El cobalt Procedent de kobold, goblin o esperit maligne, com era anomenat antigament. El seu descobriment s'atribueix el 1735 al químic suec Georg Brandt (1694-1768). Químicament, el cobalt, de configuració electrònica [Ar] 4s2 3d7, es troba en els estats d'oxidació +1 (d8), +2 (d7) i +3 (d6), sent el més estable el Co(II). D'altra banda, aquests cations existeixen en diferents estats d'espín i electrònics, fruit de la diferent ocupació dels orbitals 3d i del 4s (ocupació fonamental en la interacció Colligand). Així, el catió Co(I) es pot trobar en els estats 3F, 1G (procedents d'una ocupació 3d8) i 5F (procedent d'una ocupació 4s1 3d7). Anàlogament, per al Co(II) es poden trobar els estats 4F i 2G (derivats de la configuració 3d7).La glicina Glicina, Gly o G. Un dels aminoàcids que formen les proteïnes, de fórmula NH2CH2COOH, on la cadena lateral correspon a un àtom d'H. Per aquest motiu, és el més senzill i l'únic no quiral. La lisina Lisina, L-lisina, Lys, K. De fórmula NH2CH[(CH2)4NH2]COOH, és un dels aminoàcids bàsics, degut al NH2 terminal de la cadena lateral (-(CH2)4NH2). Forma part del grup d'aminoàcids essencials, no podent ser sintetitzat pels humans. La basicitat de la seua cadena lateral el fa susceptible d'interaccionar amb els cations metàl·lics. Homopèptids També anomenats oligopèptids, polipèptids. Cadenes formades per la unió d'aminoàcids del mateix tipus, NH2CHR(CONHCHR)nCOOH (n=1- ...; R = cadena lateral). Cada polímer conté n+1 residus del mateix aminoàcid i n enllaços peptídics. La presència (lisina) o absència de cadena lateral (glicina) determina la interacció dels cations metàl·lics amb aquests lligands. El DFT Acrònim per a Teoria del Funcional de la Densitat. Formulació alternativa de la mecànica quàntica que permet obtindre informació sobre l'energia i l'estructura de sistemes amb múltiples partícules a partir de la densitat electrònica d'aquests. Densitat calculada mitjançant eines computacionals. L'espectrometria de masses Eina d'anàlisi consolidada en diversos camps, com la proteòmica, on s'empra en la seqüenciació de pèptids. L'objectiu: buscar patrons de fragmentació d'un pèptid per determinar-ne la seqüència d'aminoàcids, fragmentacions que s'aconsegueixen mitjançant tècniques d'ionització. Aquests blocs anteriors conflueixen en el treball d'aquesta memòria. Així, s'ha realitzat un estudi de la interacció dels cations Co(I) i Co(II), en diferents estats d'espín, amb els aminoàcids glicina i lisina i amb homopèptids derivats d'ells, emprant eines computacionals i d'espectrometria de masses. / Cobalt From kobold, goblin, the way it was called in ancient times. Its discovery, in 1735, is attributed to the Swedish chemist Georg Brandt (1694-1768). Chemically, Cobalt has an electronic configuration [Ar] 4s2 3d7 and it can be found in the following oxidation states: +1 (d8), +2 (d7) and +3 (d6), being the Co(II) the most stable. On the other hand, these cations can exist in different spin and electronic states, arising from a different occupation of the 3d and 4s orbitals (such occupation is crucial in the Co-ligand interaction). Thus, Co(I) can be found in the 3F, 1G (both arising from a 3d8 occupation) and 5F (coming from a 4s1 3d7 occupation) states. In the same way, for Co(II) we can find the 4F and 2G states, arising from a 3d7 occupation. Glycine Glycine, Gly or G. One of the amino acids found in proteins, which has the formula NH2CH2COOH, where the side chain is an H atom. For this reason, it is the simplest amino acid and the only that is not chiral. Lysine Lysine, L-lysine, Lys, K. Having a formula NH2CH[(CH2)4NH2]COOH, it is one of the basic amino acids, due to the terminal NH2 group of the side chain (-(CH2)4NH2). It is one of the essential amino acids, for what it cannot be synthesized by humans. Its side chain basicity makes it capable of interacting with metal cations. Homopeptides Also known as oligopeptides and polypeptides. Polymeric chains formed by the union of amino acids of the same type, NH2CHR(CONHCHR)nCOOH (n=1- ...; R = side chain). Each polymer contains n+1 residues of the same amino acid and n peptide bonds. The presence (lysine) or absence (glycine) of the side chain determines the interaction of metal cations with these ligands. DFT Acronym that stands for Density Functional Theory. Alternative formulation of the quantum mechanics that allows obtaining information about the energy and the structure of many body systems, from their electronic density. Density calculated by means of computational techniques.Mass spectrometry Analysis tool consolidated in different areas, such as proteomics, where it is used in peptide sequencing. The goal: to look for peptide's fragmentation patterns in order to determine the amino acid sequence. These fragmentations are achieved by means of ionization techniques. These blocks converge in the work presented in this manuscript. Thus, a study about the interaction of Co(I) and Co(II) cations, in different spin states, with the amino acids glycine and lysine and with their homopeptides, has been made, using both computational and mass spectrometry techniques.

