FONAMENT: El FcgRIIA és l'únic receptor IgG dels leucòcits capaç d'unir la IgG2, la principal subclasse d'immunoglobulines (Igs) que es genera enfront la infecció per gèrmens encapsulats. Existeixen 2 formes al.lotípiques per a aquest receptor: el FcgRIIA-R131 i el FcgRIIA-H131. Els neutròfils dels individus homozigots FcgRIIA-R/R131 tenen una menor capacitat que els homozigots FcgRIIA-H/H131 per a fagocitar els bacteris encapsulats, incloent el meningococ. Els individus heterozigots tenen una capacitat intermèdia. PACIENTS, MATERIALS I MÈTODES: Estudi cas-control per a determinar si la diferent capacitat fagocítica del FcgRIIA-H/H131 i del FcgRIIA-R/R131 té una repercussió clínica important en pacients amb malaltia meningocòccica (MM) i determinar també si els polimorfismes 308 A/G del TNF (TNF1/TNF2) i 4G/5G del PAI tenen importància en l'evolució i pronòstic de l'MM, tal i com suggereixen alguns autors. Es van analitzar els paràmetres clínics, microbiològics, immunològics i distribució fenotípica dels polimorfismes del FcgRIIA(R/H131), del TNF (TNF1/TNF2) i del PAI-1 (4G/5G), en 145 pacients amb MM microbiològicament comprovada, en comparació amb 290 individus sans randomitzats sense MM. La determinació dels polimorfismes es va realitzar mitjançant tècniques de reacció en cadena de la polimerasa i també es van determinar els nivells de complement i Igs. Es va aplicar una escala pronòstica basada en l'edat, la presa d'antimicrobians prèvia a l'ingrés i la presència de signes neurològics focals o de diàtesi hemorràgica. RESULTATS: Les dades generals dels episodis d'MM no van mostrar diferències imporants respecte d'altres treballs publicats a la literatura mèdica sobre MM. La distribució dels al.lotips FcgRIIA entre pacients i controls fou similar. L'al.lotip R/R131 va tenir una prevalença major a les formes més greus d'MM: fulminants quant a temps d'evolució (OR = 3.77, IC: 1.10 - 13.70, p = 0.03), i septicèmiques quant a Microbiologia (OR = 2.7, IC: 1.22 - 6.02, p = 0.012). Les complicacions també van ser significativament més freqüents en els pacients amb genotip R/R131 (OR: 2.6, IC: 1.20 - 5.71, p = 0.013). Dels 46 pacients amb al.lotip R/R131, 30 (65%) van obtenir una puntuació de mal pronòstic a l'escala pronòstica utilitzada, en comparació al 19% (13 de 67) dels que tenien l'al.lotip H/R131 i només el 15% (5 de 32) dels pacients amb genotip H/H131 (p<0.0001). No es van trobar diferències significatives en la distribució dels al.lotips del FcgRIIA respecte de l'aparició de seqüeles. El nostre estudi no va poder demostrar la influència dels polimorfismes del TNF (308 A/G) i del PAI-1 (4G/5G) respecte de l'adquisició, evolució i pronòstic de l'MM. CONCLUSIONS: L'al.lotip FcgRIIA-R/R131 s'associa a formes més greus d'MM, a un major nombre de complicacions i a un pitjor pronòstic. Els polimorfismes del TNF i del PAI-1 no influencien ni l'adquisició ni l'evolució de l'MM. / BACKGROUND: The FcgRIIA is the only leukocyte immunoglobulin(Ig)G receptor that can bind IgG2, the most Ig subclasse that has originated in front of encapsulated bacteria infections. There are two allotypic forms of this receptor, designated as FcgRIIA-R131 and FcgRIIA-H131. Neutrophils from homozygous FcgRIIA-R/R131 donors are less effective than FcgRIIA-H/H131 neutrophils at the phagocytosis of encapsulated bacteria, including meningococci. Heterozygous neutrophils are intermediate levels of efficacy. SUBJECTS AND METHODS: Case-control study to determine if the differing phagocytic capacities of FcgRIIA-H/H131 and FcgRIIA-R/R131 have clinical relevance in patients with meningococcal disease (MD) and also to determine if the 308 A/G-TNF polymorphism (TNF1/TNF2) and 4G/5G-PAI polymorphism have importance in the clinical outcome and prognosis of MD as some authors have suggested. Clinical manifestations, microbiologic and immunologic data and phenotype distribution of FcgRIIA (R/H131), TNF (TNF1/TNF2) and PAI-1(4G/5G) polymorphisms were analyzed in 145 patients with microbiologically proved MD (cases) and the results were compared with 290 randomized asymptomatic sex-matched blood donors (controls) without MD. Polymorphisms are determined by a polymerase chain reaction (PCR) procedures and serum levels of complement and Igs are also measured. Prognostic score based on age, hemorrhagic diathesis, neurologic signs and the absence of preadmission antibiotic was calculated. RESULTS: general data of MD episodes were not different in relation to another medical reports about MD. The distribution of FcgRIIA allotypes were similar in cases and controls. The FcgRIIA-R/R131 allotype were more common among more severe forms of MD: fulminant MD (OR = 3.77, IC: 1.10 - 13.70, p = 0.03) and meningococcemia without meningitis (OR = 2.7, IC: 1.22 - 6.02, p = 0.012). Complications were also significantly more frequent in patients with the R/R131 allotype (OR: 2.6, IC: 1.20 - 5.71, p = 0.013). Of the 46 patients with the R/R131 allotype, 30 (65%) had an adverse prognostic score, compared with 19% (13 of 67) of those with the R/H131 allotype and only 15% (5 of 32) of those with the H/H131 allotype (p < 0.0001). No significant differences have seen in FcgRIIA allotypes distribution with regard to risk of developing sequelae. Our study could not demostrate the influence of the TNF (308 A/G) and PAI-1 (4G/5G) polymorphisms on the risk, outcome and prognosis of MD. CONCLUSION: The FcgRIIA-R/R131 allotype is associated with more severe forms of MD, more complications and a worse prognosis. The TNF and the PAI-1 polymorphisms have not influence on the risk and outcome of MD.

