La resistència als antimicrobians és un procés natural, que com a conseqüència del seu ús ha afavorit la selecció de mutants, l'adquisició de gens de resistència i el sobrecreixement de bacteris intrínsecament resistents als antimicrobians.Els β-lactàmics són una de les famílies més emprades en la pràctica clínica, essent el mecanisme enzimàtic el mecanisme de resistència més important. En enterobacteris els enzims que prenen més importància són les β-lactamases d'espectre ampliat (BLEA) i les cefamicinases (pAMPCt).L'objectiu d'aquest treball fou determinar la prevalença d'aquests enzims en els enterobacteris aïllats a L'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau en el període comprés entre 1994 i 2004. Els estudis de sensibilitat en Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae mostren un clar increment de la resistència a cefalosporines de tercera generació (C3G) i aztreonam, fruit d'una major prevalença de soques portadores de BLEA i pAMPCt. La prevalença de soques productores de BLEA en el decenni 1994-2004 ha estat del 1,1% i del 1,6%, respectivament. Les BLEA més freqüents en E. coli han estat les del grup CTX-M (77,5%), essent l'enzim CTX-M-9 el més descrit (43%) mentre que en K. pneumoniae tant les BLEA del grup CTX-M com les SHV han tingut una prevalença similar (50%). K. pneumoniae portador de BLEA ha estat, i encara és, majoritàriament, un patogen nosocomial. En ambdues espècies, les pAMPCt han presentat, respectivament, una prevalença del 0,16%.i del 0,22% amb una clara presència de soques portadores de CMY-2. Els estudis de sensibilitat mostren que en les espècies amb una β-lactamasa cromosòmica induïble tipus AmpC (Enterobacter, Citrobacter freundii i Morganella morganii) no hi ha hagut un increment de la resistència a C3G, indicatiu d'una possible desrepressió de l'enzim, essent el percentatge de soques amb fenotip de desrepressió del voltant del 30% en Enterobacter i C. freundii i del 7,5% en M. morganii.En Klebsiella oxytoca el principal mecanisme implicat és la hiperproducció de llur β-lactamasa cromosòmica que confereix resistència a l'aztreonam. La prevalença d'aquest mecanisme ha incrementat d'un 4% a un 44%. Per altra banda, s'han trobat dues soques productores de BLEA (CTX-M-9 i CTX-M-32).En Proteus mirabilis, s'ha pogut observat al llarg dels deu anys un lleuger increment de la resistència a l'associació amoxicil·lina-àcid clavulànic i de manera puntual l'aparició de soques productores de pAmpCt (tres soques amb CMY-2) o de BLEA (una soca amb CTX-M-1).En Salmonella enterica cal destacar l'aïllament de tres soques productores de BLEA (dues CTX-M-9 i una CTX-M-14) i una soca productora de CMY-2.La resistència a carbapenems ha estat pràcticament nul·la en totes les espècies estudiades. Malauradament, la resistència als β-lactàmics va associada a la resistència a d'altres famílies d'antimicrobians. Les soques productores de BLEA presentaven uns percentatges de resistència a fluoroquinolones, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloramfenicol i aminoglicòsids, del 84%, 56%, 52%, 35% i 14%, respectivament mentre que les soques productores de cefamicinasa presentaven uns percentatges de resistència a cloramfenicol, fluoroquinolones, aminoglicòsids, trimetoprim-sulfametoxazol i tetraciclina del 85%, 77%, 67%, 57%, i, 56%, respectivament. De l'estudi de les resistències associades dels antibiòtics no β-lactàmics a la producció de BLEA o pAmpCt no s'ha obtingut un patró predominant associat a cada tipus de β-lactamasa. / Antimicrobial resistance is a natural process but the abuse and misuse of antimicrobial agents has favored the selection of mutants, the acquisition of resistance and the overgrowth of bacteria intrinsically resistant to these drugs. β-lactams (as cephalosporins) are one of the most widely used agents in clinical practice and their main mechanism of resistance by the bacteria is the production of enzymes known as β-lactamases. In Enterobacteriaceae, the