En aquest treball es presenten diferents estratègies encaminades a millorarl'anàlisi qualitativa i quantitativa de patulina en suc de poma mitjançant la utilització de tècniques cromatogràfiques d'acoblament, CG-EM i HPLC-EM.Un aspecte rellevant d'aquesta estratègia es basa en l'obtenció mitjançant síntesi química de compostos estructuralment relacionats a la patulina per a ser utilitzats com a patrons interns en l'anàlisi quantitativa.S'han preparat tres sèries de compostos:Una sèrie de sis compostos preparats per condensació entre el tertbutil[( 5-{[tert-butil(dimetil)silil]oxi}-3-furil)metoxi]dimetilsilà, sintetitzat en aquest treball, i 6 aldèhis diferents.Una segona sèrie de sis compostos utilitzant en aquest cas el reactiu comercial el (2-furiloxi)(trimetil)silà i els mateixos 6 aldehids.I una tercera sèrie de compostos obtinguts per esterificació entre la 4-(hidroximetil) furan -2(5H)-ona, un alcohol sintetitzat també en aquest treball i 21 àcids diferents. En aquest cas s'ha seguit una estratègia de síntesi en paral·lel, fent totes les reaccions en fase sòlida.Els èsters obtinguts es van analitzar utilitzant dos columnes capil·lars de diferent fase estacionaria, una de 5% fenilmetilpolisiloxà i una de trifluorometilpropilpolisiloxà. Un total de 4 èsters van reportar resultats satisfactoris com a patrons interns, en l'anàlisi quantitativa de patulina sense derivatitzar per CG-ES-SIM. Si bé els resultats més òptims des del punt de vista de precisió i exactitud es van obtenir utilitzant l'èster (5-oxo-2,5-dihidrofuran-3-il)-metilacetat i la columna cromatogràfica de trifluorometilpropilpolisiloxà. En aquestes condicions es va assolir un límitde detecció de 1 µg/L i un límit de quantificació inferior a 6 µg/L de patulina en suc de poma. / En el siguiente trabajo se presentan diferentes estrategias encaminadas a mejorar el análisis de la micotoxina patulina en zumo de manzana, empleando técnicas cromatográficas de acoplamiento con la espectrometria de masas, tales como la CG-EM y la HPLC-EM.Un aspecto importe del trabajo se basa en la síntesis de compuestos estructuralmente relacionados con la patulina, para ser utilizados como patrones internos en el análisis cuantitativo.Se han sintetizado tres series de compuestos:Seis de ellos a partir de la reacción entre el tert-butil[(5-{[tertbutil( dimetil)silil]oxi}-3-furil)metoxi]dimetilsilano, compuesto también sintetizado en este trabajo, con 6 aldehídos distintos.Una segunda serie de 6 compuestos preparados a partir del reactivo comercial, el (2-furiloxi)(trimetil)silano con 6 aldehídos.Una tercera serie de compuestos obtenidos por síntesis paralela en una reacción de esterificación en fase sólida a partir del compuesto 4- (hidroximetil)furan-2(5H)-ona, obtenido también en este trabajo y 21ácidos diferentes.Cuatro de los ésteres sintetizados han sido probados con éxito, como patrones internos, en el análisis cuantitativo mediante CG-EM-SIM de patulina en zumo de manzana, sin necesidad de proceder a la preparación de un derivado de esta micotoxina. Se han probado dos tipos de columnas capilares, con fases estacionarias de 5% fenilmetilpolisiloxano y de trifluoropropilmetilpolisiloxano. Los mejores resultados en cuanto a precisión y exactitud se refiere, se han obtenido con la utilización del patrón interno acetato de (5-oxo-2, 5-dihidrofuran -3-il)-metilo y la fase estacionaria de trifluoroprilmetilpolisiloxano. El límite de detección calculado es de 1 µg/L y el límite de cuantificación es inferior a 6 µg/L. / In the present work we develop a strategy to improve the analysis of patulin in apple juice using chromatographic hyphenated techniques such us GC-MS and HPLC-MS. One aspect of the strategy deals with the synthesis of compounds structurally related to patulin to be used as internal standards in the quantification step.Three synthetic series of compounds have been prepared: In the first one we have synthesized 6 compounds by reaction of tertbutyl[(5-{[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy}-3-furyl)methoxy]dimethylsilane with different aldehids.In the second one, we have synthesized 6 aldols from the reaction of (2-furyloxy)(trimethyl)silane with different aldehids.In the third series we have prepared 21 esters using a parallel synthesis strategy in a polymer-assisted reaction of 4- (hydroxymethyl) furan- 2(5H)-one with 21 different carboxylic acids.Four of the esters have been successfully used as internal standards for the quantification of underivatized patulin in apple juice using gas chromatography-mass spectrometry in SIM mode. Two different capillary chromatographic columns were assayed, a 5% phenylmethylpolyxiloxane stationary phase and a trifluoropropylmethylpolisiloxane one.When using trifluoropropylmethylpolisiloxane as stationary phase and (5-oxo-2,5-dihydrofuran-3-yl)-methyl acetate as IS a precise and accurate quantification of patulin can be obtained down to 6 µg/L. A detection limit of 1 µg/L was established.

