Els resultats que es presenten en aquesta memòria aporten informació que ens permet donar un pas més en el coneixement de la regulació transcripcional del gen pfkfb3 i conseqüentment de la via glucolítica.En primer lloc, hem localitzat els elements de resposta de HIF-1 al promotor del gen i hem observat que aquests eren essencials per a la resposta a la hipòxia en cèl·lules de glioblastoma humà (T98G) i en fibroblasts embrionaris de ratolí (mEF). Seguidament, hem corroborat la implicació de la progesterona en la regulació del gen pfkfb3, que inicialment havien descrit Hamilton i col·laboradors {Hamilton, 1997 #93}. Hem posat de manifest l'augment d'expressió d'uPFK-2 i del seu mRNA en cèl·lules de càncer de mama (T47D) incubades amb la hormona. A més a més, hem determinat que aquest increment era degut a l'acció dels receptors de progesterona (PR, progesterone receptors). Hem localitzat una possible seqüència consens per aquests receptors (PRE, progesterone response element) al promotor del gen pfkfb3, però encara no hem pogut demostrar si el paper que exerceix la progesterona en la regulació d'aquest gen és a nivell transcripcional o a nivell d'estabilització del seu mRNA. Per comprovar els resultats obtinguts en cèl·lules aïllades, hem estudiat la regulació del gen pfkfb3 in vivo, utilitzant com a model d'experimentació animal la soca de ratolins C57/BL6. Els hem tractat amb STZ i hem observat l'increment d'expressió del mRNA del gen pfkfb3, d'uPFK-2, i de la concentració de Fru-2,6-P2 en el fetge d'animals diabètics. Paral·lelament, hem realitzat l'estudi de la regulació transcripcional del promotor del gen pfkfb3, in vivo, utilitzant la tècnica de transferència gènica per hidrodinàmia. Els resultats obtinguts demostren l'augment de la transcripció del gen en el fetge dels ratolins diabètics en condicions de dejuni. A més, hem realitzat estudis immunohistoquímics dels fetges diabètics i controls, demostrant que l'expressió del gen pfkfb3 es produeix principalment en els hepatòcits proliferants de la zona perivenosa del fetge dels ratolins diabètics. També hem estudiat les vies de senyalització que porten a l'augment d'expressió del gen pfkfb3, demostrant que la via PI3K/Akt/mTOR (activa en aquestes cèl·lules altament proliferants) hi té un paper essencial. Aquests resultats obtinguts sobre la regulació del gen pfkfb3, juntament amb els que ja s'havien descrit {Hamilton, 1997 #93}; {Chesney, 1999 #96}; {Atsumi, 2002 #110}; {Riera, 2002 #113}; {Minchenko, 2002 #144}; {Riera, 2003 #114}; {Bando, 2005 #102}; {Telang, 2006 #106}, ens confirmen la importància que té el fenotip glucolític en les cèl·lules proliferants o tumorals. El gen pfkfb3 controla la síntesi de la Fru-2,6-P2 que, com s'ha explicat a la introducció, és l'activador al·lostèric més potent de l'enzim PFK-1. Per tant, podem considerar que el gen pfkfb3 és clau per a la regulació de la via glucolítica, de manera que el seu augment d'expressió en diferents tipus de cèl·lules proliferants i tumorals condueix a l'activació d'aquesta via i, conseqüentment, afavoreix el canvi cap a un fenotip glucolític.

D'acord amb el comitè de nomenclatura gènica (HGNC) de l'organització del genoma humà (HUGO), es defineix com a proteïna HERC tota aquella proteïna que conté com a mínim i de forma conjunta un domini HECT i un domini RCC1 like (RLD) en la seva seqüència. En l'actualitat s'han identificat 6 membres per aquesta família de proteïnes d'entre les quals la proteïna HERC1 és la primera que es va identificar i el membre fundador de la família. La identificació d'aquesta proteïna va tenir lloc mitjançant la búsqueda de seqüències oncogèniques humanes a partir de cèl·lules de càncer de mama, i tot i que s'ha observat la seva sobrexpressió en diferents càncers, i que s'ha descrit la seva interacció amb difererents proteïnes involucrades amb processos de tràfic de membrana, a dia d'avui no es coneix encara quina es la seva funció fisiològica. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR. Amb l'objectiu de facilitar aquest estudi vàrem idear en primer lloc un sistema per a l'estudi de proteïnes gegants per PAGE/SDS que al mateix temps ens permetés l'anàlisi de proteïnes amb pesos moleculars menors en un sol gel. Aquest sistema el vàrem anomenar LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel), i consisteix en un gel que combina de forma contínua un gel de poliacrilamida de baix percentatge d'acrilamida (4%) i una proporció menor de l'habitual d'acrilamida:bisacrilamida (80:1) (que permet l'entrada de les proteïnes gegants al gel) amb un gel en gradient del 6 al 15% amb una proporció acrilamida/bisacrilamida de 40:1. Hem comprobat que aquest sistema permet separar proteïnes des de 5 KDa fins a proteïnes gegants en únic gel, amb els avantatges que això comporta pel que fa al estalvi de temps i de reactius. A l'any 2006, en col·laboració amb el nostre laboratori, es va descriure que HERC1 interacciona amb la tuberina (TSC2), una proteïna que juntament amb l'hamarina (TSC1) forma el complex de l'esclerosi tuberosa (TSC). Aquest complex actua com a regulador negatiu de la via de senyalització de mTOR, estimulant l'activitat GTPasa de Rheb a través del domini GAP de TSC2. En aquest treball hem comprovat que HERC1 s'associa als dos components de l'esclerosi tuberosa (tuberina i hamartina) estabilitzant aquest complex. A més a més, hem observat com aquesta interacció té lloc en menor grau amb els mutants de TSC2 identificats en pacients d'esclerosi tuberosa R611Q i R905Q, és independent de la inhibició de la via de señalización de mTOR induïda por dejuni o de la seva activació mitjançant aminoàcids o insulina. En canvi, tot i aquestes interaccions, HERC1 no sembla participar en la fosforilació de proteïnes involucrades en la via de mTOR com les p70 S6K, 4EBP1, Akt o S6, ni tampoc en la regulació del procés de l'autofàgia. En canvi, si que afecta a un altre procés mTOR dependent com és la biogénesi de ribosomes. En aquest sentit hem pogut comprovar mitjançant experiments de silenciació del gen d'HERC1 que la disminució dels nivells d'HERC1 provoca disminucions significatives dels nivells d'ADN ribosomal 18S així