Extended-Spectrum-β-lactamases (ESBLs) and plasmid-mediated AmpC enzymes (pAmpCt) are the most relevant of these enzymes.The aim of this study was to determine the prevalence and diversity of Extended-Spectrum-β-lactamases (ESBLs) and plasmid-mediated AmpC enzymes (pAmpCt) isolated from Enterobacteriaceae at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau between 1994 and 2004.Results of the susceptibility studies in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae showed a clear increase in third generation cephalosporins (C3G) and aztreonam resistance due to a major prevalence of ESBLs- and pAmpCt-producing strains. The prevalence of ESBL-producing strains from 1994 to 2004 was between 1.11% and 1.6%. In E. coli, the ESBL CTX-M-type was the most frequent (77.5%) due to CTX-M-9-producing strains (43%). In K. pneumoniae, the CTX-M-type as well as the SHV-type had the same prevalence (50%). The prevalence of pAmpC-t in both species increased from 0.16% to 0.22%, with a clear presence of the CMY-2 enzyme. We did not observe an increase in C3G resistance in the chromosomally-depressed AmpC beta-lactamase-producing strains such as Enterobacter, Citrobacter freundii or Morganella morganii. Prevalence was about 30% in Enterobacter and C. freundii and 7.5% in M. morganii.In Klebsiella oxytoca, the main mechanism involved in β-lactam resistance was the depression of its chromosomal β-lactamase, observable because the strains become resistant to aztreonam. The prevalence of this mechanism increased from 4 to 44%. We also found two ESBL-producing strains (CTX-M-9 and CTX-M-32).In Proteus mirabilis, we isolated one ESBL-producing strain (CTX-M-1), and observed a slight increase in coamoxiclav resistance due to three CMY-2 producing strains. In Salmonella enterica three ESBL- producing strains (two CTX-M-9 and one CTX-M-14) and one CMY-2-producing strain were found.β-lactam resistance was associated with other antimicrobial drug resistance. ESBL-producing strains showed rates of resistance to fluoroquinolones, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol and aminoglycosides of 84%, 56%, 52%, 35% and 14%, respectively. pAmpCt-producing strains showed rates of resistance to chloramphenicol, fluoroquinolones, aminoglycosides, tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole of 85%, 77%, 67%, 57% and 56%, respectively. No predominant pattern was associated to β-lactams resistance in ESBL or pAmpCt-producing strains.

La estructura molecular de diversos componentes celulares contiene, entre otros elementos, nitrógeno. La fuente de nitrógeno preferida por las bacterias y la mayoría de microorganismos es el amonio, el cual no siempre se encuentra disponible en el medio. Por ello, las bacterias han desarrollado mecanismos moleculares que les permiten obtener nitrógeno de fuentes alternativas como pueden ser las purinas. Este trabajo se centra en el metabolismo de las purinas como fuentes de nitrógeno en la enterobacteria Klebsiella pneumoniae. En este trabajo hemos identificado y caracterizado el sistema génico de K. Pneumoniae implicado en la asimilación de hipoxantina como fuente de nitrógeno, al cual hemos denominado hpx. El sistema hpx está formado por cuatro unidades transcripcionales. Las unidades hpxDE, hpxR y hpxO se transcriben a partir de promotores dependientes de la subunidad (sigma-70) 70 de la RNA polimerasa, mientras que 9hpxPQT presenta un promotor dependiente de (sigma-54) 54. El operón hpxDE está implicado en la oxidación de hipoxantina a ácido úrico. Sin embargo, los productos de los genes hpxD y hpxE no se asemejan a las xantina deshidrogenasas descritas hasta el presente. En base a la similitud de HpxD y HpxE con distintos componentes de la familia de las dioxigenasas, proponemos que el operón hpxDEcodifica una dioxigenasa formada por una oxidorreductasa (HpxE) y una oxigenasa (HpxD). El producto génico del gen hpxO está implicado en la oxidación de ácido úrico a