Las aminas heterocíclicas (HAs) son compuestos genotóxicos formados durante el cocinado de alimentos ricos en proteínas. Su determinación está dificultada por el bajo nivel de concentración de estos analitos y por la complejidad de la matriz, por lo que es necesario disponer de metodología adecuada. El principal objetivo de esta tesis doctoral ha sido por tanto el desarrollo de métodos analíticos que permitan cuantificar fiablemente las aminas heterocíclicas presentes en los alimentos.En primer lugar, nuestro trabajo se dirigió hacia el desarrollo de un método de tratamiento de muestra que, aún siendo más sencillo que los normalmente utilizados, nos permitiese analizar un elevado número de compuestos. Con este fin, se evaluaron varios de los métodos propuestos en la bibliografía y se estudió el cambio de las disoluciones de lavado y de los adsorbentes utilizados.A continuación, se realizó el acoplamiento entre la cromatografía de líquidos y la espectrometría de masas. Se utilizó un espectrómetro de masas de trampa de iones, y se optimizaron en primer lugar los parámetros de formación y transmisión de los iones. Seguidamente, se optimizaron las condiciones necesarias para realizar la detección mediante espectrometría de masas en tándem, y se evaluaron los parámetros de calidad obtenidos tanto para el modo MS como para el MS/MS.Con el fin de posibilitar la identificación de nuevas HAs en alimentos, se estudiaron los patrones de fragmentación de estos compuestos en espectrometría de masas. En el caso de los aminoimiodazoazaarenos, la fragmentación se produjo principalmente en el anillo imidazólico, con pérdidas de CH3, C2NH3 o CN2H2 entre otras. Para las carbolinas, se produjo la pérdida del grupo amino primario y se fragmentaron los heterociclos, con pérdidas de HCN y CH3CN entre otras. Además, para estos analitos se observó la formación de aductos entre el ion [M+H-NH3]+ y moléculas neutras presentes en la trampa de iones, como agua o acetonitrilo.Para comparar las prestaciones del analizador de trampa de iones y el de triple cuadrupolo, se utilizó también este tipo de instrumento para analizar las HAs mediante LC-MS. Tras la optimización de todos los parámetros instrumentales, se evaluaron los parámetros de calidad en modo SIM y MRM. Los límites de detección obtenidos con el triple cuadrupolo fueron menores que los de la trampa de iones, sin embargo este último analizador permite confirmar la identidad de los analitos mediante la obtención de los espectros de iones producto.A continuación, la metodología analítica desarrollada se validó mediante la participación en diferentes ejercicios interlaboratorio, en los cuales se analizaron una disolución de referencia y varios extractos de carne. En todos los casos, los resultados obtenidos fueron satisfactorios.Para finalizar, se estimó la ingesta en España derivada del consumo de ternera a la plancha, alimento seleccionado con este fin por ser uno de los más consumidos. Para ello, se analizaron varias muestras, una de ellas cocinada por nosotros y otras obtenidas de restaurantes. En todas las muestras se encontraron varias HAs a niveles de concentración de entre 0,2 y 21 ng g-1.

En la presente tesis se ha valorado la histamina y sus principales metabolitos, mediante el uso de técnicas de cromatografía de gases y espectrometría de masas. En concreto, se ha desarrollado un nuevo método de análisis, sensible y específico, para obtener un perfil metabólico de la histamina y sus derivados.

