Antecedents La prevenció primària de l'adenocarcinoma ductal de pàncrees (ADP) està limitada per la falta de coneixement sobre la seva etiologia. El factor de risc més ben establert és el consum de tabac, però explica només una petita proporció de casos. Es discuteix el paper d'altres factors etiològics com els antecedents patològics de diabetis i pancreatitis, la dieta, determinades exposicions ambientals o laborals, i els factors hereditaris. Mutacions puntuals en l'oncogèn K-ras, i la seva conseqüent activació, són presents en més del 80% dels casos d'ADP; és un dels esdeveniments genètics fonamentals perquè el càncer tingui lloc. L'activació d'aquest oncogèn dóna lloc a gran varietat de respostes, des de l'augment de la proliferació cel·lular fins a la inhibició de l'apoptosi, en funció del context cel·lular. Els gens Ras són dianes crítiques per als carcinògens químics; els càncers de pàncrees amb i sense mutacions en l'oncogèn K-ras probablement es desenvolupen a partir de diferents interaccions gen-ambient. Tot i això, els estils de vida i les exposicions ambientals que poden influir en la presència de mutacions en el gen K-ras són pràcticament desconeguts. L'objectiu general d'aquesta tesi és estudiar la relació entre la prevalença de mutacions en el codó 12 de l'oncogèn K-ras i diferents factors ambientals (consum de tabac i alcohol), clínics (antecedents patològics) i genètics (polimorfismes en el gen CYP1B1), en pacients amb ADP. Metodologia La tesi s'emmarca en el projecte PANKRAS II, un estudi multicèntric prospectiu sobre el paper de les mutacions en l'oncogèn K-ras i altres alteracions genètiques en el diagnòstic, el pronòstic i l'etiologia del càncer de pàncrees exocrí. Es van reclutar 602 pacients procedents de 5 hospitals generals del nord-est de la península ibèrica amb patologies relacionades amb el pàncrees, dels quals 185 eren pacients amb ADP. Es va entrevistar personalment més del 85% dels pacients per obtenir informació sociodemogràfica, clínica (antecedents patològics i història familiar de càncer) o sobre els seus estils de vida (dieta, ocupació o hàbits tòxics); paral·lelament es van revisar les històries clíniques d'aquests pacients. Finalment es van realitzar anàlisis moleculars de gens implicats en el procés de carcinogènesi pancreàtica (K-ras, TP53, p-16/CDKN2, SMAD4/DPC4, BRCA2 o CFTR). L'anàlisi de l'associació entre la prevalença de mutacions en l'oncogèn K-ras i els diferents factors clínics, ambientals i genètics s'ha realitzat mitjançant regressió logística no condicional. Resultats i discussió Tot i que el consum de tabac és el factor de risc més ben establert i les mutacions en l'oncogèn K-ras un esdeveniment fonamental en l'etiologia de l'ADP, els nostres resultats mostren que no existeix associació entre ambdós factors. Els carcinògens del tabac presents en el teixit pancreàtic, les nitrosamines, serien les responsables d'alteracions en gens que intervenen en estadis més tardans del desenvolupament del càncer; alhora, altres carcinògens del tabac amb capacitat per activar K-ras, com els hidrocarburs aromàtics policíclics, no tindrien el pàncrees com a òrgan diana. Els carcinògens del tabac intervenen en la carcinogènesi pancreàtica per vies alternatives a l'activació de K-ras. El gen citocrom P4501B1 (CYP1B1) codifica un enzim metabolitzador de carcinògens i estrògens amb un rol important en la bioactivació de procarcinògens ambientals. En les reaccions de detoxificació es generen productes capaços d'unir-se al DNA formant adductes, que poden ser els responsables de les mutacions activadores en l'oncogèn K-ras. Els nostres resultats mostren que el genotip homozigot per l'al·lel valina en el locus m1 del gen CYP1B1, augmenta de risc de tenir un ADP amb mutacions en l'oncogèn K-ras; aquest genotip estaria associat a una activitat detoxificadora més pobra i, en conseqüència, a un procés deficient de biotransformació, metabolització i eliminació de tòxics de l'organisme, que serien l'origen de mutacions en l'oncogèn K-ras. Les mutacions en l'oncogèn K-ras són presents en estadis molt inicials del procés carcinogènic pancreàtic, i també en el teixit de pacients amb pancreatitis o diabetis; ambdues patologies considerades possibles factors de risc per l'ADP. Els nostres resultats mostren que els antecedents patològics de diabetis tipus 2 (DM-2) i de