-diploblastos a bilaterales-triploblastos. En esta tesis se presentan datos sobre el desarrollo e la especificación molecular del mesodermo, que ha sido una de las innovaciones claves para la radiación de los bilaterales. S. roscoffensis que como todos los acelos tiene exclusivamente musculatura de tipo liso, expresa un gen ortólogo a la troponina, un proteína clave para la regulación de los músculos estriados, y que no existe en cnidarios. La explicación más parsimoniosa es que las bases moleculares de evolución de músculos estriados se han implantado en los acelos, aunque estos no hayan alcanzado la condición completa (explicación favorecida si los acelomorfos son confirmados como grupo hermano de los demás bilaterales). Por otra parte se puede considerar esta condición como debida a una reducción secundaria (explicación favorecida en el caso que los acelos se confirmen ser deuteróstomos). Los ortólogos de genes endodermales de cnidarios y con clara expresión mesodermal en bilaterales se expresan en la músculatura del acelo l. pulchra. Estos datos concuerdan perfectamente con la evolución del mesodermo a partir del endodermo de animales diploblásticos. Aun así, es difícil proponer un modelo específico de evolución de miocitos hasta que la posición filogenética de los acelomorfos no esté resuelta.

Els gens estan sotmesos a forces selectives diferents. Un dels objectius de la Biologia Evolutiva és entendre els factors que determinen aquestes diferències. Els gens rarament actuen de manera aïllada, sinó que normalment funcionen com a elements de xarxes complexes formades per un gran nombre de molècules que interactuen entre si. Tot i la rellevància d’aquestes xarxes per entendre l’evolució dels gens, les propietats evolutives d’aquestes xarxes són encara poc conegudes. En aquesta tesi hem estudiat les forces selectives (selecció positiva i negativa) que han actuat sobre els gens implicats en la via de la insulina/TOR, i hem relacionat aquestes forces amb la posició dels gens a la via. Aquest estudi s’ha realitzat en 12 espècies del gènere Drosophila (primer article de la tesi), i en 6 espècies de vertebrats (humà, ratolí, vaca, opòssum, ornitorinc i pollastre) (segon article). A aquests efectes, s’han identificat i anotat els gens implicats a la via en totes les espècies estudiades, s’ha reconstruït la seva història evolutiva mitjançant tècniques d’anàlisi filogenètica, i s’han caracteritzat les forces evolutives que hi han actuat a partir de la relació la divergència no sinònima (dN) i sinònima (dS), ω = dN/dS. Totes les famílies gèniques estudiades tenen almenys un representant a totes les espècies estudiades. A més, tots els gens estudiats estan sotmesos a selecció purificadora, la qual cosa indica que aquests gens són funcionals. Per tant, tots els organismes estudiats presenten una via de la insulina/TOR completa i funcional. Tant a Drosophila com a vertebrats, observem que el nivell de limitació funcional (o selecció purificadora) sota el que evolucionen els gens es correlaciona amb la posició dels gens a la via (mesurada com el nombre de passos des del receptor de la insulina –posició 0– fins la resta de components –posicions 1 a 10), essent els gens de la part downstream els que evolucionen sota un major grau de limitació funcional. El sentit d’aquesta correlació és contrari al que s’ha trobat generalment en rutes metabòliques, on són els gens de la part upstream es que estan sotmesos a un major grau de limitació funcional. Vam avaluar l’impacte d’una sèrie de factors que es correlacionen amb ω (selecció positiva, nivell d’expressió gènica, nombre de teixits en què un gen s’expressa, grau d’esbiaix en l’ús de codons, longitud de les proteïnes codificades, i connectivitat en la xarxa d’interaccions proteïna-proteïna) sobre aquesta correlació. Aquesta anàlisi demostra que la correlació entre la posició a la via i els graus de limitació funcional és independent d’aquests factors. A més, observem que els gens que codifiquen proteïnes que interactuen físicament evolucionen sota seleccions selectives semblants, la qual cosa indica que aquestes proteïnes co-evolucionen. En global, aquests resultats indiquen clarament que els nivells de limitació funcional als què estan sotmesos els gens de la via de la insulina/TOR depenen de la posició que les proteïnes codificades ocupen a la via. Per tant, l’arquitectura de la via té un impacte sobre l’evolució dels seus gens. / Genes are subject to disparate evolutionary forces. One of the goals in Evolutionary Biology is to understand the factors underlying these differences. Genes rarely act in isolation, but they rather operate as elements of complex networks of interacting molecules. Despite the relevance of these networks for understanding gene evolution, the evolutionary properties of these networks remain poorly understood. In this thesis we have studied evolutionary forces (positive and negative selection) that acted on genes involved in the insulin/TOR pathway, and we have related these forces to the position that genes occupy in the pathway. This study has been performed in 12 species of the genus Drosophila, and in 6 vertebrate species. For that purpose, we have (1) identified and annotated the genes involved in this pathway in these species; (2) reconstructed their evolutionary history using phylogenetic analysis; and (3) characterized evolutionary forces that have acted on these genes from the nonsynonymous (dN) to synonymous (dS) divergence ratio (ω = dN/dS). All the studied gene families have at least one representative in all studied species. Furthermore, all studied genes evolve under purifying selection, indicating that they are functional. Therefore, all studied organisms have a complete and functional insulin/TOR pathway. In both Drosophila and vertebrates, we observed that the strength of purifying selection acting on genes correlates with their positions in the pathway, with downstream genes evolving under stronger selective constraint. We evaluated the impact of a number of factors (positive selection, gene expression level and breadth, codon bias, protein length, and connectivity in the protein-protein interaction network) on the observed correlation. This analysis shows that the correlation between pathway position and the strength of purifying selection is independent of these factors. Furthermore, we observed that genes encoding proteins that physically interact evolve under similar selective pressures, which indicates that these proteins co-evolve. Taken together, these results clearly indicate that levels of selective constraint acting on genes of the insulin/TOR pathway are affected by the position that their encoded products occupy in the pathway. Therefore, the structure of the pathway has an effect on the patterns of molecular evolution of its components.