Entre las técnicas microanalíticas, el SIMS ha experimentado un gran éxito en las dos últimas décadas. Su habilidad para proporcionar datos de composición elemental y estructura, su capacidad para detectar pequeñas concentraciones de elementos y su distribución en profundidad, etc.; ha hecho que el SIMS sea un instrumento muy útil en numerosos campos de la ciencia y la tecnología. Se ha de mencionar también que la limitación más importante que padece la técnica es su falta de carácter cuantitativo, aunque existen muchos métodos y procedimientos, ya sean teóricos, empíricos o semi-empíricos, que permiten interpretar los resultados de forma cuantitativa en muchos casos importantes. El SIMS es una técnica analítica de gran interés y en constante evolución, por esta motivación se han realizado algunas investigaciones sobre el propio progreso de la técnica, como parte del trabajo desarrollado.El trabajo está estructurado en cuatro capítulos e incluye tanto las aportaciones al desarrollo y mejora de la técnica, como los resultados de las caracterizaciones de capas finas de dos materiales de notable importancia tecnológica. Las capas finas analizadas se han fabricado en el Laboratorio de Física de Capas Finas en el marco de diferentes proyectos de investigación.El primer capítulo presenta una introducción breve a la Espectrometría de Masas de Iones Secundarios. Se explican las características básicas de la técnica, su fundamento, los modos de análisis, y la instrumentación básica, concretando al caso de la microsonda iónica A-DIDA 3000-30, instrumento con el que se han realizado las mediciones.En el segundo capítulo se describen dos aportaciones a la técnica que representan mejoras en su aplicación. La primera de ellas consiste en un método para ajustar dinámicamente el voltaje aplicado a la muestra, manteniendo la estabilidad en la sensibilidad del instrumento a lo largo de un perfil en profundidad. El método permite realizar los perfiles en profundidad manteniendo el máximo del espectro de energía en la banda de paso del instrumento con un acoplamiento de ±1 eV. En la otra aportación se describe un método para determinar el ritmo de erosión en los análisis en profundidad por erosión atómica, y que es útil tanto para la calibración de la escala de profundidad como para el análisis estructural.El ritmo de erosión se puede determinar utilizando instrumentación rutinaria, con un requisito mínimo de un haz de iones con barrido lineal. Ambos métodos son sencillos en su aplicación al mismo tiempo que resuelven problemas típicos de SIMS de una forma práctica, con requisitos instrumentales rutinarios.En el tercer capítulo se presentan los resultados de la caracterización de capas finas de carbono amorfo hidrogenado (a-C:H) obtenidas por descomposición de metano en plasma de RF. Este material ha recibido una atención considerable por sus interesantes propiedades tales como la dureza, alto aislamiento eléctrico, elevada conductividad térmica y transparencia al IR. Hasta ahora se han publicado pocos análisis de capas de a-C:H con SIMS y no se ha hecho ningún intento de correlacionar los datos de SIMS con los parámetros tecnológicos de fabricación de las capas. En este trabajo se explota la información aportada por el SIMS en unas condiciones analíticas muy concretas para estudiar la variación de diferentes propiedades estructurales y de composición cuando cambian las condiciones de depósito. Se han analizado tres series de muestras depositadas en un rango amplio de potenciales de auto-polarización de substrato, sobre substratos no refrigerados, refrigerados y calentados. El análisis de las tres series de muestras ha permitido obtener información sobre la influencia que produce la tensión de auto-polarización y la temperatura sobre el crecimiento y propiedades de las capas. La razón entre las señales C2 y C3, la transición Si-C y el ritmo de erosión, varían con el potencial de substrato y presentan un punto crítico alrededor de 450 V. Se ha estudiado también la variación de estas magnitudes con la temperatura de substrato, y la homogeneidad en profundidad de las capas.El cuarto capítulo aborda la caracterización de capas' finas de silicio amorfo hidrogenado (a-Si:H) basada fundamentalmente en la detección del hidrógeno contenido en las mismas, alcanzándose un grado de cuantificación del H poco habitual en SIMS. El a-Si:H es un semiconductor con numerosas aplicaciones y ciertas ventajas frente a su homólogo cristalino, tales como su bajo coste de fabricación y la capacidad para recubrir grandes superficies. El hidrógeno confiere al material las propiedades de semiconductor pero también está relacionado con el fenómeno de la degradación que limita el campo de las aplicaciones.En este trabajo se estudia la distribución del hidrógeno en el interior de las capas y su dependencia de los parámetros tecnológicos de fabricación, así como su difusión bajo la acción de tratamientos térmicos. La detección del hidrógeno presenta una problemática típica en los análisis de SIMS por el alto valor de la señal de fondo para el H. Por este motivo se incluye un estudio, previo a la caracterización de las capas, sobre el fondo y las condiciones de análisis para el H. A continuación se estudia la distribución del hidrógeno en el interior de diferentes series de capas obtenidas variando sistemáticamente ciertos parámetros de fabricación. También se estudia un efecto de acumulación del hidrógeno en la intercara capa/substrato. Seguidamente, se realiza un estudio de la difusión del hidrógeno al realizar recocidos a diferentes temperaturas y diferentes tiempos en material no dopado con calidad de dispositivo; y finalmente, utilizando los parámetros determinados en el estudio de la difusión, se simula un espectro de efusión térmica del hidrógeno y se compara con el obtenido experimentalmente. / In this work we present two contributions to the SIMS technique (Secondary Ion Mass Spectrometry) and the characterization of a-C:H and a-Si:H thin films by SIMS.A simple method for the dynamic correction of the voltage offset during depth profiling in quadrupole instruments is described. The maximum of the energy spectrum can be situated in the passband of the instrument with a mismatching of about ± 1 eV during profiling.Depth calibration in sputter profiling can be seriously in error in the analysis of inhomogeneous samples in which the erosion rate varies. In this work, we present a method to evaluate the sputter rate as a function of depth, requiring only routine instrumentation.Hydrogenated amorphous carbon films (a-C:H) deposited on silicon by r.f. plasma decomposition of methane have been ana1yzed by SIMS. The dependence of the Si-C transition width on the substrate temperature and' the homogeneity of the carbon layer have been studied. The C(2)+/C(3)+ signal ratio is constant in a deep region but it increases in the direction towards the surface, this result seems indicate that some degradation of the film occurs during the growth process.The experimental conditions and background sources in the analysis of hydrogen in hydrogenated amorphous silicon (a-Si:H) using secondary ion mass spectrometry (SIMS) have been studied.The diffusion of hydrogen in device quality undoped a-Si:H thin films deposited by rf glow discharge onto silicon substrates has been studied by SIMS. The films were heated in flowing Ar at temperatures in the range 300-400 ºC. Depth profiles reveal diffusion of H towards the interface and substrate, and accumulation of H in the interface depending on the annealing and the substrate temperature during the growth process. The diffusion and effusion coefficients have been determined and the hydrogen effusion rate is simulated by applying the solution of the diffusion equations.