com de l'actividad del promotor d'aquest gen.La realització d'experiments d'activació amb aminoàcids per a l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR ens va permetre observar que el tractament amb aminoàcids indueix la fosforilació de una proteïna de 80-90 KDa, però no de la isoforma p70 de la S6K1. Aquesta observació ens va portar a l'estudi de l'activació de la p70 S6K1 en resposta a aminoàcids, observant que en respuesta a aquests nutrients es produeix l'activació de les proteïnes quinasa activades por MAPKs (MKs), RSK y MSK. A més a més, hem vist que l'activació d'ambdues quinases té lloc en resposta a la activació de les MAPKs, Erk o p38, a través d'un mecanisme compensatori en el qual quan la Erk es troba inhibida, l'activació de la RSK i MSK té lloc a través de p38 i viceversa. / According to the Human Genome Organization (HUGO) Gene Nomenclature Committee (HGNC), HERC proteins are defined as those proteins containing both RLD and HECT domains in their amino acid sequence. Currently, six HERC proteins have been identified. The physiological role of HERC1, the founding member of the family, still remains to be clarified. The main objective for this thesis has been the study of HERC1 role in the mTOR signalling pathway. First, we created a new system to study giant and smaller proteins by means of PAGE/SDS in a unique gel. We called it LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel) and is formed by the combination of a low percentage acrylamide gel (4% and a ratio Acrylamide/Bisacrylamide 80:1) and a gradient gel (6-15%, A/B 80:1). This system permits to analyze simultaneously giant and smaller proteins in a unique gel obtaining good separation ressolutions for all proteins and to save time and reactants. It's been described that HERC1 is able to interact with TSC2 (tuberin), a protein which together with TSC1 (hamartin) constitutes the tuberous sclerosis complex (TSC). This complex acts as a negative regulator of the mTOR signalling pathway through the stimulation of Rheb GTPase activity by TSC2 GAP domain. We have proved that HERC1 interacts with both TSC members (tuberin and hamartin) stabilizing it. Furthermore, we have observed that this interaction is lower with TSC2 mutants identified from tuberous sclerosis patients, R611Q and R905Q and is independent of mTOR signalling pathway inhibition by starving or activation by aminoacids or insulin. Despite these interactions, HERC1 isn't involved in the phosphorylation of some mTOR signalling pathway proteins such as p70 S6K, 4EBP1, Akt, S6, nor in the regulation of Autophagy. However, HERC1 is involved in the mTOR dependent process of ribosome biogenesis. We have proved that the HERC1 gene knock down causes a significant decrease of the 18S ribosomal DNA as well as a reduction of the activity of the promoter of this gene.The performance of activation assays with aminoacids in the study of the HERC1 role in the mTOR signalling pathway permitted us to observe that this cell treatment induce the phosphorylation of a 90 KDa protein and a 110 KDa protein, but not the p70 isoform of S6K1. We have seen that these 90 and 110 KDa bands correspond to the kinases activated by MAPKs (MKs), RSK and MSK. Furthermore, we have proved that the activation of both kinases takes place in response of the activation of the MAPKs, Erk or p38 through a compensatory mechanish in which when Erk is not active, the RSK and MSK activation is induced by p38 and viceversa.

Les seqüències són una de les estructures de dades més versàtils que existeixen. De forma relativament senzilla, en una seqüència de símbols es pot emmagatzemar informació de qualsevol tipus. L'anàlisi sistemàtic de seqüències es un àrea molt rica de l'algorísmica amb numeroses aproximacions desenvolupades amb éxit. En concret, la comparació de seqüències mitjançant l'alineament d'aquestes és una de les eines més potents. Una de les aproximacions més populars i eficients per alinear dues seqüències es l'ús de la programació dinàmica. Malgrat la seva evident utilitat, un alineament de dues seqüències no és sempre la millor opció per a caracteritzar la seva funció. Moltes vegades, les seqüències codifiquen la informació en diferents nivells (meta-informació). És llavors quan la comparació directa entre dues seqüències no es capaç de revelar aquelles estructures d'ordre superior que podrien explicar la relació establerta entre aquestes seqüències.Amb aquest treball hem contribuït a millorar la forma en que dues seqüències poden ser comparades, desenvolupant una família d'algorismes d'alineament de la informació d'alt nivell codificada en seqüències biològiques (meta-alineaments). Inicialment, hem redissenyat un antic algorisme, basat en programació dinàmica, que és capaç d'alinear dues seqüències de meta-informació, procedint després a introduir-hi vàries millores per accelerar la seva velocitat. A continuació hem desenvolupat un algorisme de meta-aliniament capaç d'alinear un número múltiple de seqüències, combinant l'algorisme general amb un esquema de clustering jeràrquic. A més, hem estudiat les propietats dels meta-alineaments produïts, modificant l'algorisme per tal d'identificar alineaments amb una configuració no necessàriament col.lineal, el que permet llavors la detecció de permutacions en els resultats.La vida molecular és un exemple paradigmátic de la versatilitat de les seqüències. Les comparaciones entre genomes, ara que la seva seqüència està disponible, permeten identificar numerosos elements biològicament funcionals. La seqüència de nucleòtids de molts gens, per exemple, es troba acceptablement conservada entre diferents espècies. En canvi, les seqüències que regulen la activació dels propis gens són més curtes i variables. Així l'activació simultànea d'un conjunt de gens es pot explicar només a partir de la conservació de configuracions comunes d'elements reguladors d'alt nivell i no pas a partir de la simple conservació de les seves seqüències. Per tant, hem entrenat els nostres programes de meta-alineament en una sèrie de conjunts de regions reguladores recopilades per nosaltres mateixos de la literatura i desprès, hem provat la