In most cases, organic materials exist in the solid phase as polymorphs, solvatomorphs or amorphous forms. Physico-chemical properties in the solid-state are all affected primarily in terms of dissolution, solubility, bioavailability, stability and processability. Therefore investigation into the polymorphic behaviour of APIs has become a mandatory part of drug characterisation studies by pharmaceutical companies (Giron, 2001). The influence polymorphism has on bioavailability and the need for the development of drugs in the amorphous form have instigated regulatory bodies such as the FDA to require solid-state characterisation of pharmaceuticals (Strachan et al., 2005). Subsequently a study was conducted to determine the physico-chemical properties of two poorly watersoluble macrolides; clarithromycin and spiramycin. Characterisation methods included: XRPD, IR, TGA, DSC, SEM, Karl Fischer titration, solubility and stability studies. Recrystallisations of spiramycin from various solvents indicated that this API mainly exists in the amorphous form. The DSC proved to be of little value in the characterisation of this particular macromolecular antibiotic, since wide inter-sample variations were mostly obtained. TGA results showed higher solvent uptake than expected. This was ascribed to the amorphous, sponge-like character of this drug. For the sake of reproducibility and quality of the results, characterisation of spiramycin was more reliant on spectroscopic and crystallographic methods. Samples generated from 2- butanol, chloroform, ethyl acetate, 1.4-dioxane, methanol, n-propanol, iso-propanol and tetrahydrofuran showed characteristic peaks in the range of 2000-2400 cm-1 that were not present in the IR spectrum of the raw material. Conversely, the XRPD patterns were all identical, exhibiting a characteristic “halo” pattern with no detectable Bragg diffraction peaks. A solubility assessment showed no significant differences between the raw material and the recrystallisation products. In fact the raw material seemed to be the form with the highest solubility, albeit it only by a small margin. According to the literature, clarithromycin exists in five forms. Form 0 exists as a solvate, form I is a metastable form, form II is the stable form (Liu & Riley 1998; Deshpande et al., 2006), form III is a solvate of acetonitrile (Liu et al., 2003; Liang & Yao, 2008) and form IV is a hydrate (Avrutov et al., 2003). The stable form II is used in formulations currently on the market. A follow-up study was done relating to a study performed by De Jager (2005). The raw material (form II) was recrystallised from acetonitrile, chloroform and ethyl acetate. Two new crystal forms were prepared from chloroform and acetonitrile. With the necessary driving force, both of these crystals forms are able to convert to the thermodynamically stable form II. In addition, a solvate recrystallised from chloroform together with its corresponding desolvate, showed a 4 and 1.5 fold respective increase in solubility when compared to the raw material. The recrystallisations from ethyl acetate delivered crystals with an XRPD pattern similar to form II. This proved that clarithromycin can be recrystallised directly from this solvent without the need of an additional conversion step, as was the case in the study done by De Jager (2005). / MSc (Pharmaceutics), North-West University, Potchefstroom Campus, 2013

La nefropatia diabètica és una complicació secundària greu de la diabetis i es desenvolupa en el 35% d'aquests pacients. Estudis d'agrupació familiar han suggerit que aquesta malaltia podria estar subjecta a un component genètic.Aquesta tesi s'ha centrat en l'estudi de la influència de 6 polimorfismes de gens del sistema renina-angiotensina amb la progressió de la nefropatia, i amb la mortalitat en diàlisi de pacients diabètics de tipus 2. També s'ha inclòs un estudi preliminar que explora la relació entre els polimorfismes i la instauració de la nefropatia.La classificació genotípica dels pacients s'ha dut a terme mitjançant la tècnica de PCR-RFLP o bé PCR a temps real. S'han genotipat els següents polimorfismes: I/D del gen que codifica per l'enzim convertidor d'angiotensina I (ACE1), p.M235T del gen que codifica per l'angiotensinogen (AGT), g.1166A>C del gen que codifica pel receptor d'angiotensina II de tipus 1 (AGTR1), c.186+2053G>A, c.439+4C>T i c.1542-361C>G del gen que codifica per l'enzim convertidor d'angiotensina I de tipus 2 (ACE2).La influència dels polimorfismes sobre la mortalitat en diàlisi s'ha estudiat mitjançant una anàlisi de la supervivència amb models de regressió de Cox multivariant amb 100 pacients diabètics de tipus 2 que havien iniciat tractament amb diàlisi al nostre centre hospitalari. A la regressió de Cox individual de cada polimorfisme, l'I/D de l'ACE1 i el p.M235T de l'AGT van presentar efectes significatius sobre la mortalitat. Concretament el genotip DD va explicar un augment del risc de mortalitat de 3,5 (1,3 - 9,9) vegades el dels pacients II, i el genotip MM al seu torn va explicar un augment del risc de mortalitat de 3,8 (1,2 - 12,4) vegades el dels pacients TT. En l'estudi conjunt dels polimorfismes es va observar que