En la present Tesi s’han abordat dos camps de gran actualitat en la Química Orgànica actual, l’organocatàlisi i la catàlisi promoguda per complexos d’Au(III). En ambdós blocs s’han orientat els esforços en la recerca de nous mètodes sintètics o en aprofundir en els ja existents a fi de millorar−los; sense perdre de vista en cap cas la seva aplicabilitat a casos sintètics reals. En el primer Bloc s’ha tractat de solucionar el problema de la lentitud de moltes de les transformacions organocatalíques. S’ha trobat com la oxazolidinona derivada de la condensació de la L−prolina amb el pivalaldehid (oxazolidinona de Seebach, d’ara endavant SolPro) permet dur a terme reaccions aldòliques entre cetones i aldehids en tan sols dues hores, millorant significativament molts dels temps de reacció descrits en la literatura. Els estudis per RMN de 1H van permetre de determinar que el procés clau era el bescanvi del pivalaldehid amb la cetona corresponent. També es van realitzar una sèrie de càlculs teòrics a fi d’esbrinar quin o quins podien ser els mecanismes implicats en aquests bescanvis. En el darrer capítol del Bloc 1 s’ha avaluat l’activitat catalítica de la SolPro en la reacció de Michael entre nitroalcans i cetones alfa,beta−insaturades, trobant−se que també l’accelera però no de manera tan espectacular com en el cas de l’aldòlica. En el segon Bloc s’han estudiat diverses transformacions que involucren, directa o indirectament, el grup nitro. En el capítol 2.2 s’han preparat diverses N−sulfenilimines quirals amb un procediment desenvolupat recentment en el nostre grup de recerca. En el capítol 2.3 s’ha posat a punt un mètode d’hidròlisi d’N−sulfenilimines realment suau i que evita la racemització dels estereocentres en alfa. Després d’haver provat diversos àcids de Lewis s’ha trobat que l’ús de quantitats catalítiques d’AuBr3 més l’addició de nitrit d’isoamil, permet d’obtenir cetones quirals a partir de la corresponent N−sulfenilimina. A més, és possible acoblar el mètode de formació d’N−sulfenilimines amb el d’hidròlisi d’aquestes, de manera que s’ha desenvolupat una reacció de Nef formal que transcorre en condicions molt suaus (pH pràcticament neutre) i sense racemització dels estereocentres en alfa. En el capítol 2.4 s’ha estudiat la transformació d’oximes a carbonils. De nou, l’AuBr3 s’ha mostrat com l’únic àcid de Lewis que permet la formació de cetones (o aldehids) a partir d’oximes. S’ha aconseguit que el procés sigui catalític si s’empra biacetil o isovaleraldehid com additius. Les condicions en les que té lloc la reacció són suaus (si bé el pH baixa lleugera o moderadament durant el decurs de la reacció). S’ha fet un estudi pioner per Espectrometria de Masses en Electroesprai en mode negatiu a fi de conèixer els detalls mecanístics, trobant−se que les espècies de tipus AuBrx(OH)y─ són les predominants i com la oxima s’hi coordina desplaçant Br─. El mètode s’ha aplicat a més d’una vintena de cetoximes i aldoximes obtenint−se resultats excel•lents. / This Thesis deals about Organocatalysis and gold−mediated catalysis, two fields that have experienced a rapid growth in recent years. In both sections, the efforts have been focused in the development of new synthetic methodologies or in gaining insight into existing procedures in order to improve them. In the first section, we attempted to solve the problem of the slow rate of some organocatalytic transformations. Several oxazolidinones were prepared and then were tested in aldol reactions between ketones and aldehydes. The most efficient was Seebach’s oxazolidinone (SolPro). With this catalyst aldol reaction take less than 2 hours. Exchanges between pìvalaldehyde and different ketones were proved by 1H-NMR studies which suggested that these exchanges are essential in the mechanism. Finally, in chapter 1.5, the scope of the catalytic activity of SolPro was evaluated in a Michael reaction between nitroalkanes and alpha, beta-unsaturated ketones. Transformations in which the nitro group is involved were studied in the second section. In chapter 2.2 several chiral N-sulphenylimines were prepared according a novel procedure developed in our group. In chapter 2.3 a novel method to hydrolyze N-sulphenylimines was developed, which works in very mild conditions (room temperature, almost neutral pH) and avoids the racemization of alpha stereocenters. After an exhaustive screening of several Lewis acids, only AuBr3 catalyzed the reaction at neutral pH and afforded the corresponding ketone without racemization of alpha-stereocenters. Finally, in chapter 2.4, the transformation of oximes into carbonyl compounds was studied. Again, only AuBr3 was able to perform the hydrolysis of oximes into ketones (or aldehydes) in mild conditions (although the pH decreased slightly or moderately during the reaction). A pioneering study by Mass Spectroscopy (Electrospray in negative mode) showed that oximes coordinate to species like AuBrx(OH)y─ and this coordination is crucial in order to obtain the carbonyl compound.