No description available.

En este trabajo se han realizado estudios sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, intentando correlacionar las alteraciones observadas en la captación hepática de aminoácidos "in vivo" con cambios estables en las propiedades cinéticas de los sistemas de transporte estudiadas "in vitro". Se han estudiado tres situaciones experimentales diferentes: ayuno, gestación y lactancia. Posteriormente se han realizado estudios sobre el posible efecto a corto plazo de diversas hormonas (Glucagón, Insulina y Factor de Crecimiento Epidermal "EGF") sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata.En los resultados expuestos en esta memoria sobre la modulación "in vivo" e "in vitro" de la captación de L-alanina por vesículas de membrana plasmática de hígado de rata, se han observado los siguientes puntos:1. - En la rata, la privación de alimento produce un aumento de la afinidad (Km) y un descenso de la capacidad (Vmax) de los sistemas de transporte de L-alanina. Estos cambios en los parámetros cinéticos están altamente correlacionados con un descenso gradual en la asequibilidad portal de alanina.2. - Durante el ayuno, se producen cambios importantes en la inhibición de la función transportadora por otros aminoácidos naturales. La estrategia utilizada para discernir entre la proporción relativa de los sistemas de transporte en la captación de L-alanina, mediante pruebas con MeAIB y Litio, revelan que estos cambios no parecen ser atribuibles a una modificación en la participación de los sistemas A y ASC en el transporte total de alanina.3. - La fuerte correlación existente entre los cambios de Km y las K(1/2) del efecto inhibidor sobre el transporte de agentes modificadores de grupos -SH, como el NEM o el PCMBS, revelan cambios conformacionales en la(s) molécula(s) transportadora(s). Esta posibilidad es compatible con la presencia de grupos -SH en el centro activo de la proteína o, alternativamente, en dominios muy directamente implicados con la función transportadora.4. - En la gestación y la lactancia, situaciones fisiológicas caracterizadas por un aumento en la captación hepática de aminoácidos "in vivo", se comprueba que los índices de captación de L-a1anina calculados a partir de las medidas de transporte en preparaciones de vesículas de membrana plasmática de hígado, están incrementados en el rango de concentraciones fisiológicas de substrato. No obstante, las adaptaciones realizadas mediante cambios en los parámetros cinéticos en ambas situaciones fisiológicas son diferentes; mientras que en la gestación se detecta un incremento de Vmax, durante la lactancia se observa un descenso de Km, que creemos atribuible a un cambio en la participación relativa de los sistemas A y ASC en el transporte total de este aminoácido a nivel hepático. 5. - El glucagón y el factor de crecimiento epidermal (EGF) ejercen acciones inhibidoras, a muy corto plazo, sobre el transporte de aminoácidos en vesículas de membrana plasmática de hígado de rata. Su acción parece ser específica sobre aquellos transportadores que utilizan al ión sodio como co-substrato del aminoácido, puesto que no se detecta ningún efecto al estudiarse el transporte de L-leucina. El efecto inhibidor de estos péptidos parece realizarse acelerando la disipación del gradiente de sodio a través del "antiporter" Na(+)-H(+), ya que dicho efecto se revierte al ser estudiado en presencia de HMA, un derivado de la amilorida que actúa como inhibidor específico del "antiporter".6. - Dado que en las preparaciones vesiculares utilizadas no existe actividad Na-K ATPasa funcional, podemos concluir que los efectos hormonales observados en nuestras vesículas de membrana plasmática son compatibles con la hipótesis que sugiere que los efectos estimuladores de glucagón y EGF sobre el transporte dependiente de sodio de aminoácidos a nivel hepático, se realizarían mediante la hiperpolarización de la membrana.Debido a los anteriores resultados los factores que determinarían las tasas de captación hepática de aminoácidos "in vivo" serían