utilitat biològica de la nostra aproximació, caracteritzant automàticament de forma exitosa les regions activadores de gens humans conservats en altres espècies. / The sequences are very versatile data structures. In a straightforward manner, a sequence of symbols can store any type of information. Systematic analysis of sequences is a very rich area of algorithmics, with lots of successful applications. The comparison by sequence alignment is a very powerful analysis tool. Dynamic programming is one of the most popular and efficient approaches to align two sequences. However, despite their utility, alignments are not always the best option for characterizing the function of two sequences. Sequences often encode information in different levels of organization (meta-information). In these cases, direct sequence comparison is not able to unveil those higher-order structures that can actually explain the relationship between the sequences.We have contributed with the work presented here to improve the way in which two sequences can be compared, developing a new family of algorithms that align high level information encoded in biological sequences (meta-alignment). Initially, we have redesigned an existent algorithm, based in dynamic programming, to align two sequences of meta-information, introducing later several improvements for a better performance. Next, we have developed a multiple meta-alignment algorithm, by combining the general algorithm with the progressive schema. In addition, we have studied the properties of the resulting meta-alignments, modifying the algorithm to identify non-collinear or permuted configurations.Molecular life is a great example of the sequence versatility. Comparative genomics provide the identification of numerous biologically functional elements. The nucleotide sequence of many genes, for example, is relatively well conserved between different species. In contrast, the sequences that regulate the gene expression are shorter and weaker. Thus, the simultaneous activation of a set of genes only can be explained in terms of conservation between configurations of higher-order regulatory elements, that can not be detected at the sequence level. We, therefore, have trained our meta-alignment programs in several datasets of regulatory regions collected from the literature. Then, we have tested the accuracy of our approximation to successfully characterize the promoter regions of human genes and their orthologs in other species.

La metabolòmica ha adquirit recentment un gran interès gràcies al gran ventall d'aplicacions que presenta, que l'han convertit en una eina clau en diferents camps com la diagnosi de malalties, el seguiment de tractaments farmacològics i l'estudi de les interaccions entre diferents sistemes. A més, juntament amb la genòmica i la proteòmica, ha permès l'assignació de nombroses funcions genètiques i enzimàtiques.L'objectiu de la present tesi doctoral és una aplicació de diferents tècniques analítiques com LC-MS/MS, GC-MS, o NMR a l'estudi dels metabòlits de cinc espècies vegetals amb uns objectius concrets en cadascuna. En cada cas s'ha seleccionat la tècnica més adequada segons la naturalesa dels metabòlits a estudiar i el tipus d'objectiu plantejat. Existeix una gran varietat de metabòlits secundaris a les plantes, però aquest treball s'ha centrat, particularment, en l'estudi dels compostos fenòlics i els alcaloides (concretament els alcaloides de les Amaryllidaceae), ja que constitueixen dos tipus de metabòlits d'especial rellevància. D'una banda, tenen una gran importància biològica en les plantes, i de l'altra, gràcies a la seva activitat farmacològica, poden exercir nombrosos efectes beneficiosos que poden ser de gran interès en l'elaboració de fàrmacs o bé en el camp de l'alimentació.Dins la gran varietat d'aplicacions de la metabolòmica, la present tesi ha abordat els següents aspectes:1)Estudi de l'activitat antioxidant del material de rebuig del lavandí (Lavandula x intermedia Emeric ex Loiseleur) després de la destil·lació dels seus olis essencials, i identificació dels compostos fenòlics responsables d'aquesta activitat. Es va avaluar el contingut total en compostos fenòlics, així com l'activitat antioxidant, de diferents fraccions mitjançant diferents mètodes, i es van identificar un total de 23 compostos fenòlics per LC-MS/MS en les mateixes fraccions. D'aquesta manera es pretén proposar aquest material de rebuig com a nova font d'obtenció d'antioxidants naturals que, a més, suposaria el reciclatge d'aquest material.2) Estudi del paper dels compostos fenòlics en la resposta de les plantes davant l'estrès abiòtic i la senescència, mitjançant la identificació i comparació qualitativa i quantitativa d'aquests metabòlits, a través de la tècnica de LC-MS/MS en diferents mostres de plantes de tabac i d'Arabidopsis thaliana.3) Aïllament, identificació i caracterització per tècniques de NMR de flavonoides de Crinum humile, espècie vegetal de la família Amaryllidaceae poc coneguda del Camerun, amb possible activitat farmacològica.4) Identificació, per GC-MS, dels alcaloides de les Amaryllidaceae de Pancratium canariense, espècie poc estudiada en termes de composició química, amb especial atenció a la possible detecció de nous derivats de la galantamina, alcaloide amb activitat anticolinesteràsica, utilitzat en el tractament de la malaltia de l'Alzheimer.El present treball de tesi no pretén, però, ser una anàlisi metabolòmica completa d'un seguit de plantes, sinó una contribució a la metabolòmica, una petita mostra de la gran varietat de possibilitats de la seva aplicació, i una aportació d'una sèrie de resultats que poden ser útils tant en el camp de la recerca de la bioquímica vegetal, com en el camp de la farmacologia i la fitoquímica. / Metabolomics has recently received much interest owing to its wide range of applications, and has become a key strategy in different fields such as disease diagnostics, clinical trial monitorization, toxicity assessment or systems-biology studies. Furthermore, together with genomics and proteomics, metabolomics has led the assignment of several enzyme and gene functions.The