el nombre d'al·lels D (I/D), M (p.M235T) i G (c.186+2053G>A) que tenia un pacient determinava de forma estadísticament significativa un increment del risc de morir (p=0,002) de tal forma que els pacients amb els sis al·lels de risc tenien una probabilitat de morir 11 vegades superior als que no en tenien cap. La influència dels polimorfismes sobre la progressió de la nefropatia una vegada ja establerta es va estudiar mitjançant models de Cox i de regressió lineal multivariant amb 320 pacients diabètics de tipus 2 diagnosticats d'insuficiència renal crònica d'estadis 1-3. Pel que fa a l'estudi individual dels polimorfismes, es va observar una relació estadísticament significativa entre el pendent de disminució d'MDRD i els polimorfismes p.M235T de l'AGT, c.186+2053G>A i c.1542-361C>G de l'ACE2 -els dos darrers únicament en els homes-. Aquesta relació va ser encara més intensa amb els pacients amb velocitat de filtració glomerular encara conservada (> 60 mL/min/1,73 m2) a la primera visita. L'estudi conjunt dels polimorfismes va mostrar que la combinació d'al·lels que millor estimava la progressió de la nefropatia (p=0,0005) era la formada per D (I/D), M (p.M235T) i A (c.186+2053G>A). El fet de tenir els 6 al·lels de risc respecte no tenir-ne cap, explicava una pèrdua anual de la velocitat de filtració glomerular de -5,2 mL/min/1,73 m2.Finalment, la influència dels polimorfismes sobre l'establiment de la nefropatia es va estudiar mitjançant models de regressió logística multivariant amb 227 casos i 69 controls. No es va poder evidenciar cap efecte genètic en la instauració de la nefropatia.Els resultats presentats en aquesta tesi posen de manifest que els polimorfismes I/D, p.M235T, c.186+2053G>A i en menor importància c.1542-361C>G actuen conjuntament influint en la mortalitat dels pacients diabètics de tipus 2 en diàlisi i en la progressió de la nefropatia. Per contra, no hem pogut demostrar que estiguin relacionats en la susceptibilitat a desenvolupar la nefropatia. / Diabetic nephropathy is a severe secondary complication of diabetes that is developed in 35% of these patients. Studies of family association have suggested that this illness could be subject to a genetic component.This thesis studies the influence of 6 polymorphisms of the renin-angiotensin system genes on the progression of the nephropathy, and mortality in dialysis of type 2 diabetic patients. It has also been included a preliminary study that explores the relationship between these polymorphisms and the development of nephropathy.The genotypic classification of the patients has been carried out through PCR-RFLP or real time PCR. The following polymorphisms have been genotyped: I/D of the angiotensin-converting enzyme gene (ACE1), p.M235T of the angiotensinogen gene (AGT), g.1166A>C of the type1 angiotensin II receptor type 1 gene (AGTR1) and c.186+2053G>A, c.439+4C>T and c.1542-361C>G of the angiotensin-converting enzyme 2 gene (ACE2).The influence of these polymorphisms on mortality in dialysis has been studied through Cox regression analysis with 100 type 2 diabetic patients that began dialysis in our Hospital. The individual Cox regressions of each polymorphism, I/D (ACE1) and p.M235T (AGT) showed significant effects on mortality. Specifically, DD genotype explained an increased mortality risk of 3,5 (1,3 - 9,9) times that of II patients, and MM genotype explained an increased mortality risk of 3,8 (1,2 - 12,4) times that of TT patients. In the combined study of polymorphisms it was observed that the number of D (I/D), M (p.M235T) and G (c.186+2053G>A) alleles that a patient carries determined the mortality risk (p=0,002): patients with the six risk-alleles had a probability of death 11 times that of those patients without any risk-allele.The influence of the polymorphisms on nephropathy progression was studied through Cox and linear regression multivariate analysis with 320 type 2 diabetic patients diagnosed of chronic kidney disease from stages 1 to 3. Regarding the individual study of polymorphisms, a statistically significant relationship was observed between the glomerular filtration rate slope decrease and p.M235T (AGT), c.186+2053G>A and c.1542-361C>G (ACE 2). This relationship was still more intense with patients that presented with a preserved glomerular filtration rate (> 60 mL/min/1,73 m2) in their first visit. The combined study of polymorphisms showed that the combination of D (I/D), M (p.M235T) and T (c.186+2053G>A) alleles best predicted progression (p=0,0005): patients with the six risk alleles had an annual loss of glomerular filtration rate of -5,2 mL/min/1,73 m2 with respect to those patients without any risk-allele.Finally, the influence of the polymorphism on the development of nephropathy was studied through multivariate logistical regression analysis with 227 cases and 69 controls. No genetic effect was found.The results presented in this thesis bring to light that I/D, p.M235T, c.186+2053G>A and c.1542-361C>G polymorphisms act together influencing on the mortality of type 2 diabetic patients in dialysis and in nephropathy progression. In return, we have not been able to prove their relationship with the development of nephropathy.

