Antecedents La prevenció primària de l'adenocarcinoma ductal de pàncrees (ADP) està limitada per la falta de coneixement sobre la seva etiologia. El factor de risc més ben establert és el consum de tabac, però explica només una petita proporció de casos. Es discuteix el paper d'altres factors etiològics com els antecedents patològics de diabetis i pancreatitis, la dieta, determinades exposicions ambientals o laborals, i els factors hereditaris. Mutacions puntuals en l'oncogèn K-ras, i la seva conseqüent activació, són presents en més del 80% dels casos d'ADP; és un dels esdeveniments genètics fonamentals perquè el càncer tingui lloc. L'activació d'aquest oncogèn dóna lloc a gran varietat de respostes, des de l'augment de la proliferació cel·lular fins a la inhibició de l'apoptosi, en funció del context cel·lular. Els gens Ras són dianes crítiques per als carcinògens químics; els càncers de pàncrees amb i sense mutacions en l'oncogèn K-ras probablement es desenvolupen a partir de diferents interaccions gen-ambient. Tot i això, els estils de vida i les exposicions ambientals que poden influir en la presència de mutacions en el gen K-ras són pràcticament desconeguts. L'objectiu general d'aquesta tesi és estudiar la relació entre la prevalença de mutacions en el codó 12 de l'oncogèn K-ras i diferents factors ambientals (consum de tabac i alcohol), clínics (antecedents patològics) i genètics (polimorfismes en el gen CYP1B1), en pacients amb ADP. Metodologia La tesi s'emmarca en el projecte PANKRAS II, un estudi multicèntric prospectiu sobre el paper de les mutacions en l'oncogèn K-ras i altres alteracions genètiques en el diagnòstic, el pronòstic i l'etiologia del càncer de pàncrees exocrí. Es van reclutar 602 pacients procedents de 5 hospitals generals del nord-est de la península ibèrica amb patologies relacionades amb el pàncrees, dels quals 185 eren pacients amb ADP. Es va entrevistar personalment més del 85% dels pacients per obtenir informació sociodemogràfica, clínica (antecedents patològics i història familiar de càncer) o sobre els seus estils de vida (dieta, ocupació o hàbits tòxics); paral·lelament es van revisar les històries clíniques d'aquests pacients. Finalment es van realitzar anàlisis moleculars de gens implicats en el procés de carcinogènesi pancreàtica (K-ras, TP53, p-16/CDKN2, SMAD4/DPC4, BRCA2 o CFTR). L'anàlisi de l'associació entre la prevalença de mutacions en l'oncogèn K-ras i els diferents factors clínics, ambientals i genètics s'ha realitzat mitjançant regressió logística no condicional. Resultats i discussió Tot i que el consum de tabac és el factor de risc més ben establert i les mutacions en l'oncogèn K-ras un esdeveniment fonamental en l'etiologia de l'ADP, els nostres resultats mostren que no existeix associació entre ambdós factors. Els carcinògens del tabac presents en el teixit pancreàtic, les nitrosamines, serien les responsables d'alteracions en gens que intervenen en estadis més tardans del desenvolupament del càncer; alhora, altres carcinògens del tabac amb capacitat per activar K-ras, com els hidrocarburs aromàtics policíclics, no tindrien el pàncrees com a òrgan diana. Els carcinògens del tabac intervenen en la carcinogènesi pancreàtica per vies alternatives a l'activació de K-ras. El gen citocrom P4501B1 (CYP1B1) codifica un enzim metabolitzador de carcinògens i estrògens amb un rol important en la bioactivació de procarcinògens ambientals. En les reaccions de detoxificació es generen productes capaços d'unir-se al DNA formant adductes, que poden ser els responsables de les mutacions activadores en l'oncogèn K-ras. Els nostres resultats mostren que el genotip homozigot per l'al·lel valina en el locus m1 del gen CYP1B1, augmenta de risc de tenir un ADP amb mutacions en l'oncogèn K-ras; aquest genotip estaria associat a una activitat detoxificadora més pobra i, en conseqüència, a un procés deficient de biotransformació, metabolització i eliminació de tòxics de l'organisme, que serien l'origen de mutacions en l'oncogèn K-ras. Les mutacions en l'oncogèn K-ras són presents en estadis molt inicials del procés carcinogènic pancreàtic, i també en el teixit de pacients amb pancreatitis o diabetis; ambdues patologies considerades possibles factors de risc per l'ADP. Els nostres resultats mostren que els antecedents patològics de diabetis tipus 2 (DM-2) i de pancreatitis no són més freqüents en els casos d'ADP amb mutacions a K-ras. Així doncs, en pacients d'ADP, tant els antecedents de DM-2 com els de pancreatitis semblen estar associats amb vies d'activació de la carcinogènesi pancreàtica independents de K-ras, potser lligats al dany que pateix el teixit pancreàtic com a conseqüència de la inflamació crònica a la que està sotmès i a mediadors de la resposta inflamatòria, entre d'altres. Tot i que es discuteix el paper del consum d'alcohol en la carcinogènesi pancreàtica, tant l'etanol com el seu metabòlit, l'acetaldehid, estan reconeguts com a carcinògens en humans. Els nostres resultats mostren que el consum d'alcohol al llarg de la vida està associat amb la presència de mutacions en l'oncogèn K-ras en pacients amb ADP. Els efectes carcinogènics i mutagènics de l'etanol i l'acetaldehid podrien jugar un paper important en l'aparició de les mutacions en l'oncogèn K-ras en l'epiteli pancreàtic. / Background The primary prevention of pancreatic ductal adenocarcinoma (PDA) cancer is hampered by limited knowledge