present PhD thesis aims to apply different analytic techniques and strategies such as LC-MS/MS, GC-MS or NMR to study the metabolites from five plant species, with specific objectives in each case. Each analytic technique was selected according to the type of metabolites that were object of study and the specific aim proposed. From the great variety of secondary metabolites in plants, this work has particularly studied phenolic compounds and alkaloids (specifically the Amaryllidaceae alkaloids).Among the wide range of metabolomics applications, this thesis has focused on the following objectives:1) Investigation of the phenolic composition of lavandin (Lavandula x intermedia Emeric ex Loiseleur) waste obtained after the distillation of essential oils for the perfume industry to find an alternative use for this material as a new source of natural antioxidants. The antioxidant activity of different fractions as well as their total phenolic content were evaluated by different methods. A total of twenty-three phenolic compounds were identified by LC-MS/MS. 2) Study of phenolic compounds behaviour in plant response to abiotic stress and senescence by identifying and quantifying these metabolites by LC-MS/MS in different samples of tobacco and Arabidopsis thaliana.3) Isolation and identification by NMR of flavonoids from Crinum humile, a plant species of unknown chemical composition.4) Identification by GC-MS of Amaryllidaceae alkaloids from Pancratium canariense, with special attention to the detection of new galantamina derivatives, an alkaloid used in Alzheimer therapy.

El càncer colorectal és una malaltia genètica que afecta principalment als països desenvolupats. A les fases inicials del desenvolupament del tumor es formen adenomes benignes, que amb el temps poden adquirir una estructura més desorganitzada formada per cèl·lules displàsiques, i al final evolucionar cap a tumors malignes. El càncer de còlon i recte és el resultat d'un procés gradual d'adquisició de noves característiques per part de les cèl·lules epitelials que permeten escapar dels controls cel·lulars i de l'ambient. L'acumulació de múltiples alteracions genètiques i epigenètiques són les responsables d'aquests canvis.En la present tesi ens hem centrat en l'estudi de 50 casos de càncer colorectal esporàdics en estadis de Dukes B i C. La classificació de Dukes està associada a una supervivència diferent, i és en aquest subconjunt de casos on la determinació del pronòstic és més incerta, pel que l'anàlisi d'aquest conjunt de mostres ens pot permetre trobar nous factors de pronòstic útils. Partint de biòpsies humanes la quantitat de material és limitada, per això vam escollir dues aproximacions globals que requereixen poc material i que generen un gran voulm de resultats: l'anàlisi d'alteracions genòmiques per CGH (Comparative Genomic Hybridization) i l'anàlisi d'expressió gènica mitjançant microarrays. El nostre objectiu era obtenir una classificació en subgrups dels 50 tumors per donar explicació al comportament diferencial i buscar factors de pronòstic específics de grup.En base als resultats de CGH vem trobar 9 casos sense cap alteració (18%), i 41 amb algun braç de cromosoma alterat (82%). De mitjana hi ha 8,8±6,3 alteracions per cas. El rang de variació va de 0 fins a 20 alteracions. Definim com a alteracions recurrents aquelles que apareixen en més d'un 15% dels casos. Totes elles s'han descrit anteriorment en el càncer colorectal i ens ajuden a definir el perfil d'aquest tipus de tumor. Les alteracions més comuns són: +20q (74%), -18q (66%), -17p (48%), +13 (44%), -18p (40%).A l'hora d'agrupar les mostres hem encaixat els nostres resultats amb els grups que va definir Dutrilleaux (1995) per la seva semblança, i al nostre criteri, la seva coherència. Definim així quatre grups: el que presenta inestabilitat de microsatèl·lits (6%), el grup Normal sense alteracions cromosòmiques (16%), el grup d'Inestabilitat Cromosòmica Monosomic Like (44%), i el grup d'Inestabilitat cromosòmica Restant (34%). La classificació dels tumors en funció del patró d'alteracions cromosòmiques és poc útil com a factor pronòstic directament, però sí que permet identificar factors de pronòstic específics de grup. Per exemple, el nombre d'alteracions cromosòmiques és un factor de pronòstic important dins del grup d'Inestabilitat Cromosòmica Monosomic Like. També vam trobar que pèrdues al braç 12p i guanys al braç 11q són indicadors de mal pronòstic en càncer colorectal.En l'anàlisi d'expressió gènica diferencial per microarrays vam seleccionar 128 gens que presenten una major variabilitat entre les 50 mostres. A partir de la informació d'aquests genes i mitjançant agrupaments jeràrquics hem identificat quatre grups de tumors: El primer, format per 22 casos, té una supervivència lliure de malaltia bona, a diferència d'un segon, format per 18 casos, que és dolenta. Els dos grups restants estan formats per molt pocs casos (4 i 6 respectivament). Paral·lelament, mitjançant l'anàlisi de components principals vam definir noves variables anomenades metagens. Aquests són combinacions linials de gens que agrupen aquells que tenen un mateix comportament, disminuint així el nombre de variables per resumir la informació redundant. D'aquesta manera hem pogut identificar metagens que ens ajuden a discriminar la supervivència.RESUMENEn la presente tesis hemos estudiado 50 casos de cáncer colorectal esporádico en estadío de Dukes B y C. Al partir de biopsias humanas la cantidad de material es limitada, por ello escogimos dos aproximaciones globales: la CGH (Comparative Genomic Hybridization) y el análisis de la expresión mediante microarrays. Nuestro objetivo era explicar el comportamiento del conjunto de las 50 muestras mediante la clasificación en subgrupos para buscar nuevos factores de pronóstico específicos de cada grupo.Los resultados de la CGH se resume de la siguiente manera: de los 50 casos estudiados, hay 9 casos sin ninguna alteración (18%), y 41 con algún brazo de cromosoma alterado (82%). De promedio tenemos 8,8 alteraciones por caso, con una desviación estándar de 6,3. El rango de variación es de 0 a 20 alteraciones por caso. Las