producto de, al menos, las siguientes adaptaciones: En primer lugar, cambios en los parámetros cinéticos de sistemas transportadores. Estos cambios pueden implicar tanto modificaciones de capacidad total (Vmax) como de afinidad (Km). En este último caso, parece que esta adaptación pueda llevarse a cabo, tanto modificándose la proporción relativa de transporte de los sistemas implicados en la captación de L-alanina, como induciéndose, de forma todavía no conocida, la presencia de formas moleculares que, si bien obedecen a las características bioquímicas descritas para sistemas ya conocidos, actúan con una afinidad distinta hacia el substrato.Por otra parte, en los casos en que se detectan cambios de afinidad hacia el substrato, es esperable y así se comprueba que existan modificaciones en la eficacia inhibidora del transporte dependiente de sodio de L-alanina por parte de otros aminoácidos naturales. Si a este hecho le añadimos la evidencia de que en cada situación fisiológica el patrón de concentraciones de aminoácidos en la vena porta varía, es fácil imaginar que ambos factores, cambio de concentración y de eficacia inhibidora, jugarán un papel importante a la hora de determinar la captación neta "in vivo".Finalmente el contexto hormonal existente en la vena porta juega un papel decisivo en la modulación de la captación neta de aminoácidos "in vivo". Obviamente, este factor no está presente en las preparaciones vesiculares y debe considerarse a la hora de determinar hasta que punto los cambios observados, en los balances hepáticos de aminoácidos "in vivo", pueden ser explicados por modificaciones estables de la cinética de los sistemas responsables de su transporte. / It has been studied the alanine transport in plasma membrane vesicles from rat livers. The studies have been focused on to correlate the changes in hepatic amino acid metabolism "in vivo" with the changes in kinetic values "in vitro". It has been chosen three experimental models: food deprivation, pregnancy and 1actation. Starvation induced a decrease in Km (2.32, 1.60, 1.10 mM) and Vmax (1.86, 1.69, 1.10 pmol Ala/l0s per microgr. protein) for control, fasted 24h and 48h respectively. The Km va1ues have a good relation with the decrease in hepatic availability and with a decrease in the K(l/2) values from sensitivity to sulfhydryl specific reagents such as NEM and PCMBS. Studies with Li and MeAIB show that the proportion of A and ASC systems not change during starvation. This results suggest that it can exist changes in conformational status of transport proteins. In the studies with late pregnant rats, it has been found a light increase in Vmax values (1.7 vs 2.0 pmol Ala/l0s per microg. protein) without changes in Km (2.3 vs 1.8 mM) for virgin and pregnant rats respective1y. The alanine utilization rates, as calculated from plasma membrane enzyme marker recoveries, were enhanced in the physiological range of alanine concentration in blood.Kinetic parameters of alanine transport were measured in plasma membrane vesicles from livers of 15 days lactating rats. Lactation induced 10w Vmax and Km va1ues of the sodium dependent alanine component of transport (1.8 vs 1.3 pmol A1a/10s per microgr. protein and 2.3 vs 1.2 mM, respectively). At the same way than late pregnant rats the alanine utilization rates were enhanced. The decrease of Km values seen to be atributable to a greater contribution of system A to the total Na+-dependent alanine transport as deduced from less tolerance to lithium substitution instead Na, a greater inhibition of alanine transport by saturating amounts of MeAIB y proline, and higher sensitivity to NEM and PCMBS. Finally, it has been studied the hormonal short-term effects of glucagon and EGF on sodium dependent alanine transport in plasma membrane vesicles from rat liver. The resu1ts suggest that the hormone action on Na+ dependent amino acid transport is modifying the sodium electrochemical flux through the Na+-H+ antiporter. This hipothesis is based from studies on selective inhibition of antiporter activity.