El gènere "Artemisia és un dels més grans, pel que fa a nombre d'espècies, de la família de les Asteraceae i és àmpliament distribuït, principalment a l'hemisferi nord, on ocupa hàbitats molt diversos. Algunes de les seves espècies tenen una gran importància econòmica pels seus usos medicinals, alimentaris i ornamentals entre d'altres. El gènere és força conegut des del punt de vista de la seva composició química, però la manca d'estudis biològics generals sobre el gènere i les relacions entre les seves espècies ha sigut la raó per la qual hem dut a terme aquesta tesi doctoral.Aquest estudi comprèn treballs de filogènia molecular basats en la seqüenciació de regions del DNA nuclear i cloroplàstic, que delimiten el subgènere Dracunculus respecte dels altres quatre subgèneres d'Artemisia i estableixen les relaciones entre les espècies que el formen. Les reconstruccions filogenètiques han servit com a marc de discussió per a la resta d'aproximacions, que comprenen estudis cariològics, citogenètics i palinològics i han permès d'establir hipòtesis sobre la colonització del continent sud-americà. S'han realitzat nombrosos recomptes cromosòmicos, molts cops nous per als tàxons concernits, entre ells el primer en el nivell de ploïdia més alt conegut fins ara en el gènere, 16x. Cal destacar a més l'estudi de la grandària del genoma, que estableix un comportament de saturació en l'augment de la quantitat de DNA nuclear en els poliploides i un límit superior per a aquest paràmetre en el gènere. Els estudis sobre les regions 5S i 45S del DNA ribosòmic, duts a terme amb la tècnica d'hibridació in situ fluorescent (FISH), han suggerit l'existència d'un possible model ancestral per al gènere Artemisia quant a la distribució de l'rDNA. L'evolució del genoma d'aquestes espècies ha d'entendre's com el resultat de nombroses reorganitzacions cromosòmiques i de processos de poliploïdització i d'hibridació. També s'ha realitzat una caracterització morfomètrica i microestructural del pol·len del gènere Ajania, així com d'altres Artemisiinae relacionades. Hem confirmat la coexistència dels dos tipus pol·línics descrits a la subtribu, Anthemis i Artemisia, essent el primer el que caracteriza el gènere Ajania. Amb aquestes dades, i en el marc d'una filogènia de la subtribu, podem suggerir que probablement hi ha hagut un canvi del tipus Anthemis (ancestral) al tipus Artemisia (derivat), fet que troba el suport del canvi de la síndrome de pol·linització, d'entomòfila a anemòfila. / The genus Artemisia is one of the largest of the Asteraceae family. It is widely distributed, mainly in the northern hemisphere, where it occupies very different habitats. Some of the species have economic importance for their medicinal uses, as well as for food and ornamental purposes among others. The genus is well known from the standpoint of their chemical composition, but the lack of general biological studies and the poor knowledge of the relationships among its species has been the reason why we have conducted the present thesis.The present study includes a molecular phylogeny based on nuclear and chloroplast DNA regions, which circumscribes the subgenus Dracunculus within the genus Artemisia, studying in depth the relationships between the species of the subgenus. Other phylogenetic reconstructions have been used as frameworks for discussion in different approaches, including karyological, cytogenetic and pollen studies, allowing us to establish, among others, hypotheses about the colonization of South America. Many chromosome counts have been carried out, often related to new taxa, including the first report of the highest ploidy level in the genus to date, 16x (2n = 144 chromosomes). The thesis also includes the study of genome size. The results obtained seem to indicate that the increase of nuclear DNA amount across ploidy levels follows a saturation behaviour according to the Michaelis-Menten function, and a theoretical upper limit for this parameter is hypothesized for the genus. Studies on 5S and 45S regions of ribosomal DNA, carried out with the technique of fluorescent in situ hybridization (FISH) have suggested the existence of different patterns of rDNA distribution in complexes such as the annual representatives of the genus, the subgenus Dracunculus and in the polyploid species on the genus Artemisia. Genome evolution of these species should be understood as the result of numerous chromosomal rearrangements and processes of hybridization and polyploidization. We have also performed a morphometrical and microstructural characterization of the pollen in the genus Ajania and other related Artemisiinae. We have confirmed the coexistence of the two pollen types described in the subtribe, Anthemis and Artemisia, the former being the one that characterizes the genus Ajania. With these data, and in the context of a phylogeny of the subtribe, we suggest that there has probably been a change from the Anthemis type (ancestral) to Artemisia type (derived), a fact which is also supported by the change in the pollination syndrome from entomophily to anemophily.