alteraciones más frecuentes son: +20q (74%), -18q (66%), -17p (48%), +13 (44%), -18p (40%). Con el objetivo de agrupar las muestras hemos seguido la clasificación de Dutrilleaux (1995) por su coherencia. Hemos definido así cuatro grupos: el que presenta inestabilidad de microsatélites (6%), el grupo normal sin alteraciones cromosómicas (16%), el grupo de inestabilidad cromosómica monosomic like (44%), y el grupo de inestabilidad cromosómica restante (34%). Hemos visto que la clasificación de los tumores en función del patrón de alteraciones cromosómicas es poco útil como factor pronóstico directamente, pero sí permite identificar factores de pronóstico específicos de grupo. Por ejemplo, el número de alteraciones es un factor de pronóstico importante en el grupo de inestabilidad cromosómica monosomic like. A su vez, identificamos seis regiones amplificadas: 20q33, 11q13, 8q24, 5q31-q33, 10q22, i 1p36.Por otro lado, a partir de la expresión de 128 genes que presentan una mayor variabilidad entre las 50 muestras hemos identificado un grupo de genes que se sobreexpresa y otro que se infraexpresa. Con estos mismos genes y utilizando agrupaciones jerárquicas hemos identificado cuatro grupos: dos de ellos formados por muy pocos casos (4 y 6 respectivamente), y los dos restantes con un pronóstico opuesto. Uno formado por 22 casos, tiene una supervivencia buena, y el otro, formado por 18 casos, mala. Mediante análisis de componentes principales hemos definido nuevas variables denominadas metagenes. Éstos son combinaciones lineales de genes que agrupan aquellos que tienen un mismo comportamiento, disminuyendo de este modo el número de variables para resumir la información redundante. Así hemos identificado cuatro metagenes que nos ayudan a discriminar los casos según su supervivencia.

El treball realitzat durant el meu doctorat ha estat dirigit a entendre millor l'organització i l'evolució de les regions de DNA que regulen la transcripció. En concret els objectius d'aquesta tesi són: (1) millorar els mètodes in silico de caracterització, representació i predicció de llocs d'unió de factors de transcripció; (2) estudiar les restriccions que actuen sobre la conservació evolutiva de les seqüències reguladores de la transcripció; (3) estudiar l'efecte de la duplicació gènica sobre l'evolució de les seqüències reguladores de la transcripció i sobre l'expressió gènica.El primer capítol, presenta el desenvolupament del programa PROMO, per predir llocs d'unió de factors de transcripció (TFBSs) en una seqüència de DNA o en un conjunt de seqüències. Per una espècie determinada o un determinat nivell taxonòmic, PROMO construeix matrius de pes a partir de seqüències de TFBSs coneguts que són utilitzades per fer la predicció. La predicció simultània sobre múltiples seqüències permet descobrir elements de regulació comuns i es pot aplicar, per exemple, per a comparar regions reguladores de gens ortòlegs o de gens que s'expressen en el mateix teixit. En el segon capítol es presenta l'estudi en que vàrem demostrar la hipòtesi de que el nombre de teixits en que un gen s'expressa està relacionat de manera significativa amb el grau de conservació de la seqüència del promotor. Mostrem que els gens housekeeping de mamífers, els que s'expressen en tots o gairebé tots els teixits, tenen una menor conservació de la seqüència del promotor que els gens que s'expressen en un subconjunt de teixits. El tercer i darrer capítol presenta un estudi sobre l'efecte de la duplicació gènica sobre l'evolució de les seqüències reguladores de la transcripció. S'han fet molts estudis sobre l'efecte de la duplicació gènica sobre la divergència de les seqüències proteiques, però poc es coneix de com aquest procés afecta l'evolució de les seqüències reguladores de l'expressió gènica. En aquest treball hem trobat que el nombre de duplicacions gèniques mostra una relació positiva amb la divergència del promotor, la taxa de substitucions no-sinònimes de la seqüència codificant i la divergència de l'expressió tissular. Per tant, la duplicació gènica no només condueix a un increment de les mutacions aminoacídiques, sinó a una acceleració de la divergència de seqüències involucrades en la regulació de l'expressió gènica. / Goal of this thesis is to better understand the organization and evolution of DNA regions that regulate gene transcription. Particular aims are: (1) to improve in silico methods of characterization, representation and prediction of transcription factor binding sites; (2) to study the constraints that affect the evolutionary conservation of transcription regulatory sequences; (3) to study the effect of gene duplication on the evolution of transcription regulatory sequences and gene expression.The first chapter describes the development of PROMO, a software program to predict transcription factor binding sites (TFBSs) in DNA sequences using species-tailored positional weight matrices. Simultaneous prediction on multiple sequences can be applied to discover common regulatory elements in promoters of orthologous genes or co-expressed genes.In the study presented in the second chapter, the hypothesis that the number of tissues in which a gene is expressed is related in a significant manner to the extent of promoter sequence conservation is tested. It is shown that mammalian housekeeping genes, those expressed in all or nearly all tissues, have lower promoter sequence conservation than genes expressed in a subset of tissues.The third and final chapter presents a study about the effect of gene duplication on the evolution of transcription regulatory sequences. Many studies have been carried out on the effect of gene duplication on protein sequence divergence, but little is known of how this process affects the sequences that regulate gene expression. It is shown here that gene duplication is associated with increased protein sequence divergence, increased promoter sequence divergence, and increased tissue expression divergence. Therefore, gene duplication drives not only an increase in amino-acidic mutations but also an acceleration of divergence of DNA sequences involved in the regulation of gene expression.