pancreatitis no són més freqüents en els casos d'ADP amb mutacions a K-ras. Així doncs, en pacients d'ADP, tant els antecedents de DM-2 com els de pancreatitis semblen estar associats amb vies d'activació de la carcinogènesi pancreàtica independents de K-ras, potser lligats al dany que pateix el teixit pancreàtic com a conseqüència de la inflamació crònica a la que està sotmès i a mediadors de la resposta inflamatòria, entre d'altres. Tot i que es discuteix el paper del consum d'alcohol en la carcinogènesi pancreàtica, tant l'etanol com el seu metabòlit, l'acetaldehid, estan reconeguts com a carcinògens en humans. Els nostres resultats mostren que el consum d'alcohol al llarg de la vida està associat amb la presència de mutacions en l'oncogèn K-ras en pacients amb ADP. Els efectes carcinogènics i mutagènics de l'etanol i l'acetaldehid podrien jugar un paper important en l'aparició de les mutacions en l'oncogèn K-ras en l'epiteli pancreàtic. / Background The primary prevention of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) cancer is hampered by limited knowledge on its etiology. Tobacco consumption is the best established risk factor, but it explains only a small fraction of cases. It is currently being discussed the role of other etiologic factors including diet, medical history, environmental and occupational exposures, or genetic susceptibility. Activating point mutations in the K-ras oncogene are one of the fundamental genetic events leading to PDA; at diagnosis, about 80% of PDA cases harbour mutations in codon 12 of K-ras. Depending on the cellular and molecular context, oncogenic K-ras activation can result in a wide variety of responses ranging from the activation of a senescence programme to an increased cell proliferation and inhibition of apoptosis. Ras genes are critical targets for chemical carcinogens; K-ras-mutated and wild-type cancers may develop through pathways involving different gene-environment interactions. Although mutations in K-ras are the most frequent alteration of oncogenes in human cancer, the potential lifestyle and environmental influences on their occurrence and persistence are largely unknown. The main objective of the present thesis is to assess the relationship between activating mutations in codon 12 of the K-ras oncogene and environmental, clinical, and genetic factors, (specifically tobacco and alcohol consumption, medical history and genetic polymorphisms in CYP1B1) in patients with PDA. Methodology This thesis is developed in the context of the PANKRAS II project, a multicentre prospective study on the role of mutations in the K-ras oncogene and other genetic alterations in the diagnosis, prognosis and etiology of exocrine pancreatic cancer. A total of 602 subjects were recruited at five general hospitals in the eastern Mediterranean part of Spain; among them, 185 were incident cases of PDA. Over 85% of the patients were interviewed face-to-face during hospital stay, close to the time of diagnosis. Interviews included questions about lifestyle, past clinical history, symptoms, occupation, diet, coffee, alcohol and tobacco consumption. A structured form was used to collect clinicopathological information from medical records, including details on diagnostic procedures, laboratory results and follow-up care. Molecular analyses of genes involved in pancreatic carcinogenesis were also undertaken (i.e., K-ras, TP53, p-16/CDKN2, SMAD4/DPC4, BRCA2 or CFTR). The association between the presence of K-ras mutations and clinical, environmental and genetic factors was assessed by unconditional logistic regression. Results and discussionWhile both smoking and K-ras mutations have important roles in the etiopathogenesis of PDA, our results show no association between the presence of K-ras mutations and tobacco consumption in PDA patients; the two processes may act independently in pancreatic carcinogenesis. Carcinogens from tobacco smoke detected in pancreatic tissue (nitrosamines) might be the responsible of other genetic alterations that act late in the carcinogenic process. On the other hand, pancreatic tissue is not a target organ for tobacco carcinogens that could activate oncogenic K-ras (such as polycyclic aromatic hydrocarbons). Tobacco does not play a major part in the acquisition of K-ras mutations in the pancreatic epithelium. Cytochrome P4501B1 (CYP1B1) is a carcinogen and estrogen-metabolizing enzyme with an important role in the bioactivation of some environmental procarcinogens. The oxidant steps catalyzed by this enzyme create more reactive intermediates that are able to bind with DNA, leading to DNA adduct formation and genetic mutations. Our results suggest that CYP1B1 polymorphisms might influence interindividual differences in susceptibility to pancreatic cancer by the acquisition of K-ras mutations. Val/Val genotype increases the probability of having a K-ras mutated PDA; this genotype might be associated with poor detoxification activity and, consequently, with an impaired elimination of some environmental toxics that can react with DNA to form stable adducts, which may favor mutations in K-ras. Activating point mutations in the K-ras oncogene are present in early stages of the PDA development, and have been also detected in pancreatic tissue from patients with diabetes and pancreatitis, both considered as risk factors for PDA. Our results show no association between the presence of K-ras mutations and medical history of diabetes or pancreatitis in PDA patients. Medical history of pancreatitis and diabetes may favor pancreatic carcinogenesis through pathways independent of K-ras activation; chronic inflammation causes a gradual damage of pancreatic tissue that might contribute to carcinogenic transformation of acinar pancreatic cells through molecular alterations not involving K-ras mutations. Although the role of alcohol in pancreatic carcinogenesis remains inconclusive, there is sufficient evidence for the carcinogenicity of ethanol and acetaldehyde. Our results show a positive relationship between lifetime history of alcohol consumption and the prevalence at diagnosis of K-ras mutations in PDA patients. Acetaldehyde, a cytotoxic, mutagenic, and carcinogenic metabolite of ethanol, is responsible for tumor enhancing effects leading to cell proliferation; it can also bind to DNA, leading to the formation of stable DNA adducts that could cause replication errors and mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, and K-ras seems to be one of them.

D'acord amb el comitè de nomenclatura gènica (HGNC) de l'organització del genoma humà (HUGO), es defineix com a proteïna HERC tota aquella proteïna que conté com a mínim i de forma conjunta un domini HECT i un domini RCC1 like (RLD) en la seva seqüència. En l'actualitat s'han identificat 6 membres per aquesta família de proteïnes d'entre les quals la proteïna HERC1 és la primera que es va identificar i el membre fundador de la família. La identificació d'aquesta proteïna va tenir lloc mitjançant la búsqueda de seqüències oncogèniques humanes a partir de cèl·lules de càncer de mama, i tot i que s'ha observat la seva sobrexpressió en diferents càncers, i que s'ha descrit la seva interacció amb difererents proteïnes involucrades amb processos de tràfic de membrana, a dia d'avui no es coneix encara quina es la seva funció fisiològica. L'objectiu principal d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR. Amb l'objectiu de facilitar aquest estudi vàrem idear en primer lloc un sistema per a l'estudi de proteïnes gegants per PAGE/SDS que al mateix temps ens permetés l'anàlisi de proteïnes amb pesos moleculars menors en un sol gel. Aquest sistema el vàrem anomenar LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel), i consisteix en un gel que combina de forma contínua un gel de poliacrilamida de baix percentatge d'acrilamida (4%) i una proporció menor de l'habitual d'acrilamida:bisacrilamida (80:1) (que permet l'entrada de les proteïnes gegants al gel) amb un gel en gradient del 6 al 15% amb una proporció acrilamida/bisacrilamida de 40:1. Hem comprobat que aquest sistema permet separar proteïnes des de 5 KDa fins a proteïnes gegants en únic gel, amb els avantatges que això comporta pel que fa al estalvi de temps i de reactius. A l'any 2006, en col·laboració amb el nostre laboratori, es va descriure que HERC1 interacciona amb la tuberina (TSC2), una proteïna que juntament amb l'hamarina (TSC1) forma el complex de l'esclerosi tuberosa (TSC). Aquest complex actua com a regulador negatiu de la via de senyalització de mTOR, estimulant l'activitat GTPasa de Rheb a través del domini GAP de TSC2. En aquest treball hem comprovat que HERC1 s'associa als dos components