on its etiology. Tobacco consumption is the best established risk factor, but it explains only a small fraction of cases. It is currently being discussed the role of other etiologic factors including diet, medical history, environmental and occupational exposures, or genetic susceptibility. Activating point mutations in the K-ras oncogene are one of the fundamental genetic events leading to PDA; at diagnosis, about 80% of PDA cases harbour mutations in codon 12 of K-ras. Depending on the cellular and molecular context, oncogenic K-ras activation can result in a wide variety of responses ranging from the activation of a senescence programme to an increased cell proliferation and inhibition of apoptosis. Ras genes are critical targets for chemical carcinogens; K-ras-mutated and wild-type cancers may develop through pathways involving different gene-environment interactions. Although mutations in K-ras are the most frequent alteration of oncogenes in human cancer, the potential lifestyle and environmental influences on their occurrence and persistence are largely unknown. The main objective of the present thesis is to assess the relationship between activating mutations in codon 12 of the K-ras oncogene and environmental, clinical, and genetic factors, (specifically tobacco and alcohol consumption, medical history and genetic polymorphisms in CYP1B1) in patients with PDA. Methodology This thesis is developed in the context of the PANKRAS II project, a multicentre prospective study on the role of mutations in the K-ras oncogene and other genetic alterations in the diagnosis, prognosis and etiology of exocrine pancreatic cancer. A total of 602 subjects were recruited at five general hospitals in the eastern Mediterranean part of Spain; among them, 185 were incident cases of PDA. Over 85% of the patients were interviewed face-to-face during hospital stay, close to the time of diagnosis. Interviews included questions about lifestyle, past clinical history, symptoms, occupation, diet, coffee, alcohol and tobacco consumption. A structured form was used to collect clinicopathological information from medical records, including details on diagnostic procedures, laboratory results and follow-up care. Molecular analyses of genes involved in pancreatic carcinogenesis were also undertaken (i.e., K-ras, TP53, p-16/CDKN2, SMAD4/DPC4, BRCA2 or CFTR). The association between the presence of K-ras mutations and clinical, environmental and genetic factors was assessed by unconditional logistic regression. Results and discussionWhile both smoking and K-ras mutations have important roles in the etiopathogenesis of PDA, our results show no association between the presence of K-ras mutations and tobacco consumption in PDA patients; the two processes may act independently in pancreatic carcinogenesis. Carcinogens from tobacco smoke detected in pancreatic tissue (nitrosamines) might be the responsible of other genetic alterations that act late in the carcinogenic process. On the other hand, pancreatic tissue is not a target organ for tobacco carcinogens that could activate oncogenic K-ras (such as polycyclic aromatic hydrocarbons). Tobacco does not play a major part in the acquisition of K-ras mutations in the pancreatic epithelium. Cytochrome P4501B1 (CYP1B1) is a carcinogen and estrogen-metabolizing enzyme with an important role in the bioactivation of some environmental procarcinogens. The oxidant steps catalyzed by this enzyme create more reactive intermediates that are able to bind with DNA, leading to DNA adduct formation and genetic mutations. Our results suggest that CYP1B1 polymorphisms might influence interindividual differences in susceptibility to pancreatic cancer by the acquisition of K-ras mutations. Val/Val genotype increases the probability of having a K-ras mutated PDA; this genotype might be associated with poor detoxification activity and, consequently, with an impaired elimination of some environmental toxics that can react with DNA to form stable adducts, which may favor mutations in K-ras. Activating point mutations in the K-ras oncogene are present in early stages of the PDA development, and have been also detected in pancreatic tissue from patients with diabetes and pancreatitis, both considered as risk factors for PDA. Our results show no association between the presence of K-ras mutations and medical history of diabetes or pancreatitis in PDA patients. Medical history of pancreatitis and diabetes may favor pancreatic carcinogenesis through pathways independent of K-ras activation; chronic inflammation causes a gradual damage of pancreatic tissue that might contribute to carcinogenic transformation of acinar pancreatic cells through molecular alterations not involving K-ras mutations. Although the role of alcohol in pancreatic carcinogenesis remains inconclusive, there is sufficient evidence for the carcinogenicity of ethanol and acetaldehyde. Our results show a positive relationship between lifetime history of alcohol consumption and the prevalence at diagnosis of K-ras mutations in PDA patients. Acetaldehyde, a cytotoxic, mutagenic, and carcinogenic metabolite of ethanol, is responsible for tumor enhancing effects leading to cell proliferation; it can also bind to DNA, leading to the formation of stable DNA adducts that could cause replication errors and mutations in oncogenes and tumor suppressor genes, and K-ras seems to be one of them.