L’interès creixent de la població general per la “medicina natural”, juntament amb els efectes beneficiosos que s’han demostrat per al resveratrol, ha incrementat la presència en els mercats d’aliments funcionals o nutracèutics basats en la seva composició. Per a poder fer al•legacions nutricionals i de propietats saludables en aquests tipus de productes és necessari un suport científic que recolzi, amb la màxima evidència, els efectes que es pretenen declarar, tenint en compte els paràmetres relacionats amb la biodisponibilitat i l’efecte de la matriu de l’aliment. La biodisponibilitat del resveratrol és baixa, donat el seu elevat metabolisme, de manera que els seus efectes beneficiosos es troben, actualment, en una certa controvèrsia. Les futures investigacions s’estan enfocant cap a la possible activitat dels metabòlits del resveratrol. Abans, però, es requereix informació més concreta sobre la biodisponibilitat del resveratrol i, sobretot, del seu metabolisme després del consum de quantitats moderades d'aliments que el continguin, per tal de conèixer les concentracions dels diferents metabòlits que es poden assolir en l’organisme. Per a dur a terme aquest tipus d’estudis es requereixen tècniques analítiques d’elevada sensibilitat i selectivitat que permetin una clara identificació del perfil metabòlic del resveratrol en mostres biològiques. L’objectiu principal d’aquesta Tesi Doctoral és conèixer el perfil metabòlic del resveratrol quan és administrat en dosis dietètiques en humans i la influència de la matriu de l’aliment en la seva biodisponibilitat, així com desenvolupar la metodologia adient per cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (UPLC-MS/MS). Per a assolir aquest objectiu i gràcies a la disponibilitat d’estàndards purs dels metabòlits pròpiament, ja sigui per la seva recent disponibilitat comercial o expressament sintetitzats, s’ha desenvolupat una metodologia òptima per a l’anàlisi del perfil metabòlic del resveratrol, que ha estat validada segons els criteris establerts per la FDA. Amb aquesta metodologia, s’ha definit el perfil metabòlic del resveratrol més complet de tota la literatura actual, constituït per 21 compostos que engloben als metabòlits de fase II del resveratrol i el piceid i els derivats de l’acció microbiana, proposant les estructures químiques d’aquells dels quals no es disposa estàndard. La quantificació d’aquest perfil, excretat 4 hores després de la ingesta d’una beguda funcional a base d’extracte de raïm, ha demostrat diferències interindividuals significatives. El coneixement de la biodisponibilitat i el metabolisme del resveratrol al llarg del temps s’ha dut a terme amb un estudi farmacocinètic, en el qual s’ha demostrat que, després d’un consum moderat de vi negre i d’un nutracèutic a base d’extracte de raïm, el piceid pot ser absorbit ràpidament en la seva forma intacte, però assolint baixes concentracions; mentre que la formació de metabòlits de resveratrol requereix un temps major, que encara s’allarga més per als d’origen microbià. L’excreció més lenta dels sulfats de resveratrol ha aportat més evidència a la possible saturació de les vies de glucuronidació del resveratrol. Pel que fa a l’efecte de la matriu alimentària, s’ha demostrat que l’alcohol no afecta al metabolisme del resveratrol, estudiant-ne el perfil metabòlic excretat. A més a més, l’excreció urinària global del perfil metabòlic del resveratrol no s’ha vist afectada per la matriu que constitueixen uns comprimits a base d’extracte de raïm, com a producte nutracèutic, en comparació amb la del vi negre; tot i que la dissolució del comprimit implica una absorció retardada dels compostos d’aquest, que fa augmentar la quantitat de metabòlits microbians excretats. / The beneficial effects reported for resveratrol have aroused interest in its consumption, and thus a lot of functional foods or nutraceuticals based on their composition have been developed. Before making nutritional and health claims about these products, more information is required on the resveratrol bioavailability and metabolism after moderate doses consumed and with a special regard on the effect of the food matrix. In such studies, high sensitivity analytical techniques are necessary to allow clear identification of the metabolic profile of resveratrol in