ESTUDIO: Se sabe que DPYD interviene en procesos catabólicos ó de degradación del 5-fluorouracilo, así como el enzima CDA participa en procesos anabólicos, al proveer de sustrato a la timidilato sintetasa para la síntesis de DNA, y por analogía, en la síntesis de RNA. Por lo tanto, la incorporación de la molécula de 5-FU por semejanza a la molécula de uracilo en procesos anabólicos significa el freno en la síntesis de DNA y de RNA tumoral, al "engañar" el fármaco a los enzimas de estas vías.OBJETIVOS: 1. Analizar polimorfismos en los genes dihidropirimidina dehidrogenasa (DPYD) y citidina deaminasa (CDA); 2. Determinar si estos polimorfismos aumentan o disminuyen la actividad del enzima; y 3. Comprobar si estos polimorfismos están implicados en la supervivencia de pacientes tratados con quimioterapia adyuvante con Tegafur. MÉTODOS: Análisis de polimorfismos por discriminación alélica de muestras parafinadas de 53 pacientes con cáncer gástrico con seguimiento por el Servicio de Oncologia del Hospital Clinic de Barcelona entre mayo de 1995 y noviembre de 2003 que recibieron quimioterapia adyuvante con Tegafur, un profármaco del 5-fluorouracilo y para DPYD Ile543Val (A/G), DPYD Arg29Cys (C/T) y CDA Lys27Gln (A/C). CONCLUSIONES: Polimorfismos en DPYD Ile543Val, DPYD Arg29Cys y CDA Lys27Gln pueden predecir el pronóstico, supervivencia y toxicidad de pacientes con cáncer gástrico tratados con quimioterapia adyuvante con 5-FU. Polimorfismos en DPYD inducen deficiencia en este gen, dando lugar a una actividad aumentada de los derivados de 5-fluorouracil con posible toxicidad, y en concreto se ha observado una mayor supervivencia y significancia estadística para pacientes con DPYD Ile543Val A/G ó G/G. También se observó significancia estadística en pacientes homocigotos para la combinación de DPYD Arg29Cys más CDA Lys27Gln frente a heterocigotos. La asociación de un tercer polimorfismo (DPYD Ile543Val) no tuvo correlación clinica. Las frecuencias alélicas para DPYD Arg29Cys diferían de los valores de las bases de datos obtenidas por Internet para el resto de la población mundial. / "Dihydropyrimidine dehydrogenases (DPYD) and cytidine deaminase (CDA) gene polymorphisms as genomic predictors of clinical outcome in resected gastric cancer patients (GCP) treated with fluoropyrimidine based chemotherapy".BACKGROUND: Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of DPYD gene induces deficiency in this gene resulting in a increased activity of 5-fluorouracil derivates in treatment of colorectal cancer patients. In GCP has not been previously analysed.OBJECTIVES: 1. To analyse polymorphisms in the genes dihydropyrimidine dehydrogenase (DPYD) and cytidine deaminase (CDA); 2. To prove if these polymorphisms increase or decrease the activity of the enzyme; and 3. To observe if these polymorphisms are involved in the survival of patients treated with adjuvant chemotherapy with Tegafur.METHODS: Analysis of polymorphisms by allelic discrimination of paraffin-embedded biopsies from 53 consecutive GCP of the Department of Oncology in the Hospital Clinic of Barcelona in the period of time between May 1985 and November 2003, who received adjuvant chemotherapy with Tegafur, one prodrug of 5-fluorouracil, for DPYD Ile543Val (A/G), DPYD Arg29Cys (C/T) and CDA Lys27Gln (A/C).CONCLUSIONS: Polymorphisms of DPYD Ile543Val, DPYD Arg29Cys and CDA Lys27Gln predict outcome, survival and toxicity of GCP treated with 5-FU based adjuvant chemotherapy, with major survival with statistic significance for patients DPYD Ile543Val A/G ó G/G and for homozygous patients for the combination of DPYD Arg29Cys plus CDA Lys27Gln front heterozygous. The association of one third polymorphism (DPYD Ile543Val) hadn't clinic correlation.

In most cases, organic materials exist in the solid phase as polymorphs, solvatomorphs or amorphous forms. Physico-chemical properties in the solid-state are all affected primarily in terms of dissolution, solubility, bioavailability, stability and processability. Therefore investigation into the polymorphic behaviour of APIs has become a mandatory part of drug characterisation studies by pharmaceutical companies (Giron, 2001). The influence polymorphism has on bioavailability and the need for the development of drugs in the amorphous form have instigated regulatory bodies such as the FDA to require solid-state characterisation of pharmaceuticals (Strachan et al., 2005). Subsequently a study was conducted to determine the physico-chemical properties of two poorly watersoluble macrolides; clarithromycin and spiramycin. Characterisation methods included: XRPD, IR, TGA, DSC, SEM, Karl Fischer titration, solubility and stability studies. Recrystallisations of spiramycin from various solvents indicated that this API mainly exists in the amorphous form. The DSC proved to be of little value in the characterisation of this particular macromolecular antibiotic, since wide inter-sample variations were mostly obtained. TGA results showed higher solvent uptake than expected. This was ascribed to the amorphous, sponge-like character of this drug. For the sake of reproducibility and quality of the results, characterisation of spiramycin was more reliant on spectroscopic and crystallographic methods. Samples generated from 2- butanol, chloroform, ethyl acetate, 1.4-dioxane, methanol, n-propanol, iso-propanol and tetrahydrofuran showed characteristic peaks in the range of 2000-2400 cm-1 that were not present in the IR spectrum of the raw material. Conversely, the XRPD patterns were all identical, exhibiting a characteristic “halo” pattern with no detectable Bragg diffraction peaks. A solubility assessment showed no significant differences between the raw material and the recrystallisation products. In fact the raw material seemed to be the form with the highest solubility, albeit it only by a small margin. According to the literature, clarithromycin exists in five forms. Form 0 exists as a solvate, form I is a metastable form, form II is the stable form (Liu & Riley 1998; Deshpande et al., 2006), form III is a solvate of acetonitrile (Liu et al., 2003; Liang & Yao, 2008) and form IV is a hydrate (Avrutov et al., 2003). The stable form II is used in formulations currently on the market. A follow-up study was done relating to a study performed by De Jager (2005). The raw material (form II) was recrystallised from acetonitrile, chloroform and ethyl acetate. Two new crystal forms were prepared from chloroform and acetonitrile. With the necessary driving force, both of these crystals forms are able to convert to the thermodynamically stable form II. In addition, a solvate recrystallised from chloroform together with its corresponding desolvate, showed a 4 and 1.5 fold respective increase in solubility when compared to the raw material. The recrystallisations from ethyl acetate delivered crystals with an XRPD pattern similar to form II. This proved that clarithromycin can be recrystallised directly from this solvent without the need of an additional conversion step, as was the case in the study done by De Jager (2005). / MSc (Pharmaceutics), North-West University, Potchefstroom Campus, 2013