de l'esclerosi tuberosa (tuberina i hamartina) estabilitzant aquest complex. A més a més, hem observat com aquesta interacció té lloc en menor grau amb els mutants de TSC2 identificats en pacients d'esclerosi tuberosa R611Q i R905Q, és independent de la inhibició de la via de señalización de mTOR induïda por dejuni o de la seva activació mitjançant aminoàcids o insulina. En canvi, tot i aquestes interaccions, HERC1 no sembla participar en la fosforilació de proteïnes involucrades en la via de mTOR com les p70 S6K, 4EBP1, Akt o S6, ni tampoc en la regulació del procés de l'autofàgia. En canvi, si que afecta a un altre procés mTOR dependent com és la biogénesi de ribosomes. En aquest sentit hem pogut comprovar mitjançant experiments de silenciació del gen d'HERC1 que la disminució dels nivells d'HERC1 provoca disminucions significatives dels nivells d'ADN ribosomal 18S així com de l'actividad del promotor d'aquest gen.La realització d'experiments d'activació amb aminoàcids per a l'estudi del paper de la proteïna HERC1 en la via de senyalització de mTOR ens va permetre observar que el tractament amb aminoàcids indueix la fosforilació de una proteïna de 80-90 KDa, però no de la isoforma p70 de la S6K1. Aquesta observació ens va portar a l'estudi de l'activació de la p70 S6K1 en resposta a aminoàcids, observant que en respuesta a aquests nutrients es produeix l'activació de les proteïnes quinasa activades por MAPKs (MKs), RSK y MSK. A més a més, hem vist que l'activació d'ambdues quinases té lloc en resposta a la activació de les MAPKs, Erk o p38, a través d'un mecanisme compensatori en el qual quan la Erk es troba inhibida, l'activació de la RSK i MSK té lloc a través de p38 i viceversa. / According to the Human Genome Organization (HUGO) Gene Nomenclature Committee (HGNC), HERC proteins are defined as those proteins containing both RLD and HECT domains in their amino acid sequence. Currently, six HERC proteins have been identified. The physiological role of HERC1, the founding member of the family, still remains to be clarified. The main objective for this thesis has been the study of HERC1 role in the mTOR signalling pathway. First, we created a new system to study giant and smaller proteins by means of PAGE/SDS in a unique gel. We called it LAG gel (Low Acrylamide Gradient gel) and is formed by the combination of a low percentage acrylamide gel (4% and a ratio Acrylamide/Bisacrylamide 80:1) and a gradient gel (6-15%, A/B 80:1). This system permits to analyze simultaneously giant and smaller proteins in a unique gel obtaining good separation ressolutions for all proteins and to save time and reactants. It's been described that HERC1 is able to interact with TSC2 (tuberin), a protein which together with TSC1 (hamartin) constitutes the tuberous sclerosis complex (TSC). This complex acts as a negative regulator of the mTOR signalling pathway through the stimulation of Rheb GTPase activity by TSC2 GAP domain. We have proved that HERC1 interacts with both TSC members (tuberin and hamartin) stabilizing it. Furthermore, we have observed that this interaction is lower with TSC2 mutants identified from tuberous sclerosis patients, R611Q and R905Q and is independent of mTOR signalling pathway inhibition by starving or activation by aminoacids or insulin. Despite these interactions, HERC1 isn't involved in the phosphorylation of some mTOR signalling pathway proteins such as p70 S6K, 4EBP1, Akt, S6, nor in the regulation of Autophagy. However, HERC1 is involved in the mTOR dependent process of ribosome biogenesis. We have proved that the HERC1 gene knock down causes a significant decrease of the 18S ribosomal DNA as well as a reduction of the activity of the promoter of this gene.The performance of activation assays with aminoacids in the study of the HERC1 role in the mTOR signalling pathway permitted us to observe that this cell treatment induce the phosphorylation of a 90 KDa protein and a 110 KDa protein, but not the p70 isoform of S6K1. We have seen that these 90 and 110 KDa bands correspond to the kinases activated by MAPKs (MKs), RSK and MSK. Furthermore, we have proved that the activation of both kinases takes place in response of the activation of the MAPKs, Erk or p38 through a compensatory mechanish in which when Erk is not active, the RSK and MSK activation is induced by p38 and viceversa.