Dins el camp de les reaccions de cicloaddició, s'ha estudiat a nivell experimental i teòric, mitjançant càlculs amb funcionals de la densitat, l'addició de diazometà i de diazocompostos fosforilats a diferents substrats olefínics quirals pobres en electrons, derivats de D-gliceraldehid, així com la fotòlisi de la pirazolina formada per a l'obtenció del compost ciclopropànic. Alguns dels compostos ciclopropànics obtinguts s'han utilitzat per la síntesi de derivats d'interès. També s'ha estudiat a nivell teòric, la diastereoselectivitat facial i l'estereoespecificitat de l'addició de N-alquilhidroxilamines a acrilat de metil i a èsters a,b-insaturats derivats de D-gliceraldehid.S'ha observat que la diastereoselectivitat p-facial de la cicloaddició 1,3-dipolar de diazometà a diferents substrats olefínics derivats de D-gliceraldehid és preferentment sin, i independent de la isomeria Z/E, la di- o tri-substitució o la naturalesa dels substituents electroatraients del doble enllaç. Segons els càlculs teòrics, l'origen de la diastereoselectivitat facial d'aquestes cicloaddicions, es troba principalment en la quiralitat del centre estereogènic del substrat. Els efectes estèrics constitueixen un factor rellevant en la determinació de l'estereoquímica dels adductes resultants.La reactivitat de bis[(diisopropilamino)fosfino]diazometà 71 envers els èsters a,b-insaturats (S)-(Z) i (E)-3-(2',2'-dimetil-1',3'-dioxolan-4-il)-2-propenoat de metil (3-Z i 3-E), és inferior a la del diazometà respecte el mateix dipolaròfil. D'altra banda, l'isòmer E és menys reactiu que el Z amb el diazocompost fosforilat 71, mentre que la reactivitat de tots dos isòmers amb diazometà és comparable. La diastereoselectivitat p-facial de la cicloaddició de 71 a l'èster 3 depèn de l'esteoquímica Z/E del doble enllaç. Per l'isòmer Z s'obté l'adducte sin amb un 94% e.d., mentre que per l'isòmer E la diastereoselectivitat p-facial és nul·la. D'altra banda, els càlculs teòrics prediuen que la cicloaddició del fosfinodiazometà 71 a l'olefina 3-E ha de ser menys diastereoselectiva que l'addició a l'isòmer Z.A nivell experimental s'observa una total estereoespecificitat de la fotòlisi de les D1-pirazolines. El mecanisme postulat a partir dels càlculs teòrics passa per una espècie intermèdia diradicalària que gaudeix de lliure rotació. L'origen de l'estereoespecificitat observada a nivell experimental, segons els càlculs teòrics, es troba en el fet que la rotació del diradical intermedi és més lenta que el col·lapse d'aquest diradical per donar l'anell de ciclopropà.La reacció d'addició de N-alquilihidroxilamines als èsters a,b-insaturats mitjançant un mecanisme concertat a través d'un estat de transició cíclic, és més favorable que un mecanisme per etapes, segons els càlculs teòrics, cosa que explicaria la gran estereoespecificitat observada a nivell experimental en aquest tipus de reaccions. Pel que fa a la diastereoselectivitat facial, els adductes sin són els majoritaris en els casos considerats, tant des d'un punt de vista teòric com experimental.Com a culminació dels estudis previs realitzats en aquesta tesi doctoral, que han permès exercir el control de la diastereoselectivitat en les reaccions de ciclopropanació, s'ha assolit la síntesi altament estereoselectiva de nous b-aminoàcids i nucleòsids ciclopropànics enantiopurs, compostos de gran interès des d'un punt de vista biològic. / Regarding cycloaddition reactions, we have done experimental studies and DFT theoretical calculations, to study the stereochemical outcome of the cycloaddition reaction of diazomethane and other phosphorilated diazoalcanes to chiral electron-deficient olefins prepared from D-glyceraldehyde acetonide, as well as the photochemical decomposition of the corresponding pyrazolines that leads to the cyclopropane compounds. Some of these cyclopropane derivatives have been used to synthesize interesting structures. We have also studied the p-facial diastereoselection and the stereospecificity of N-alkylhydroxylamines addition reaction to a,b-unsaturated esters derived from D-glyceraldehyde.A total syn diastereoselection has been observed for the 1,3-dipolar cycloaddition of diazomethane to different olefinic substrates derived from D-glyceraldehyde, independently of the Z/E stereochemistry of the substrate, the di- or tri-substitution or the nature of the conjugated functional