El gènere Drosophila està format per un conjunt d'espècies ampliament distribuïdes arreu del món i que han estat objecte de nombrosos estudis de recerca en Genètica des de començaments del segle XX. Una de les espècies no cosmopolites més estudiada ha estat Drosophila subobscura. El nostre grup de treball ha investigat durant molts anys la dinàmica microevolutiva d'aquesta espècie a nivell molecular - estudis inicials de la variabilitat al·loenzimàtica i posteriorment l'anàlisi de loci microsatèl·lits i seqüènciació del gen Odh - i també a nivell dels gens letals i del polimorfisme cromosòmic per inversions. Cal destacar les implicacions evolutives que ha tingut el fenomen de la colonització d'Amèrica duta a terme per aquesta espècie, el qual ha permès demostrar el caràcter adaptatiu del polimorfisme cromosòmic per inversions, així com la rapidesa amb la que es poden establir en les àrees colonitzades clines latitudinals tant per aquest polimorfisme com per caràcters quantitatius, equivalents a les que es troben a la regió paleàrtica d'origen. Aquests diferents nivells analitzats de la genètica evolutiva de D.subobscura calia completar-los amb un coneixement més profund del comportament de la espècie en estat salvatge. D.subobscura és una espècie generalista i de fet es disposa de poques dades referents a alguns aspectes bàsics del seus ritmes d'activitat dintre de l'ecosistema natural. Per exemple, no sabem amb certesa quantes generacions té al any ni perquè presenta fluctuacions tan fortes del cens poblacional. Les dades relatives a la seva capacitat de dispersió també son escasses. De fet, és molt important poder disposar d'informació respecte als ritmes d'activitat diària i estacional de les espècies per poder entendre l'estructura genètica de les poblacions i estimar alguns paràmetres bàsics dels models teòrics de genètica evolutiva.En aquesta Tesi Doctoral s'ha estudiat la dinàmica microevolutiva de D.subobscura en relació a la d'altres espècies de Drosophila simpàtrides situades en la mateixa localitat, tot relacionant-la amb alguns paràmetres ambientals. S'ha intentat obtenir un conjunt de dades i resultats que pal·liessin, fins a on fos possible, la manca de coneixements que hi ha respecte a alguns aspectes de l'ecologia evolutiva de l'espècie, fonamentals per entendre l'estructura genètica de les poblacions. S'ha analitzat l'activitat diària de D.subobscura i la d'altres drosofílids, els ritmes estacionals que presenten aquestes poblacions, la relació de l'activitat de les espècies amb determinats factors ambientals com la temperatura, la humitat i la lluminositat (utilitzant l'angle solar), així com la resposta diferenciada segons els sexes. Un altre aspecte fonamental estudiat ha estat la variació a llarg termini de la composició d'espècies i les seves possibles causes. La finalitat de tot aquest treball és obtenir informació que ens permeti entendre millor els processos d'adaptació i les conseqüències de la selecció natural, així com en un terreny més aplicat, obtenir dades relatives a la variació de la biodiversitat tan a curt com a llarg termini.

Se ha estudiado la evolución molecular de los genes del sistema olfatorio OS-E y OS-F en especies del subgénero Sophophora de Drosophila, concretamente en especies de los grupos melanogaster y obscura. Los genes OS (olfactory-specific) codifican para proteínas de la familia de las OBPs (Odorant Binding Proteins), proteínas de unión a odorantes (i/o feromonas), que debido a su función en el sistema de reconocimiento del medio externo podrían, a priori, haber sufrido cambios de tipo adaptativo. El objetivo ha sido estudiar el posible impacto de la selección natural positiva en la evolución de estos genes en Drosophila. Los resultados se han descrito en cuatro artículos:En el primer artículo se describe el análisis de la variabilidad nucleotídica en una región de unas 7kb que incluye los genes OS-E y OS-F en cuatro especies del subgrupo melanogaster de Drosophila, Drososphila melanogaster, D. simulans, D. mauritiana y D. erecta, así como en una población natural de Drosophila melanogaster. Los resultados indican que los genes OS-E y OS-F están presentes en las cuatro especies investigadas y mantienen su estructura génica. Las estimas de polimorfismo y divergencia nucleotídica soportan la hipótesis de que ambos genes son funcionales, aunque presentan diferencias en su tasa evolutiva y en su constricción funcional. Algunas de las observaciones no son compatibles con el modelo neutro.En el segundo artículo se describe la caracterización, secuenciación y análisis de la variabilidad nucleotídica de la región genómica que incluye los genes del sistema olfativo OS-E y OS-F en una población europea y en otra africana de la especie D. simulans. Las estimas de variación silenciosa y de la tasa de recombinación son mayores en D. simulans. que en D. melanogaster. Además, la población europea de D. simulans. presenta una estructura haplotípica inusual, donde la mitad de las secuencias son prácticamente idénticas (difiriendo en tan sólo una sustitución nucleotídica). Esta estructuración es incompatible con las predicciones de la teoría neutralista para poblaciones en equilibrio estacionario. En el tercer artículo se investiga la variación nucleotídica de la región que incluye los genes OS-E y OS-F en dos ordenaciones cromosómicas (O[3+4] y O3+4+23), presentes en dos poblaciones naturales de Drosophila subobscura. El análisis de los niveles y patrón del polimorfismo de DNA son consistentes con un origen monofilético de la inversiones. A pesar de que las dos ordenaciones cromosómicas están fuertemente diferenciadas, existen evidencias de que ha habido flujo genético entre las mismas, probablemente provocado por eventos de conversión génica. Los tests basados en la distribución de las frecuencias de las mutaciones indican que las ordenaciones cromosómicas no se encuentran en equilibrio. Bajo una hipótesis de expansión, se ha estimado que la inversión O23 se originó hace unos 0.25 millones de años.En el último artículo se analiza