En les bactèries entèriques, les proteïnes de la família Hha/YmoA juguen un paper important en la regulació de l'expressió genica en resposta a factors ambientals. La proteïna Hha d'Escherichia coli fou identificada com a regulador de l'expressió de la toxina α-hemolisina. Ja ha estat prèviament descrit que la proteïna Hha interacciona amb la proteïna H-NS i que el complex nucleoproteic format és responsable de la termoregulació de l'expressió de l'operó hly d'E. Coli.També ha estat descrit que E. Coli i altres enterobactèries contenen una proteïna paràloga a H-NS, la proteïna StpA. Aquesta proteïna s'expressa molt poc en condicions normals, però s'indueix en mutants hns. La sobreexpressió de StpA suprimeix parcialment molts dels fenotips causats per la mutació hns.En aquesta tesi s'ha identificat en el genoma d'E.coli el gen ydgT, que codifica per a una proteïna amb elevada homologia amb proteïnes de la família Hha/YmoA. Aquesta nova proteïna paràloga a Hha (38% d'identitat i 68% de similitud), té un comportament similar a StpA en el context d'H-NS: es sobre-expressa en mutants hha i pot compensar, almenys parcialment, el fenotip hemolític provocat per la mutació hha.A mes també hem demostrat que la proteïna YdgT es capaç d'interaccionar tant amb H-NS com amb StpA, per tal de formar complexes hetero-dimèrics in vivo. En canvi, la proteïna YdgT no interacciona amb la seva proteïna paràloga Hha.En aquesta memòria també s'ha establert una xarxa de regulacions creuades entre les proteïnes Hha, YdgT, H-NS i StpA. Les mutacions hha i/o hha ydgT provoquen una disminució dels trànscrits d'hns i stpA. Ha estat analitzat l'efecte en el patró d'expressió proteica de les mutacions hha, ydgT i hha ydgT. Els resultats obtinguts mostren el fenotip pleiotròpic del doble mutant. Hem estat capaços de detectar diverses diferencies i hem identificat algunes de les proteïnes que mostren expressió diferencial entre les diferents soques estudiades: OmpA, OmpC, Triptofanasa, dTDP-L-ramnosa sintetasa, proteïna precursora de la proteïna periplasmàtica d'unió a D-ribosa. Aquestes proteïnes, entre d'altres funcions, juguen un paper important en la conjugació, osmo-regulació, formació de biofilms, formació de LPS i quimiotaxis, respectivament.

En bacteris entèrics, les proteïnes de la família Hha/YmoA estan implicades en la regulació de l'expressió gènica depenent factors ambientals. Ha estat descrit que la proteïna Hha d' Escherichia coli interacciona amb la proteïna H-NS formant un complex amb el DNA responsable de la termoregulació de l'expressió de l'operó hly d' E. coli. Altres proteïnes d'aquesta família, com YmoA i YdgT, també interaccionen amb la proteïna H-NS.La proteïna H-NS d' E. coli és una proteïna associada al nucleoide implicada en la regulació global de l'expressió gènica en funció de les condicions ambientals. H-NS es troba àmpliament distribuida entre bacteris Gram-negatius.El primer objectiu va ser determinar si la participació conjunta de les proteïnes Hha i H-NS era extensible a altres gens regulats per H-NS. Escollirerm l'operó bgl, silenciat per la proteïna H-NS. Mitjançant mesures de l'activitat i de la trasncripció de l'operó vam concloure que les proteïnes Hha i YdgT intervenen en el silenciament de l'operó bgl d'Escherichia coli.Es va analitzar la regulació de l'expressió gènica depenent de les proteïnes Hha i H-NS en diferents condicions d'osmolaritat per identificar les proteïnes diferencialment expressades. S'identificaren les proteïnes HdeA, l'expressió de la qual ja havia estat descrita com a regulada per H-NS; i HtrA, una proteasa sotmesa a osmoregulació. El complex Hha-H-NS és responsable de la repressió de l'expressió d'HtrA a baixa osmolaritat.En la seqüència completa del plàsmid R27 s'han identificat dos gens (orf182 i orf164) que codifiquen dues proteïnes homòlogues a Hha i H-NS, respectivament. Ja que la conjugació d'aquest plàsmid està sotmesa a termoregulació, i donat que les proteïnes Hha i H-NS estan implicades en la regulació de l'expressió gènica depenent de paràmetres ambientals, es va voler determinar: · A) el paper d'aquestes proteïnes, d'origen plasmídic i d'origen cromosòmic, en la regulació de la conjugació de R27,· B) i la intervenció de les proteïnes de codificació plasmídica en la fisiologia de la cèl·lula portadora del plàsmid. Es realitzaren estudis de la freqüència de conjugació del plàsmid, estudis de la transcripció dels gens de transferencia mitjançant microxips i RT-PCR, assaigs de retard en gel amb les proteïnes Hha i H-NS i observació de pilis per MET. Es va concloure que les proteïnes Hha i H-NS, tant de codificació plasmídica com cromosòmica, interven en la termoregulació de la conjugació del plàsmid, reprimint l'expressió dels gens de transferencia a elevada temperatura. En estudis de complementació s'observà que les proteïnes codificades als gens orf182 i orf164, compensen alguns fenotips causats per les mutacions dels gens hha i hns. Es va demostrar també la interacció in vitro de la proteïna H-NS plasmídica (ORF164) amb la proteïna Hha cromosòmica.Finalment, es va realitzar una anàlisi trancriptòmica de l'efecte de les mutacions hns i hha ydgT en el patró d'expressió gènica a Escherichia coli, per determinar quins gens estaven afectats en cada fons genètic i establir la relació entre la regulació per H-NS i per Hha/YdgT. La comparació dels patrons d'expressió entre la soca hns i la soca salvatge, han posat de manifest que un 7% dels gens d'E. coli presenten una alteració significativa de la seva expressió, i que un 68% dels casos corresponen a una sobreexpressió en la soca hns. L'analisi de l'expressió diferencial entre la soca hha ydgT i la soca hns demostra que la regulació de la soca hha ydgT segueix majoritàriment el mateix patró d'expressió que la soca salvatge. Es van