groups of the double bond. Theoretical calculations show us that the origin of the p-facial diastereoselection in these cycloadditions is found in the chirality of the dixolane stereogenic center, as the most relevant feature determining the stereochemistry of the resulting adducts.Bis[(diisopropilamine)fosfine]diazomethane 71 is less reactive than diazomethane with a,b-unsaturated esters (S)-(Z) and (E)-3-(2',2'-dimethyl-1',3'-dioxolane-4-yl)-2-methyl propenoate (3-Z and 3-E). On the other hand, the E isomer is less reactive than the Z one with the phosphorilated diazocompound 71, while the reactivity of both isomers with diazomethane is comparable. Therefore, p-facial diastereoselectivity of the cycloaddition reaction of 71 to ester 3 is dependent on the Z/E stereochemistry of the double bond. Considering isomer Z, one obtains the sin cycloadduct with 94% d.e., while with the E isomer the diastereoselectivity is almost null. On the other hand, theoretical calculations predict less diastereoselectivity for the cycloaddition reaction of phosphinodiazomethane 71 to 3-E isomer, than for the Z one.In an experimental level, a total stereospecificity is observed for the photochemical decomposition of D1-pirazolines. Regarding theoretical calculations, a mechanism for this reaction has been postulated, which involves a diradical intermediate with free rotation. The origin of the experimentally observed stereospecificity is found in the fact that the rotation of the C2-C3 bond in the transient diradical is slower than the collapse of this biradical to yield the ciclopropane ring.Theoretical calculations indicate that the addition reaction of N-alkylhydroxylamines to a,b-unsaturated esters by means of a concerted mechanism through a cyclic transition state, is more favorable than a two-step process, and these results are in good agreement with the experimentally observed high stereospecificity. Regarding the p-facial diastereoselectivity, sin adducts are the major ones in all considered cases, experimentally and theoretically.As a culmination of the exposed studies in the present doctoral thesis, which allowed us to exert a total p-facial diastereoselection control of the cyclopropanation reactions, we have achieved the highly stereoselective synthesis of biologically interesting compounds such as new enantiopure b-amino acids and nucleosides.

Els transportadors del sistema L faciliten el moviment d'aminoàcids grans i neutres a través de les membranes cel·lulars. Fins el moment es coneixien 3 proteïnes capaces d'induir aquesta activitat de transport: LAT1, LAT2 i LAT3. En aquets treball s'ha identificat LAT4, un nou transportador d'aminoàcids de la família SLC43 que guarda un 57% i un 30% d'identitat amb LAT3 i EEG1, els altres dos membres de la família. La proteïna es glicosila i arriba a la membrana plasmàtica de les cèl·lules HeLa i dels oòcits de Xenopus laevis quan es sobreexpressa. El RNA missatger de LAT4 s'expressa majoritàriament a placenta, intestí i ronyó. Més concretament, mitjançant hibridació in situ, hem detectat el missatger de LAT4 a cèl·lules dels túbuls distals i dels conductes col·lectors del ronyó, i a les cèl·lules de la cripta i la base de l'enteròcit a l'intestí prim. L'expressió de LAT4 en oòcits de Xenopus laevis indueix una activitat de transport d'aminoàcids neutres i grans; sodi, clorur i pH independent i que s'inhibeix per l'anàleg d'aminoàcids no metabolitzable BCH. Aquestes propietats concorden amb el subsistema prèviament descrit L2 i afegeixen un quart transportador responsable de l'activitat del sistema L. L'activitat de transport induïda, no és transestimulable, i possiblement es tracti d'un mecanisme de difusió facilitada. El transport induït per LAT4 mostra una cinètica de dos components, on les constants d'afinitat són de 4,7+/-0,5 mM i 178+/-29 mil.limicres pel component de baixa i alta afinitat, respectivament. L'agent alquilant de grups sulfidrils, N-etilmaleïmida (NEM) inhibeix parcialment l'activitat de transport induïda per LAT4 i efecte específicament el component de baixa afinitat. A més a més, hem identificat el mutant LAT4 S297A insensible al pretractament amb NEM. Al model cel·lular de ronyó PCT, es detecta una activitat de transport de baixa afinitat a la cara basolateral compatible amb la descrita per LAT4.EEG1, el tercer membre de la família SLC43, es glicosila