la evolución molecular de las secuencias codificadoras de los genes OS-E y OS-F en 14 especies del subgénero Sophophora de Drosophila. El trabajo se ha realizado combinando análisis por máxima verosimilitud de la variabilidad sinónima y no sinónima (mediante el uso de modelos evolutivos de codones), con la información de la putativa estructura tridimensional de la proteína. Se ha estimado que la duplicación que originó los dos genes pudo ocurrir hace unos 43-94 millones de años. Los resultados indican que a pesar de que ambos genes presentan una gran y similar constricción funcional, el gen OS-E presenta una tasa evolutiva global significativamente más alta. Los resultados de este capítulo, así como del trabajo en general, sugieren que la selección natural positiva actuó sobre posiciones concretas de la zona codificadora de estos dos genes, y pudo tener un papel importante en la preservación de los dos genes duplicados en el genoma. / We have studied the molecular evolution (at intraspecific and interspecific levels) of two members of the OBP (Odorant Binding Protein) gene family (the OS-E and OS-F genes) in different Drosophila species. These genes likely originated by an old gene duplication event, still maintaining a high conservation at the gene structure, amino acid, and nucleotide levels. In this study, we detected significant differences in the evolutionary rate and functional constraint between the two genes. The results are unlikely for a neutral evolving region. We also found that levels of silent variation and recombination rates are significantly higher in "Drosophila simulans" than in "D. Melanogaster". Additionally, we detected that the European population of "D. Simulans" is highly structured, with a very unusual haplotype configuration that deviates significantly from the neutral expectations.In "D. Subobscura" this region maps on the O chromosome. In particular, the OS-region is located close to one of the breakpoints of the inversion O23. The analysis of the patterns of nucleotide variation at the OS-E and OS-F genes in "D. Subobscura" in two different chromosomal inversions showed that nucleotide variation is not at the steady-state equilibrium, but reflects the expansion process caused by the increase in frequency of the inversion. Finally, we analyzed nucleotide variation at the OS-E and OS-F genes in a number of Drosophila species to understand the evolutionary forces underlying their molecular evolution in this genus. We applied random and fixed-effects models, integrating information of DNA polymorphism, amino acid and nucleotide-based divergence, and 3D structure data to determine the selective constraint levels, and the putative role of positive selection in the evolutionary history of these genes, and especially in the maintenance of these duplicated gene copies. The results of these analyses allows concluding that positive selection is likely involved in the evolution of these genes in Drosophila.

L'osteoporosi, una malaltia complexa determinada tant per factors genètics com ambientals, està caracteritzada per una reduïda densitat mineral òssia (DMO), un deteriorament de la microarquitectura òssia i un augment del risc de patir fractures osteoporòtiques. En el present treball ens vam plantejar estudiar les causes genètiques que determinen l'aparició de l'osteoporosi mitjançant la realització d'estudis d'associació i estudis funcionals. Els gens candidats clàssics per a l'osteoporosi que hem analitzat han estat el gen COL1A1, el gen ESR1, el gen VDR i el gen TGFB1. Els estudis d'associació s'han dut a terme en la cohort BARCOS formada per dones postmenopàusiques de l'àrea de Barcelona. Els resultats obtinguts en la cohort BARCOS han estat incorporats en el projecte GENOMOS (metaanàlisi prospectiva amb 20.000 mostres). En la cohort BARCOS vam observar que polimorfismes de canvi puntual de nucleòtid (SNP) del gen COL1A1 així com també determinats haplotips i la interacció entre ells o bé amb SNPs del gen VDR es trobaven associats a la DMO. Pel que fa al gen ESR1, vam trobar que l'haplotip LPX es trobava associat a la DMO femoral. Els resultats del projecte GENOMOS, van mostrar que només el polimorfisme Sp1 del gen COL1A1 es trobava associat a la DMO. En el projecte GENOMOS, els polimorfismes XbaI (ERSR1), Cdx2 (VDR) i Sp1 (COL1A1) es van trobar associats al risc de patir fractures.En la cohort BARCOS també vam analitzar l'efecte de SNPs situats en gens candidats no clàssics (RUNX2 i IL6R). Pel que fa a RUNX2 vam trobar que un SNP del promotor 2, però no un SNP del promotor 1 es trobava associat a la DMO femoral. Aquesta ha estat la primera vegada que SNPs del gen IL6R s'han analitzat en relació a fenotips osteoporòtics. Vam observar que SNPs i haplotips en aquest gen es trobaven associats a la DMO femoral i a l'índex de massa corporal (IMC). Com a segon objectiu ens vam plantejar completar l'estudi funcional dels SNPs del promotor del gen COL1A1 (-1997 G/T i -1663 indelT) en relació a les proteïnes CIZ/NMP4 i BMP2. Prèviament s'havia descrit que la proteïna CIZ/NMP4, un factor de transcripció arquitectònic que inhibeix la via osteoblastogènica de la BMP2, s'unia a la regió nucleotídica on es troba el SNP -1663 indelT. En les cèl·lules Saos-2 vam observar que el patró de transcripció de diferents construccions del promotor del gen COL1A1 fusionat al gen de la luciferasa era similar tant si aquestes eren tranfectades de manera estable o bé de forma transitòria. En estudiar l'efecte de la BMP2 sobre l'activitat transcripcional del gen COL1A1, vam observar que mentre el promotor basal disminuïa la seva activitat en presència de BMP2, les altres construccions analitzades l'augmentaven. Les construccions que eren estimulades en major grau presentaven la regió del promotor on es troben els polimorfismes. Tot i això, analitzant els diferents haplotips, vam observar que aquests no participaven en l'estimulació induïda per BMP2. In silico la regió estimulada per BMP2, presenta dues possibles caixes d'unió de factors de transcripció de la via de la BMP2. En mutagenitzar-les per separat, però, aquestes no van semblar participar en l'estimulació induïda per la BMP2. Seguidament vam analizar el patró d'expressió de CIZ/NMP4 en diversos teixits humans i vam observar que diverses isoformes s'expressaven simultàniament en tots ells i també en les cèl·lules d'osteosarcoma humanes Saos-2 i MG-63. Es van identificar les isoformes 11H, CIZ6.1, 21H i 21H-I1. Aquestes dues últimes van ser clonades i sobrexpressades de manera estable en les cèl·lules Saos-2, les quals es van transfectar transitòriament amb el