biological samples. The aim of this thesis is to determine the metabolic profile of resveratrol when administered at dietary doses in humans and the influence of the food matrix on its bioavailability, as well as to develop a suitable methodology by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS/MS). With the pure metabolite standards now available, an optimized methodology was developed and validated for analysis of the resveratrol metabolic profile. This method defined the widest profile until now available, consisting of 21 compounds which include resveratrol and piceid phase II metabolites and those derived from microbiota, for whose chemical structures were suggested. The quantification of this profile, excreted 4 hours after ingestion of a grape extract functional beverage, demonstrated significant interindividual differences. The behaviour of resveratrol metabolism after the post-ingestion of natural products was studied in a pharmacokinetic study, which showed that, after a moderate consumption of red wine and a grape extract nutraceutical, piceid can be quickly absorbed in its intact form, but achieving low concentrations. Metabolites’ formation required more time and even though for the microbial ones. The slow excretion of resveratrol sulfates provided more evidence to the possible saturation of the glucuronidation pathway. Regarding the food matrix effect, it was demonstrated that alcohol does not affect resveratrol metabolism. In addition, overall urinary excretion of the resveratrol metabolic profile was not affected by the tablet matrix of the grape extract nutraceutical, compared to red wine. However, dissolution of the tablet delayed absorption of their compounds, which increases the amount of microbial metabolites excreted.

17β-nandrolone (17βN) is illegally used in sport and in livestock as a growth promoter.17βN and some of their metabolites have been described as endogenous compounds in some animals, such as adult boars and entire male horses. The aim of this thesis was to identify markers of exogenous administration of 17βN in boars and horses. A method to quantify and identify metabolites of 17βN in the different metabolic fractions has been optimized and validated in boar and horse urine. The method has been applied to urine samples collected after administration of 17βN preparations and to urine samples from non-treated animals to identify endogenous compounds. The following metabolites were identified after the administration of 17βN: 17βN, NorA, NorE, NorEpia, BAB and ABB in boars and 17βN, 17αN, NorEpiA, ABA and ABB in horses. The endogenous compounds detected were: 17βN in boars and horses, and ABA and 17αN only in entire male horses. A chromatographic method by LC/MS/MS has been evaluated to quantify and 17βN sulfate in horse urine and it has been applied to analyze samples from non-treated and treated horses. Concentrations above 30 ng/ml of 17βN sulfate would be evidences of the exogenous administration of 17βN in entire male horses. Preliminary results indicate the capability of GC/C/IRMS analysis to differentiate the endogenous or exogenous origin of 17βN and their metabolites in boars and horses. / La 17β-nandrolona (17βN) s’usa il•legalment en l’esport i com a promotor del creixement en el bestiar. Tant la 17βN com alguns dels seus metabòlits s’han descrit com a compostos endògens en alguns animals, com els porcs adults i els cavalls mascles. L’objectiu de la tesi va ser identificar els marcadors de l’administració exògena de 17βN a porcs i cavalls. Es va optimitzar i validar un mètode basat en la CG/EM per quantificar i identificar els metabòlits de la 17βN en orina de porcs i cavalls en les diferents fraccions metabòliques i es va aplicar a l’anàlisis de mostres procedents d’estudis d’excreció de 17βN i de mostres procedents d’animals no tractats per identificar els compostos endògens. Els metabolits identificats després l’aministració de 17βN van ser: 17βN, NorA, NorE, NorEpiA, BAB i ABB en porcs i 17βN, 17αN, NorEpiA, ABA i ABB en cavalls. Els compostos endògens detectats van ser: 17βN per porcs i cavalls mascles i ABA i 17αN únicament pels cavalls. S’ha avaluat un mètode per CL/EM/EM per quantificar 17βN sulfat en orina de cavall que ha estat aplicat a l’anàlisi de mostres procedents de cavalls no tractats i tractats amb 17βN. Concentracions superiors a 30 ng/ml de 17βN sulfat en orina, seria indicació d’una administració exògena de 17βN. Resultats preliminars obtinguts pel mètode de GC/C/IRMS permeten indicar que mitjançant aquesta tècnica és possible diferenciar l’origen endogen o exogen de 17βN i els seus metabòlits en porcs i en cavalls.