i expressat en sistemes heteròlegs arriba a la membrana plasmàtica de la cèl·lula, però no indueix activitat de transport pels aminoàcids assajats. El RNA missatger de EEG1 es detecta majoritàriament a cor, fetge, i en menor grau a ronyó, pulmó i placenta, tant en teixits humans com de ratolí. S'ha generat un anticòs contra la proteïna que permet la seva detecció a ronyó, intestí i pulmó amb diferents patrons de glicosilació. També s'ha generat un model murí amb EEG1 mutat, mitjançant l'exposició a l'agent altament mutagènic etilnitrosurea (ENU). La mutació puntual detectada, introdueix un codó stop prematur concretament a la posició de la tirosina 221, que trunca la proteïna aproximadament a la meitat. Els ratolins homozigots per la mutació són viables, fèrtils i segueixen una herència mendeliana. No existeixen diferències pel que fa al pes dels animals mutants i control. No hiperexcreten aminoàcids en orina, ni tenen nivells elevats d'aminoàcids en sang. Presenten alteracions histopatològiques al ronyó i al fetge. Suggerim que EEG1 no té un paper rellevant en la reabsorció renal d'aminoàcids sense descartar una possible compensació per altres transportadors. / System L amino acid transporters mediate the movement of bulky neutral amino acids across cell membranes. Until now, three proteins that induce system L activity have been identified: LAT1, LAT2 and LAT3. In the present study we identify a new cDNA, designated LAT4, which also mediates system L activity when expressed in Xenopus laevis oocytes. Human LAT4 exhibits 57% identity to human LAT3 and 30% to EEG1. LAT4 protein is glycosylated and reaches plasma membrane in HeLa cells and Xenopus oocytes when LAT4 is overexpressed. LAT4 mRNA is expressed mainly in placenta, small intestine and kidney. In situ hybridization experiments show that LAT4 mRNA is restricted to the epithelial cells of distal tubule and the collecting duct in the kidney and in the cells of the crypt in the intestine. Like LAT3, the amino acid transport activity induced by LAT4 is sodium-, chloride- and pH-independent, is not trans-stimulated, and shows two kinetic components. The low affinity component of LAT4 induced activity is sensitive to the sulfhydryl-specific reagent N-ethylmaleimide (NEM) but not that with high affinity. Mutation in LAT4 of the SLC43 conserved S 297 to A abolishes sensitivity to NEM.EEG1, the third member of SLC43 is glycosylated and when is expressed in heterologous system it reaches the plasma membrane. EEG1 mRNA is expressed mainly in heart and liver, but also is present in kidney, lung and placenta. We generated an antibody able to recognize EEG1 from kidney, small intestine and lung with different patterns of glycosylation. We also generated an EEG1 mutated mouse model caused by the chemical mutagen N-ethyl-N-nitrosurea (ENU) which introduced a point mutation resulting in a truncated protein in amino acid position 221. The homozygous mutant mice were born at normal Mendelian ratios when intercrossing between the heterozygous mice, indicating that there was no embryonic mortality in the mutant animals. Homozygous mice do not hyperexcrete any amino acid in urine and no high level of amino acids in plasma were found. Histopathological studies of the kidney and liver reveal damage alterations in both tissues.

ANTECEDENTSEl coneixement de Ies diferents activitats de transport d'aminoàcids prové de l'anàlisi del transport d'aquests en cèl.lules o vesícules de membrana provinents del teixit que es vol analitzar. A causa de la presència escassa d'aquestes proteïnes en la membrana i també la seva baixa estabilitat, conèixer la proteïna responsable de la funció per una estratègia clàssica de purificació-reconstitució presenta moltes dificultats. A més, és possible que algunes entitats de transport estiguin formades per diferents polipèptids amb propietats fisicoquímiques diferents, i encara és més difícil poder arribar a tenir una fracció totalment pura del transportador analitzat. Davant d'aquestes dificultats, l'expressió funcional en oòcits de "Xenopus" representa una estratègia altemativa per a l'aïllament molecular de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids, sempre que les seves activitats siguin detectables en expressar-les en l'oòcit.D'aquesta forma, el nostre grup va expressar activitat independent de Na+ de transport d'aminoàcids