promotor del gen COL1A1 i es van tractar amb BMP2. Els resultats van indicar que CIZ/NMP4 augmentava lleugerament la transcripció del gen COL1A1 en absència de BMP2. En presència de BMP2, i contràriament al què s'esperava, vam observar que la sobrexpressió de CIZ/NMP4 no tenia cap efecte. / "ASSOCIATION AND FUNCTIONAL STUDIES WITH CANDIDATE GENES FOR OSTEOPOROSIS" TEXT:Osteoporosis, a complex disease determined by genetic and environmental factors, is characterized by a reduced bone mineral density (BMD) and an increased risk of fracture. In this thesis we studied the genetic component of osteoporosis through association and functional studies. The classical candidate genes for osteoporosis we analyzed were COL1A1, ESR1, VDR and TGFB1. The association studies were performed with the BARCOS cohort, a group of postmenopausal women from Barcelona. The results obtained in this cohort were included in a prospective metaanalysis called GENOMOS (20,000 samples). In the BARCOS cohort we observed that SNPs in the COL1A1 gene, their haplotypes and interactions, and interactions with SNPs in the VDR gene were associated with BMD. The haplotype LPX (ESR1) was also associated with BMD. In GENOMOS, although several SNPs were found to be associated with fracture risk, the Sp1 polymorphism (COL1A1) was the only one associated with BMD. In the BARCOS cohort we also found that one SNP situated in promoter 2 of RUNX2 gene, but not one situated in promoter 1, was associated with BMD. Finally, this was the first time that SNPs in IL6R gene were analyzed in relation to osteoporosis and we found that they were associated with BMD and also with body mass index (BMI). The second aim of this thesis was the functional study of two SNPs situated in the promoter of COL1A1 gene in relation to CIZ/NMP4 and BMP2 proteins. It was known that CIZ/NMP4, an architectural transcription factor that inhibits the BMP2 osteoblastogenic pathway, binded to the COL1A1 promoter. We observed that the transcription pattern of differnt constructs of COL1A1 promoter was similar between transient and stable transfections. BMP2 stimulated all these constructs, except for the basal promoter. The constructs that were stimulated more, contained the region where the SNPs lie, but when the haplotypes were analyzed no differences were observed between them. In this region there are two putative transcription factor sites for the BMP2 pathway, but they seemed not to participate in the BMP2 stimulation. Several isoforms of CIZ/NMP4 were simultaneously expressed in different tissues. We identified 11H, CIZ6.1, 21H and 21H-I1 isoforms. These two last were stably overexpressed in Saos-2 cells, which were then transiently tranfected with COL1A1 promoter and treated with BMP2. In absence of BMP2, overexpression of CIZ/NMP4 isoforms slightly increased COL1A1 transcription.

In this work we have analyzed the variation of (i) several X chromosome polymorphic Alu insertions and (ii) several SNPs and microsatellites within and around the genomic regions of the genes coding for coagulation factors VII and XII (F7 and F12 respectively) in different human populations - mainly Mediterranean, but also from other geographic regions. Alu polymorphisms are very useful for anthropological studies to investigate the origin and genetic relationships between different human populations. In addition, there are certain mutations in the F7 and F12 genes that affect plasma levels of coagulation factors VII and XII, as well as the risk of cardiovascular diseases, with a high epidemiological relevance. The main conclusions of the thesis are the following: 1. Genetic differentiation among populations of northern Africa and southern Europe is low but significant. 2. For the same range of geographical distances in the Mediterranean, the genetic distances between populations from opposite coasts are longer than those between populations of the same coast, indicating that the Mediterranean may have acted as a barrier to gene flow between northern Africa and southern Europe. 3. Haplotype analysis of the F7 and F12 genomic regions has provided evidence of a higher sub-Saharan gene flow to northern Africa than to Southern Europe. This observation may be the result of the existence of a genetic barrier in the Mediterranean. 4. As shown by the principal component analysis, genetic differentiation between the studied populations in southern Europe is less pronounced than that in Africa. 5. Unlike previous studies, the genetic variation studied in this work showed that the Basques present no special genetic characteristics compared to other southern European populations. 6. According to the X chromosome Alu polymorphisms, the Egyptian Berbers from the Siwa Oasis appear as the most differentiated population within North African with a strong sub-Saharan influence. 7. The data indicate that, of all North African populations, the population of Monastir in Tunisia is genetically closest to Europe, possibly due to the historical background of the region and a less pronounced geographic isolation compared to other countries of northern Africa. 8. The genetic variation of both the X chromosome and, for the most part, the autosomal markers showed that the Berbers from the Maghreb (Asni and Khenifra) are significantly more differentiated among all North African populations. 9. The population distribution of the variation in the F7 gene promoter region shows no traits of positive selection in the Mediterranean region. On the contrary, there is strong evidence of positive selection in the indigenous population of Bolivia. 10. The lack of association between polymorphism FXII 46C> T and ischemic heart disease in the case-control study of Tunisia suggests that this polymorphism is not a universal risk factor for ischemic heart disease. / En esta tesis se ha analizado la variación que presentan (i) los polimorfismos Alu del cromosoma X y (ii) unos SNPs y microsatélites dentro y en torno a las regiones genómicas de los genes que codifican para los factores de coagulación VII y XII (F7 y F12 respectivamente) en distintas poblaciones humanas procedentes mayoritariamente del mediterráneo además de otras regiones geográficas. Los polimorfismos Alu son muy útiles para los estudios antropológicos que investigan el origen y las relaciones genéticas entre diversas poblaciones humanas. Asimismo, en los genes F7 y F12 se sitúan unas mutaciones que determinan los niveles plasmáticos de los factores de coagulación VII y XII y el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, teniendo su distribución poblacional un alto interés epidemiológico. Las principales conclusiones de la tesis son las siguientes: 1. La diferenciación genética entre poblaciones del norte de África y sur de Europa es baja pero significativa. 