En els darrers anys s´ha consolidat l´enfoc translacional en l´abordatge del càncer. Aquest es basa en la voluntat de comprendre la biologia tumoral i implementar clínicament aquest coneixement dissenyant nous fàrmacs capaços d´inhibir específicament molècules oncogèniques.En aquest context, s´han descobert els receptors tirosina-quinasa (RTK) com a proto-oncogens crucials en la diferenciació i proliferació cel·lular i com a molècules amb un gran paper en carcinogènesi. KIT i PDGFR són dos exemples paradigmàtics de RTK pels que s´han desenvolupat fàrmacs inhibidors, amb gran èxit terapèutic en aquells tumors, com el GIST, on aquestes proteïnes tenen un paper patogenètic crucial.L´enfoc translacional ha tingut un gran impacte en el camp dels tumors renals que representen un 3% dels tumors de l´economia i dels quals s´en reconeixen diferents subtipus. Els avenços en biologia molecular han permès definir la patogènia d´algunes entitats, sobretot del Carcinoma renal de cèl·lula clara (CRCC), un dels subtipus tumorals freqüents i més agressiu per l´alt nombre de pacients que desenvolupen malaltia metastàtica (30-50%) i pels quals s´estan buscant noves eines terapèutiques.Pel valor oncogènic i com a dianes terapèutiques del KIT i PGFR, aquest treball té com a objectiu estudiar l´expressió d´aquestes proteïnes per immunohistoquímica sobre teixit de tumors de cèl·lules renals. A més a més, en base a aquests resultats i la literatura es pretén discutir el seu valor com a dianes terapèutiques.En el nostre estudi es va demostrar expressió de KIT de forma específica en Carcinoma renal Cromòfob (ChRCC) i Oncocitoma (OR). També es va trobar sobreexpressió de KIT i PDGFRα en la diferenciació sarcomatoide de carcinomes renals (SRCC) sense que aquesta s´associès amb mutacions en els exons 9, 11, 13, 17 del KIT ni en els exons 11, 12, 17, 18 de PDGFRα; que són els més freqüent mutats en el GIST .Alhora vam observar expressió inespecífica en cèl·lules tumorals de PDGFRα i PDGFRβ en un baix nombre de casos i de forma dèbil en diferents subtipus de tumors renals. Per contra, vam evidenciar sobreexpressió de PDGFRβ vascular de forma característica en un alt percentatge de CRCC. En base als nostres resultats, proposem la utilitat de KIT com a marcador en el diagnòstic diferencial de diferents subtipus tumorals. Alhora, hem demostrat que l´expressió de KIT i PDGFRα en els SRCC no segueix el mateix model patogenètic que el GIST. La literatura sosté la necessitat de demostrar la implicació patogènica d´una proteïna en un tumor per plantejar l´efectivitat de la seva inhibició selectiva, essent l´expressió immunohistoquímica per si mateixa insuficient per sostindre aquest principi.Fins al moment, no es coneix si KIT i PDGFR tenen un paper oncogènic en el ChRCC, OR i en SRCC.Per tant, no hi ha suficients dades per proposar l´us d´inhibidors proteics contra aquestes proteïnes en ChRCC i SRCC disseminats.Per altra banda l´expressió vascular de PDGFRβ en CRCC si que té una base patogenètica ja que el seu lligand (PDGF) s´ha implicat directament en la seva biologia. Alhora aquesta expressió vascular és coherent amb els estudis que relacionen la isoforma beta del PDGFR amb la maduració dels pericits i en la promoció de l´angiogènesi.Per tant, els nostres resultats sostenen la relació del PDGFRβ en la patogènia del Carcinoma renal de cèl·lula clara i el valor terapèutic dels fàrmacs contra aquest receptor amb finalitat antiangiogènica.En conclusió, en el context de l´enfoc translacional del càncer i la necessitat d´implementació de nous fàrmacs inhibidors proteics pel tractament del carcinoma renal metastàtic, l´anàlisi d´expressió de RTK en tumors renals permet juntament amb la integració d´altres estudis, la discussió del valor diagnòstic i sobretot terapèutic d´aquestes dianes moleculars. / Renal Cell Neoplasms (RCN) represent 3% of cancer incidence and comprise different clinicopathologic entities. Malignant subtypes, specially the most frequent one Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CRCC), remain the most lethal of urologic cancers due to the high