In the present thesis we have explored different factors that impede accurate quantitative description of non-covalent protein-protein and protein-ligand interactions and design of new potent and specific binders from the scratch. Firstly, we addressed the role of solvent in the mechanism of non-covalent interactions. Secondly, we tackled the question about the intrinsic conformational flexibility of the protein molecules and the part it plays in weak interactions between proteins. In the first part of the thesis we studied the interactions of vascular endothelial growth factor (VEGF) protein with five cyclic peptides in solution and gas phase. The results showed that affinities of five ligands to VEGF in solution and gas phase are ranked in inversed order. That is, the that has the highest affinity in solution (as shown by chemical shift perturbation NMR and isothermal titration calorimetry) forms the weakest complex with VEGF in gas phase, and vice versa. We compared gas-phase and solution binding affinities of of five peptides and made qualitative conclusions about the role of the solvent in protein-ligand interactions. In order to obtain more quantitative information about the gas-phase behavior of non-covalent complexes we have developed a combined experimental/theoretical approach to study the energetics of collisional activation of the ion prior to dissociation. We applied developed strategy to model CID in traveling wave ion guide (TWIG) collision cell. We validated the model on the CID of leu-enkephalin peptide and then applied developed strategy to five non-covalent protein-peptide complexes and found activation energies of their dissociation reactions. Next we applied ESI native MS to study the allosteric interactions between the molecular chaperonin GroEL and ATP. The obtained data allowed to construct a scheme of conformational transition of GroEL upon binding of ATP and distinguish between two different cooperativity models, providing strong arguments in favor of Monod-Wyman-Changeux (MWC) model. Finally, be studied the backbone dynamics of VEGF with a combination of NMR relaxation and all-atom force-field based normal mode analysis (NMA). We showed that combination of experimental and computational approach allows to identify flexible zones with higher level of confidence. We also found out that residues, that are involved VEGF-receptor interactions, reside in or close to the flexible zones, suggesting the critical role conformational plasticity plays in the non-covalent protein-protein interactions. / Las biomoléculas de los organismos vivos realizan sus funciones principalmente a través de interacciones débiles reversibles entre ellas. La transducción de señal, la replicación de ADN/ARN, otros procesos enzimáticos y, virtualmente, cualquier otro proceso involucrado en las funciones vitales de cualquier organismo vivo (de las simples amebas, al complejo ser humano), requiere que las moléculas “hablen” entre ellas. Dicho lenguaje se basa en interacciones no covalentes. La flexibilidad conformacional es una propiedad esencial de las grandes biomoléculas, y muchas de las funciones desempeñadas por proteínas se basan en su capacidad para cambiar de conformación en respuesta a un factor externo. Geométricamente hablando, la presencia de flexibilidad en una proteína obstaculiza el diseño racional de medicamentos porque posibilita la existencia de un número muy elevado de conformaciones de dicha proteína. Por este motivo, cualquier información sobre la flexibilidad de una proteína es sumamente valiosa para la comprensión de PPI y PLI y para el diseño racional de medicamentos. Los capítulos 1-3 de la presente tesis versan sobre la solvatación, mientras que la flexibilidad se estudiara en el capitulo 4.

La present tesi doctoral s'ha basat en la caracterització estructural i en l'estudi de les propietats catalítiques de nous complexos de pal·ladi(0) amb lligands olefínics contenint unitats de ferrocè. En una primera fase s'ha desenvolupat la síntesi d'estructures de tipus (E, E, E)-1,6,11-trisarilsulfonil-1,6,11-triazaciclopentadeca-3,8,13-triè contenint des d'una fins a tres unitats de ferrocè i s'ha estudiat la seva complexació amb pal·ladi(0). Mitjançant estudis electroquímics s'ha avaluat la seva possible aplicació en el reconeixement molecular electroquímic. Encara que aquest tipus d'estructures no han resultat vàlides per aquest tipus de processos de reconeixement, l'estudi electroquímic ha permès determinar que la presència del grup ferrocenil influeix en les propietats redox del metall complexat. S'ha descrit també l'obtenció de macrocicles pentaolefínics anàlegs de 25 membres contenint unitats de ferrocè i s'ha estudiat paral·lelament la seva complexació amb pal·ladi(0).En una segona part del treball s'han avaluat les propietats catalítiques del complex (E, E, E)-6,11-bis[(p-metilfenil)sulfonil]-1-ferrocenilsulfonil-1,6,11-triazaciclopentadeca-3,8,13-trièpal·ladi(0), en reaccions clàssicament catalitzades per pal·ladi tals com l'acoblament creuat de Suzuki o la reacció de Heck, i s'ha pogut determinar que és un catalitzador actiu en aquest tipus de reaccions, essent