2. Para del mismo rango de distancias geográficas en el mediterráneo, las distancias genéticas entre poblaciones procedentes de costas opuestas son más largas que entre poblaciones de la misma costa, indicando que el mar mediterráneo puede haber actuado como una barrera al flujo génico entre el norte de África y sur Europa. 3. El análisis de haplotipos de las regiones F7 y F12 ha proporcionado evidencias de un flujo génico subsahariano más elevado hacia el norte de África que el sur de Europa. Esta observación podría ser el resultado de la existencia de una barrera genética en el Mediterráneo. 4. Como han mostrado los análisis de componentes principales, la diferenciación genética interpoblacional en la parte europea del mediterráneo es menos pronunciada que en la parte Africana. 5. A diferencia de estudios anteriores, la variación genética estudiada en este trabajo mostró que los vascos no presentaron ninguna posición genética especial con respecto a otras poblaciones del sur de Europa. 6. Según los polimorfismos Alu del cromosoma X, los bereberes egipcios del Oasis de Siwa aparecen como la población más diferenciada dentro del norte de África y con una fuerte influencia subsahariana. 7. Todos los datos afirman que, de todas las poblaciones del norte de África, la población de Monastir en Túnez es la más cercana genéticamente a Europa, posiblemente debido a los antecedentes históricos de la región y a un aislamiento geográfico menos pronunciado en comparación con otros países del norte de África. 8. La variación genética del cromosoma X, pero sobretodo de los marcadores autosómicos, mostró que los bereberes procedentes del Magreb (Asni y Khenifra) son notablemente los más diferenciados en el conjunto de las poblaciones norteafricanas examinadas. 9. La distribución poblacional de la variación en la región promotora del gen F7 no presenta rasgos de selección positiva en la región mediterránea. En cambio, hay evidencias sólidas de una la selección positiva en la población indígena de Bolivia. 10. La falta de asociación entre el polimorfismo FXII 46C>T y la cardiopatía isquémica en el estudio caso-control de Túnez sugiere que dicho polimorfismo no es un factor de riesgo universal de la cardiopatía isquémica.

Two pieces of complementary research dealing with the study of the importance of genetic factors on the quality of the Spanish dry-cured ham Jamón Serrano were carried out for this thesis. The first one compared Serrano dry-cured hams made from typical commercial lines of four representative breeds (Duroc, Landrace, Large White and Piétrain) subjected to the current standard industrial process. Most of the differences in raw material, final composition and rheology were between Piétrain and the other three breeds. Duroc breed showed the most important differences in instrumental colour and appearance, probably caused by its higher intramuscular fat content. The differences between the four breeds in dry-cured ham sensory quality were too small to discriminate them on single traits. However, according to multivariate analyses (PCA), the Large White showed the most appropriate sensory characteristics for dry-cured ham production of the four pure breeds under the processing conditions used, while the Piétrain showed the least appropriate ones. The second piece of research studied the effect of the previously identified PRKAG3 and CAST genetic polymorphisms (PRKAG3 Ile199Val, CAST Arg249Lys and CAST Ser638Arg) on the quality traits of the Spanish dry-cured ham Jamón Serrano. Associations between the polymorphisms and traits of flavour and texture were found. The PRKAG3 Ile/Ile genotype, the CAST249 Arg/Arg genotype, the CAST638 Arg/Arg genotype and the haplotype CAST 249Arg-638Arg are the most favourable for the production of the Spanish dry-cured ham Jamón Serrano. It can be concluded that the effect of different pure breeds was not strong enough to produce significant perceivable differences between dry-cured hams. In contrast, differences between genotypes of PRKAG3 and CAST polymorphisms on proteolysis and sensory traits indicated that polymorphisms could induce perceivable differences in the sensory quality of dry-cured hams. Accordingly, genetic polymorphisms could be better indicators of material screening in the dry-cured ham industry than breeds. / En aquesta tesi s’han realitzat dos estudis complementaris sobre la importància dels factors genètics sobre la qualitat del pernil curat Jamón Serrano. El primer compara pernils curats elaborats a partir de línies genètiques comerciales de quatre races representatives (Duroc, Landrace, Large White y Piétrain) i sotmesos a un procés industrial estàndard i actual Les majors diferències en els pernils frescos i en la composició i reologia final es van observar entre Piétrain i les altres tres races. La raça Duroc va presentar les principals diferències en color instrumental i aparença sensorial, probablement degut al seu alt contingut de greix intramuscular. Les diferències en característiques sensorials entre les quatre races van ser massa petites per a poder discriminar entre elles en base a característiques individuals. No obstant, considerant les anàlisis multivariades (PCA), la raça Large White va mostrar les característiques sensorials més apropiades per al pernil curat en les condicions de elaboració aquí utilitzades, mentres que la raça Piétrain va mostrar les menys apropiades. El segon estudi analitza l’efecte dels polimorfismes genètics PRKAG3 i CAST, prèviament identificats (PRKAG3 Ile199Val, CAST Arg249Lys i CAST Ser638Arg), sobre les característiques de qualitat del pernil curat espanyol Jamón Serrano. Hi va haver associacions significatives dels genotips PRKAG3, CAST249 i CAST638 i del haplotip CAST amb varis caràcters relacionats amb flavor i textura. Els genotips PRKAG3 Ile/Ile, CAST249 Arg/Arg, CAST638 Arg/Arg i l’haplotip CAST 249Arg-638Arg són els més favorables per a l’elaboració del pernil curat Jamón Serrano. Es pot concloure que l’efecte de la raça no va ser prou fort per a provocar diferències perceptibles entre els pernils curats. Per contra, les diferències entre genotips dels polimorfismes PRKAG3 i CAST poden induir diferències perceptibles en la qualitat sensorial dels pernils curats. En conseqüència, els polimorfismes genètics podrien ser millors indicadors per a la selecció de la matèria prima a les indústries elaboradores de pernil curat que les races.