rate of patients (30-50%) developing metastatic disease for whom new therapies are needed.Great advances in molecular biology have led to the identification of tyrosine-kinase receptors (TKR) as relevant proteins in tumorigenesis. Moreover the advent of selective inhibitors against them has raised interest on its expression in different tumors.PDGFR and KIT are two examples of TKR that have an oncogenic role in numerous neoplasms and can be inhibited pharmacologically. Because of its potential role as proto-oncogens and therapeutic targets; We aimed to study its immunohistochemical expression in RCN and to discuss its possible role as molecular targets.Our results highlight specific expression of KIT in Chromophobe renal cell carcinoma (ChRCC) and Renal Oncocytoma (RO). Overexpression of KIT and PDGFRα was found in sarcomatoid differentiation of renal tumours (SRCC) without mutations in KIT exons 9,11,13,17 nor PDGFR exons 11,12,17,18 which are the most commonly mutated in GIST.Moreover inespecific and low expression of PDGFRα and PDGFRβ was evidenced in tumoral cells in different RCN. In contrast, vascular expression of PDGFRβ was seen caracteristically in half of CRCC cases.According to our results, we propose KIT as a useful marker for differential diagnosis among RCN.Moreover we demonstrate that expression of KIT and PDGFR in SRCC doesn´t follow the same pathogenetic mecanism as GIST.Scientific community claims that immunohistochemical expression of a protein in a tumor is not enough to propose it as a therapeutic target and that demonstation of its pathogenetic role is needed. So as, there is still no evidence of participation of KIT-PDGFR in ChRCC, OR nor SRCC oncogenesis, there is not enough data to propose them as therapeutic targets.Conversely, in different studies PDGFRβ has been involved in CRCC pathogenesis and has been related to tumor angiogenesis by perycite recruitment. So that, vascular expression of PDGFRβ in CRCC favours its consideration as a therapeutic target in this tumor subtype.

La apoptosis es un proceso de muerte celular programada que está involucrada en la selección del repertorio de linfocitos T y en el mantenimiento de la tolerancia inmunológica, ya que es el mecanismo por el que se eliminan las células que podrían dar lugar a respuestas autoinmunes. Existen evidencias de que la alteración en los mecanismos apoptóticos están implicados en la patogenia y la actividad de las enfermedades autoinmunes sistémicas, de las cuales, el lupus eritematoso sistémico (LES) es la más representativa. Se han identificado en el ser humano algunos genes que codifican oncoproteínas y citocinas cuya transcripción parece ser crucial en este proceso: unos pro-apoptóticos (fas, p53 y TNF-alfa) y otros anti-apoptóticos (bcl-2 y IL-10). Se sospecha que cambios en la expresión de los mismos podrían desempeñar algún papel en la patogenia del LES, al favorecer la proliferación de determinadas poblaciones celulares de efecto autorreactivo.Con los trabajos de la presente tesis doctoral nos propusimos: determinar la implicación de los oncogenes (bcl-2, fas y p53) y las citocinas (IL-10 y TNF-alfa) en la disregulación apoptótica que presentan los pacientes con LES; estudiar la interrelación existente entre ellos; y analizar la relación de las posibles disregulaciones de los elementos que participan en la apoptosis con la actividad de la enfermedad lúpica.Los resultados obtenidos muestran cómo los oncogenes fas, bcl-2 y p53, las citocinas IL-10 y TNF-alfa, y la fracción proteica soluble del Fas (sFas) tienen una notable importancia en la patogenia y la actividad de la enfermedad lúpìca. Las vías apoptóticas del Fas y p53 son independientes entre sí. Sin embargo, diversas citocinas (IL-10, TNF-alfa), oncoproteínas (Bcl-2) y fracciones proteicas solubles (sFas) pueden ser las encargadas de relacionarlas entre sí. La interferencia de estas vías apoptóticas produciría una eliminación deficiente de los linfocitos autorreactivos. Ello favorecería su supervivencia, lo que provocaría las alteraciones de disregulación inmunológica propias del LES.