identificar 22 gens amb expressió diferencial entre la soca hha ydgT i la soca salvatge, dels quals 18 presenten sobreexpressió en un fons genètic hha ydgT, i 12 coincideixen amb els gens regulats per H-NS. / In enteric bacteria, the proteins of Hha/YmoA family play an important role in regulation of gene expression in response to environmental signals. On another part, the nucleoid-associated protein H-NS is a relevant example of a global modulator. H-NS binds to Hha, and other proteins of Hha/YmoA family, to regulate gene expression depending on environmental conditions.The first goal was to determine if Hha and H-NS participate together regulating genes known as regulated by H-NS, like "bgl" operon silenced by H-NS, or other new genes in different osmolarity conditions. We conclude that Hha play a role in silencing "bgl" operon expression in "E. Coli" and that Hha-H-NS complex is responsible for the HtrA repression at low osmolarity.R27 plasmid code two proteins homologous to Hha and H-NS, respectively. Since R27 conjugation is thermoregulated, and given the fact that Hha and H-NS regulate gene expression depending on environmental parameters, we investigated the role of these proteins, in thermoregulation of R27 conjugation. We conclude that Hha and H-NS, of plasmidic and chromosomic origin, downregulate plasmid conjugation at high temperature. As well, we studied the intervention of Hha and H-NS R27 encoded proteins in the physiology of R27 host cells. We observed that these proteins compensate some of the phenotypes caused by hha and hns mutations.Finally, a transcriptomic analysis of the effect of the mutations "hns" and "hha ydgT" in "E. coli"i was carried out to establish the relationship between H-NS and Hha/YdgT regulation. The result showed that 7% of genes were affected by "hns" mutation and that 68% of these cases corresponds to an overexpression in hns strain. The analysis of "hha ydgT" strain demonstrates that its regulation follows mostly the same pattern of expression than the wild type strain, because "hha ydgT" mutations only affected 22 genes.

La tasa de proliferación celular resulta de un balance entre varios procesos celulares: mitosis, diferenciación celular y la muerte celular apoptótica. La regulación de este balance es fundamental durante el desarrollo embrionario, la regeneración celular y el envejecimiento, así como en distintos procesos degenerativos y patológicos. Recientemente se ha clonado un gen, designado Zac1, el cuál codifica un factor de transcripción que regula la apoptosis y el paro del ciclo celular, mediante vías independientes. Se ha determinado que en ratones adultos Zac1 se expresa en la glándula pituitaria, en el cerebro, y en distintos tejidos periféricos, así como en el tubo neural de embriones de ratón con 9 días. Distintos estudios han demostrado que Zac1 está implicado en el desarrollo tumoral, en la diabetes mellitus neonatal transitoria, en la activación y/o represión de receptores nucleares, en la coactivación de la vía apoptótica p53/Apaf-1, etc. Sin embargo, su función en el sistema nervioso central es aún desconocida.La presente tesis tiene como objetivo general, determinar el papel de Zac1 en el sistema nervioso central del ratón. En este sentido, se determinó el patrón de expresión de Zac1 durante el desarrollo embrionario del neuroectodermo y mesodermo, así como, durante la maduración del sistema nervioso central (mediante técnicas de hibridación in situ e inmunohistoquímicas). Además, se caracterizó el fenotipo de las poblaciones celulares que expresan Zac1 durante el desarrollo. En el desarroollo del neuroectodermo, los resultados obtenidos muestran que Zac1 se expresa en las células madre/progenitoras del sistema nervioso central, tanto en desarrollo como en el animal adulto (zonas germinativas). Su expresión en células diferenciadas se restringe a subpoblaciones neuronales de naturaleza GABAérgica y catecolinérgica. En el desarrollo del mesodermo, los resultados revelaron que Zac1 se expresa durante todas las fases del ciclo de vida de los condrocitos (condrogénesis) y del desarrollo de las células musculares (miogénesis), sugiriendo que Zac1 puede jugar un papel importante en el desarrollo del esqueleto y del músculo esquelético.Por otra parte, se estudió el papel de Zac1 en el sistema nervioso central, analizando el fenotipo neural de los ratones mutantes para Zac1, y estudiando el papel de Zac1 en los procesos neurodegenerativos asociados con la muerte celular apoptótica. Los animales mutantes para Zac1 presentan tasas de proliferación neural superiores a la de los animales salvajes, reforzando el papel de Zac1 en el control de la tasa de proliferación celular (ciclo celular y apoptosis). Además, los resultados obtenidos muestran que la expresión regional de Zac1 es imprescindible para la selección y/o diferenciación de distintos progenitores neurales (tales como en los oligodendrocitos, las neuronas, los astrocitos, etc). En los modelos neurodegenerativos, los resultados obtenidos muestran que Zac1 es imprescindible para activar los procesos apoptóticos que conducen a la fragmentación del DNA, apuntando a su implicación en las fases tempranas de la activación de las cascadas apoptóticas.Por tanto, los novedosos resultados obtenidos en este trabajo de tesis abren distintas líneas de enfoque sobre el papel de zac1 en el sistema nervioso central, concretamente en los procesos de proliferación y diferenciación celular, en los procesos apoptóticos y en los mecanismos de plasticidad neural que ocurren durante el desarrollo temprano del organismo, así como, tras la activación neural que se desarrolla en los procesos de neurodegeneración. / The proliferative rate results from a balance between cell division (mitosis), cell differentiation, and programmed cell death (apoptosis). Controlling this balance is fundamental during embryonic development, tissue regeneration, and aging, as well as in neurodegenerative process. In 1997, Spengler and collaborators cloned Zac1, a new zinc-finger transcription factor induces the cellular cycle arrest and the apoptosis, by means of independent routes, like p53. Zac1 is high expressed in the pituitary gland and in some brain areas. However, their role in the central nervous system had not been studied. In this way, this work, we study the pattern of expression of Zac1 during the maturation of the central nervous system (Valente and Auladell, 2001), as well as during the early development of neuroectoderm and mesoderm (Valente et al., 2005), in mice. In addition, we characterized these neural populations that express Zac1 during the development, demonstrating that initially (embryonic and postnatal mice) its expression is strong in neural cells with high mitotic activity (progenitors and stem cells) and later (adult mice) in interneurons of the GABAergic system. These results took to us to analyze if the strong expression of Zac1 in the central nervous system would be related to its apoptotic function. In this way, our results in neurodegenerative processes, as much in normal mice (Valente et al., 2004) as in mutant mice for Zac1 (Valente et al., 2005; results in preparation), show that although the expression of Zac1 is important in the induction of the apoptosis, is not their main function in the development and maturation of central nervous system, suggesting that Zac1 more would be implied in controlling the cellular cycle that in inducing the apoptosis. Moreover, a detail immunohistological study of the Zac1 mutant mice brain shows that the expression of Zac1 is important for the differentiation of the oligodendrocytes, interneurons and astrocytes, and suggest an important role of Zac1 in the differentiation and/or selection process of the progenitors/stem cells of the nervous system.

El objetivo de este trabajo ha sido el estudio de dos factores genéticos implicados en la diferenciación de las neuronas GABAérgicas de proyección estriatales: Nolz1 e Ikaros. Además se ha estudiado el potencial de estos factores de transcripción en la diferenciación de células madre neurales in vitro hacia un fenotipo estriatal para entender mejor los mecanismos que regulan la aparición de este tipo de neuronas.Hemos demostrado que Nolz1 es un gen que interviene en la especificación de los precursores neurales de la SVZ de la eminencia ganglionar lateral (LGE), los llamados progenitores basales. Las células Nolz1 positivas provienen de precursores positivos para Gsh2, y su expresión contribuye a la aparición de la señalización de ácido retinoico en el núcleo estriado durante el desarrollo. Nolz1, además, regula la vía de Notch en precursores neurales i promueve la aparición de precursores oligodendrogliales mediante un mecanismo no autónomo en la LGE. Por otra parte, demostramos que la isoforma de Ikaros Ik1 es esencial para la correcta generación de las neuronas encefalinérgicas estriatales a partir de la diferenciación de precursores neurales Dlx2 positivos de la LGE. Mostramos que Ik1 es necessario para sacar de ciclo los precursores que formarán el núcleo estriado mediante el incremento de los niveles del inhibidor de ciclinas p21. En consonancia con esta observación, la falta de Ikaros durante el desarrollo, afecta la neurogénesis tardía en el estriado. Esto se traduce en que el animal deficiente de Ikaros presenta un núcleo estriado más pequeño debido a una disminución en el número de neuronas de proyección encefalinérgicas de la matriz. Así, Nolz1 e Ikaros intervienen en diferentes momentos del desarrollo estriatal, siendo el papel de Nolz1 anterior y centrado en el control de precursores neurales, y el de Ikaros algo posterior, centrado en la diferenciación de neuronas estriatales de proyección encefalinégicas / The main goal of this work has been the study of two genetic factors implied in the differentiation of the striatal GABAergic projection neurons: Nolz1 and Ikaros. Moreover, we have studied the potential of these transcription factors to direct the differentiation of neural stem cells in vitro towards a striatal phenotype, in order to understand some aspects of the generation of this kind of neurons.We have demonstrated that the action of Nolz1 is involved in the specification of the neural precursors which reside in the SVZ ol the lateral ganglionic eminencie (LGE), the so-called basal progenitors. The cells positive for Nolz1 come from Gsh2 positive neural precursors, and its expression contributes to the inititation of a source of retinoic acid signalling within the striatum during development. Nolz1, in addition, regulates the Notch pathway in neural precursors an promotes the appearance of oligodendrocyte precursors in the LGE by a non-autonomous mechanism. On the other hand, we demostrate that the Ikaros isoform Ik1 is essential for the correct generation of the striatal enkephalinergic neurons from the differentiation of Dlx2 positive neural precursors of the LGE. We show that Ik1 is necessary for the cell-cycle exit of the neural precursors which will populate the striatum by the increase of the cyclin inhibitor p21. According with this observation, Ikaros absence during development specifically affects late striatal neurogenesis.This is translated in the adult Ikaros deficient animal in a reduced striatum due to a reduced number of matrix enkephalinergic projection neurons. Thus, Nolz1 and Ikaros exhert its actions during different times in striatal development, being Nolz1 role earlier and focused in the control of neural precursors, and Ikaros role occurs later, focused in the differentiation of the enkephalinergic projection neurons.