Pancreatic cancer is nowadays one of the neoplasms with worst prognosis, so research towards the discovery of new molecular targets for therapy and diagnosis is more than urgent. In this direction, we have deeply evaluated the role of Galectin-1 (Gal-1) - a protein that is highly overexpressed in the tumor stroma- in pancreatic tumor progression. Interestingly, we have found that Gal-1 interacts with tissue plasminogen activator (tPA) and that this interplay seems to be involved both in pancreatic tumor epithelial cells and fibroblasts migration, Erk1/2 activation and invasion, suggesting its importance in the tumor/stroma crosstalk in vitro. We have also focused on the biochemical identification of tPA/Gal-1 interaction domains. Furthermore, we have studied Gal-1 role in pancreatic tumor progression in vivo, using murine (xenografts and transgenics) and zebrafish models. We have found that Gal-1 participates in proliferation, angiogenesis, stroma formation and necrosis in Ela-1-myc pancreatic tumors, as well as in the acinar to ductal metaplasia. Importantly, these effects result in an overall significant increase in the survival of Ela-1-myc mice with reduced Gal-1 levels. We have also analyzed Gal-1 role in mouse embryonic pancreatic development, finding interesting parallelisms with tumors. Finally, the molecular mechanisms involved in Gal-1 driving tumor pancreatic progression have been addressed through a transcriptome analysis. All together, our data support Gal-1 as a new molecular target to fight against pancreatic cancer. / Avui en dia, el càncer de pàncrees representa un dels tumors amb més elevats índex de mortalitat, per la qual cosa la recerca dirigida a la identificació de molècules per teràpia i diagnosi són més que necessàries. Amb aquest objectiu, hem avaluat el paper que juga Galectina-1 (Gal-1) - una proteïna altament sobreexpressada en l’estroma tumoral- en la progressió tumoral pancreàtica. Hem trobat que Gal-1 interactua amb l’activador tissular del plasminògen (tPA), participant en la migració, l’activació de Erk1/2 i la invasió, tant en cèl4lules tumorals pancreàtiques com en fibroblasts in vitro, suggerint una importància caudal d’aquesta interacció en la comunicació entre el tumor i l’estroma. Així mateix, ens hem centrat en la identificació bioquímica dels dominis d’interacció entre Gal-1 i tPA. A més, el paper de Gal-1 en la progressió tumoral pancreàtica ha estat adreçat in vivo, utilitzant models murins (xenografts i transgènics) i el peix zebra. Així doncs hem trobat que Gal-1 participa en la proliferació, angiogènesi, formació de l’estroma i la necrosi dels tumors pancreàtics dels ratolins Ela- 1-myc, així com en la metaplasia acinar-ductal. De forma significativa, aquests efectes es tradueixen en un increment important en la supervivència dels ratolins Ela-1-myc amb nivells reduïts de Gal-1. Hem també analitzat el paper que juga Gal-1 en el desenvolupament pancreàtic embrionari murí, trobant paral4lelismes interessants amb els tumors. Finalment, hem volgut ocupar-nos dels mecanismes moleculars involucrats en els efectes produïts per Gal-1 durant la progressió tumoral pancreàtica mitjançant microarrays. Les nostres dades presenten Gal-1 com una nova diana terapèutica per lluitar contra el càncer de pàncrees.