alantoína. Sin embargo, dicha proteína no presenta similitud a uricasas sino a monooxigenasas de compuestos aromáticos dependientes de FAD. Proponemos que HpxO es una FAD-monooxigenasa que catalizaría la oxidación de ácido úrico al intermediario 5-hidroxiisourato, el cual sería transformado a alantoína por la acción secuencial de las proteínas HpxT y HpxQ. El gen hpxP codifica un transportador de purinas cuyo sustrato muy probablemente es ácido úrico. El gen hpxR codifica una proteína de la familia de reguladores LysR que actúa como represor de su propia transcripción y como activador del operón hpxDE El sistema hpx está sometido a una doble regulación, la llevada a cabo por el sistema global del nitrógeno y la llevada a cabo por la regulación específica de la vía. Mientras que el gen hpxR se expresa de manera constitutiva y el gen hpxO no está fuertemente regulado, los operones hpxDE y hpxPQT son inducidos tanto por limitación de nitrógeno como por la presencia de los inductores hipoxantina (hpxDE) o ácido úrico (hpxPQT). La regulación por nitrógeno del operón hpxPQT tiene lugar a través del sistema NTR de K. Pneumoniae, el cual se activa en condiciones de nitrógeno limitantes. El promotor PhpxP depende de la subunidad (sigma-54) 54 de la RNA polimerasa y es reconocido por el activador NtrC (NiTrogen Regulatory protein C). El regulador que reconoce el ácido úrico como molécula inductora todavía no ha sido identificado. Es de destacar que la regulación por nitrógeno del operón hpxDE no tiene lugar a través del sistema NTR. Resultados preliminares sugieren la existencia de un regulador no caracterizado hasta el presente al que proponemos denominar NR (Nitrogen Repressor). Este regulador reprimiría la expresión del operón hpxDE en condiciones de exceso de nitrógeno. Esta es la primera vez que se describe en K. Pneumoniae un sistema de regulación por nitrógeno distinto de NTR, hecho que evidencia la importancia del estudio del sistema génico hpx en esta enterobacteria. La regulación específica está llevada a cabo por el regulador HpxR, el cual reconoce a la hipoxantina como molécula inductora del operón hpxDE. / Gene organization and regulation of the genetic system hpx involved in utilization of hypoxanthine as nitrogen source in Klebsiella pneumoniae"Purines play a key role in nucleic acid and nucleotide metabolism of all cells. In addition, they can be used as nitrogen sources by many microorganisms when ammonium, the preferred nitrogen source, is limiting. Purine catabolism in enterobacteria has been poorly characterized at the genetic level. In this study we identify and characterize the gene cluster (named hpx)responsible for the oxidation of hypoxanthine to allantoin in K. pneumoniae. This genetic system is essential fot the aerobic assimilation of hypoxanthine as nitrogen source under nitrogen limiting conditions.This system is composed by four transcriptional units: hpxDE, hpxR, hpxO and hpxPQT. hpxP gene encodes a purine transporter. The hpxDE operon encodes subunits of the enzyme that catalyzes the oxidation of hypoxanthine to uric acid. The structure of this enzyme is more related to class IB dioxygenases than to xanthine dehydrogenases. Genes hpxO, hpxQ and hpxT are involved in the oxidation of uric acid to allantoin. The hpxO gene product seems to be more related to FAD containing monooxygenases than to uricases. Finally, hpxR encodes a LysR-type regulator that activates hpxDE expression and represses its own gene.Metabolism of hypoxanthine as nitrogen source is regulated by nitrogen conditions and by purines. hpxDE and hpxPQT operons are the units regulated at both levels. Transcription of hpxPQT operon is induced under nitrogen starvation and by uric acid through a regulatory protein other than HpxR. Nitrogen control of this unit is mediated by the NTR system.Expression of hpxDE operon is induced under nitrogen limiting conditions, independently fromthe NTR system, and by hypoxanthine through HpxR.