a més possible, la seva recuperació i reutilització. En el cas concret de la reacció de Heck s'han emprat sals de diazoni com a agents arilants i cal destacar que s'ha descrit el primer sistema catalític recuperable i reutilitzable per aquest tipus de reaccions. Mitjançant espectrometria de masses amb ionització per electrospray ha estat possible determinar el rol mecanístic del nostre complex de pal·ladi en la reacció de Heck amb sals de diazoni.Finalment, en una tercera part estructural del treball s'ha estudiat el comportament espectroscòpic dels complexos de pal·ladi(0) anteriorment mencionats, contenint des de tres unitats aríliques iguals fins a tres unitats aríliques diferents. Mitjançant RMN i difracció de raigs-X s'ha determinat que la complexitat estereoquímica dels complexos deriva dels isòmers que es poden formar mitjançant complexació del metall amb cada una de les cares dels tres dobles enllaços continguts a l'estructura. / The present work has been directed towards the structural characterization and the catalytic activity evaluation of new olefinic macrocyclic palladium(0) complexes containing ferrocene units.The synthesis of 15-membered macrocycles, namely (E, E, E)-1,6,11-trisarylsulfonyl-1,6,11-triazacyclopentadeca-3,8,13-triene, containing from one to three ferrocenyl units has been described and its complexation ability towards palladium(0) has been demonstrated. By studying the electrochemical behaviour of the synthesized macrocyclic ligands and their palladium(0) complexes, it has been shown that they do not have application in electrochemical recognition of palladium(0). This electrochemical study has evidenced, though, that the ferrocenyl group is strongly influencing the palladium redox properties. The synthesis of analogous 25-membered pentaolefinic macrocycles containing ferrocene has also been described. Furthermore, a palladium(0) complex of this 25-membered macrocycle has been isolated and characterized by NMR and electrospray ionization mass spectrometry.On the other hand, the catalytic activity of the palladium(0) complex (E, E, E)-6,11-bis[(p-methylphenyl)sulfonyl]-1-ferrocenylsulfonyl-1,6,11-triazacyclopentadeca-3,8,13-trienepalladium(0), has been studied. Our catalyst has shown to be active in Suzuki type cross-couplings and in the Heck reaction, and furthermore, its recovery and reuse has proved to be feasible. Of great importance is the fact that our palladium-triolefinic macrocyclic complex is the first recoverable catalyst described in Heck reaction with arenediazonium cations. Electrospray ionization mass spectrometry has been used as the tool for investigating the mechanistic role of the palladium(0) complex in the Heck reaction.Finally, the spectroscopic behaviour of the formerly mentioned triolefinic palladium(0) complexes containing from one to three aryl units has been studied. By means of NMR and X-ray diffraction, it has been proved that the stereochemical complexity is connected to the different isomers that can be formed by complexation of the metal to one or the other face of each of the three olefins involved.

El càncer de pàncrees és altament agressiu i representa la cinquena causa de mort al mon occidental. Anteriorment, en el nostre laboratori, vam identificar que el receptor tissular del plasminogen (tPA) hi està sobre-expressat i juga un paper important el la progressió tumoral. En la present tesi hem profunditzat en l'estudi del mecanisme molecular de tPA i seus receptors en aquest càncer. En primer lloc hem caracteritzat en detall la interacció de tPA amb Annexina A2 (principal receptor de tPA en endoteli i altament expressada en pàncrees) demostrant que les dades publicades sobre la seqüència responsable de la interacció no eren correctes. A més a més hem caracteritzat les proteïnes de lisats cel·lulars pancreàtics que interaccionen amb tPA mitjançant un assaig pull down i posterior anàlisi proteòmic. de tot identificant un conjunt de possibles lligands de tPA. D'entre aquests hem seleccionat galectina 1, una lectina que mai s'ha descrit que interaccioni amb tPA, per realitzar la caracterització bioquímica i funcional del seu paper com a nou lligand de tPA en càncer de pàncrees. / Pancreatic cancer is a highly aggressive disease and represents the fifth cause of death in occidental world. Our laboratory has previously reported tissue type plasminogen activator (tPA) over expression in this cancer and its role in tumoral progression. During the present thesis we have studied tPA and its molecular mechanism through its receptors in this tumor.We have first characterized tPA interaction with annexin A2 (its main receptor in endothelium and highly expressed in pancreas). Our results showed that published data about the sequence responsible of this interaction was not correct. We have also identified a set of new putative tPA receptors in pancreatic cell lisates using a pull down assay and proteomic analysis. One of the proteins identified was galectin 1, a lectin with not know relation with tPA. We performed a biochemical and functional characterization of the interaction between these two proteins in pancreatic cancer.