Els tractaments actuals pel càncer de pàncreas presenten un eficàcia limitada de manera que es necessari el desenvolupament de noves teràpies antitumorals. La teràpia gènica pel càncer de pàncreas basada en l’ús d’adenovirus es troba limitada per la baixa capacitat dels virus d’arribar a les masses tumoral, de distribuir-se pel tumor i d’infectar les cèl·lules tumorals. Nosaltres hem observat que l’administració intraductal d’adenovirus al ducte biliar de ratolins Ela-myc permet arribar als tumors pancreàtics de manera més eficient que per la via sistèmica. A més a més permet transduir la majoria de la massa tumoral restringint l’expressió adenoviral al teixit pancreàtic. D’altre banda, l’administració intraductal del tractament AduPARTat8TK/GCV retarda significativament el creixement tumoral i disminueix la toxicitat associada al tumor. El nou adenovirus AdTATMMP és activat per les MMP2/9 restaurant la capacitat de transducció de l’AdYTGRE in vitro, i incrementant 7,3 vegades la infecció del tumor pancreàtic. El tractament combinat de l’AduPARTat8TK/GCV amb gemcitabina presenta un efecte sinèrgic in vitro, però no millora la eficàcia antitumoral de les teràpies simples. D’altre banda el tractament de l’electroporació irreversible presenta efectes antitumorals significatius en tumors ortotòpics de la línia cel·lular BxPC-3-Luc i allarga la supervivència dels ratolins provocant una toxicitat mínima. / Novel therapies are needed to overcome the limited efficacy of current treatments in pancreatic cancer. Adenoviral gene therapy against pancreatic tumors is challenged by the limitation of viruses to reach the tumor mass, poorly distribute within the tumor and inefficiently transduce tumor cells. We show that intraductal administration of adenoviruses into the common bile duct of Ela-myc mice targets pancreatic tumors more efficiently than systemic delivery with relevant transduction of the bulk of the tumor and restricts expression to pancreatic tissue. Moreover, intraductal administration of AduPARTat8TK/GCV treatment significantly delayed tumor growth ameliorating tumor-associated toxicity. Noticeable the new generated MMP-activatable adenovirus AdTATMMP was susceptible to MMP2/9 activation, restored the transduction capacity of AdYTRGE in vitro, and increased 7.3 times tumor pancreas transduction. The multimodal treatment AduPARTat8TK/GCV and gemcitabine showed synergistic effects in vitro; however, did not enhance the antitumoral efficacy of single therapies. Interestingly, IRE treatment exhibited significant antitumor effects in BxPC-3-Luc orthotopic tumors and prolonged mice survival with minimal toxicity.

El càncer de pàncrees és altament agressiu i representa la cinquena causa de mort al mon occidental. Anteriorment, en el nostre laboratori, vam identificar que el receptor tissular del plasminogen (tPA) hi està sobre-expressat i juga un paper important el la progressió tumoral. En la present tesi hem profunditzat en l'estudi del mecanisme molecular de tPA i seus receptors en aquest càncer. En primer lloc hem caracteritzat en detall la interacció de tPA amb Annexina A2 (principal receptor de tPA en endoteli i altament expressada en pàncrees) demostrant que les dades publicades sobre la seqüència responsable de la interacció no eren correctes. A més a més hem caracteritzat les proteïnes de lisats cel·lulars pancreàtics que interaccionen amb tPA mitjançant un assaig pull down i posterior anàlisi proteòmic. de tot identificant un conjunt de possibles lligands de tPA. D'entre aquests hem seleccionat galectina 1, una lectina que mai s'ha descrit que interaccioni amb tPA, per realitzar la caracterització bioquímica i funcional del seu paper com a nou lligand de tPA en càncer de pàncrees. / Pancreatic cancer is a highly aggressive disease and represents the fifth cause of death in occidental world. Our laboratory has previously reported tissue type plasminogen activator (tPA) over expression in this cancer and its role in tumoral progression. During the present thesis we have studied tPA and its molecular mechanism through its receptors in this tumor.We have first characterized tPA interaction with annexin A2 (its main receptor in endothelium and highly expressed in pancreas). Our results showed that published data about the sequence responsible of this interaction was not correct. We have also identified a set of new putative tPA receptors in pancreatic cell lisates using a pull down assay and proteomic analysis. One of the proteins identified was galectin 1, a lectin with not know relation with tPA. We performed a biochemical and functional characterization of the interaction between these two proteins in pancreatic cancer.