injectant en oòcits poli(A)+ de ronyó de conill. Aquesta activitat de transport era d'especificitat àmplia per a aminoàcids neutres i bàsics, i era saturable amb una K(m) al voltant de 0.6 mM. El missatger responsable d'aquesta activitat tenia una mida entre 1.8 i 2.4 kb (evidenciat per separació del poli(A)+ per mida en gradients de sacarosa i injecció de les diferents fraccions en l'oòcit). Amb aquestes evidències, el nostre grup, en col.laboració amb el grup del professor Heini Murer, va clonar per expressió funcional un cDNA que en expressar-se en oòcits induïa la mateixa activitat que es veia en injectar el poli(A)+ de ronyó. A més, l'activitat d'aquest poli(A)+ s'inhibia en incubar aquest amb un oligo antisentit generat a partir de la seqüència d'aquest cDNA. Aquesta proteïna es va anomenar rBAT ("related to b(0,+) amina acid transport activity"), ja que l'activitat que induïa en oòcits era molt similar a la descrita en blastòcits de ratoli (b(0,+) per Van Winkle. La diferencia que hi havia entre aquestes dues activitats era que rBAT també induïa transport de cistina. Independentment, dos grups diferents van clonar la mateixa proteïna de rata. El transport induït per rBAT en oòcits de "Xenopus" era saturable, amb K(m) per a aminoàcids bàsics i cistina entre 50-100 mil.limicres i variable per a aminoàcids neutres que depenen del grup radical: l'afinitat era més alta quan més gran era el grup radical. Així, a per aminoàcids com la L-leucina la K(m) era de l'ordre de mil.limicres, per a altres com ara la L-alanina, de l'ordre de mM i, finalment l'L-glicina no era transportada. Aquesta activitat de transport no és estereoselectiva, els D-aminoàcids es transporten d'igual forma que els L-aminoàcids.Per tranferència Northem es va analitzar l'expressió de l'RNA missatger. En condicions d'alta astringència, el cDNA d'l'BAT hibrida amb transcrits de 2.2 i 3.8 kb presents en ronyó i mucosa intestinal. Aquestes diferències de mida es deuen a diferències en poliadenilació, fet que es va demostrar posteriorment en clonar-se el cDNA de 3.8 kb emprant també expressió funcional. En condicions de baixa astringència hi ha presència de senyal en cervell (3.8 i 5.4 kb) i en fetge (2.2 kb). Es pensa que deuen ser transcrits homòlegs però no idèntics, ja que no són protegits en un assaig de protecció a RNAases fent servir una sonda d'rBAT de rata. La seqüència d'aminoàcids deduïda a partir de la seqüència de nucleòtids permetia predir una proteïna de 677 aminoàcids amb un pes molecular de 78 kD. A partir de l'anàlisi d'hidrofobicitat i estudis fets amb sistemes de traducció "in Vitro" es va suggerir que la proteïna rBAT seria una glicoproteïna de membrana de tipus II (el domini N-terminal seria citosòlic) amb un únic domini transmembrana. El grup de S. Tate va estudiar més tard la topologia de la proteïna rBAT mitjançant anticossos policlonals dirigits contra diferents parts de la proteïna i, així, va deduir la presència de 4 dominis transmembrana, i que els extrems N i C-terminal són citosòlics. Aquest tipus d'estructura no era usual per als transportadors de membrana descrits fins a aquell moment, fet que va fer plantejar la qüestió de si aquesta proteïna era un transportador per si mateix, un activador de sistemes de transport endògens en l'oòcit, o si formava part d'un complex heterooligomèric amb proteïnes ja presents en l'oòcit.En mirar el banc de dades de gens clonats, es va trobar que el domini extraceI.lular presentava una homologia alta amb una família d'enzims relacionats amb el catabolisme dels sucres. En canvi, la proteïna rBAT no presenta aquesta activitat, ja que presenta una mutació en un residu implicat en el centre actiu de reconeixement dels sucres. A més, es va trobar que rBAT presentava un 30% d'identitat i un 50% de similitud amb la cadena pesada de l'antigen 4F2 (4F2hc). L'antigen 4F2 (també anomenat CD98) és no heterodimer format per una proteïna glicosilada de 85 kD (4F2hc) que havia estat clonada fent servir l'anticòs monoclonal anti-eD98, unit covalentment per ponts disulfurs a una proteïna d'uns 40 kD altament hidrofòbica, no gIicosilada i que no s'havia pogut microseqüenciar. Es desconeixia la funció que tenia 4F2hc, només s'havia suggerit la seva implicació en el cicle cel.lular, ja que és un marcador de proliferació i també se l'havia implicat en la modulació dels nivells intracel.lulars de calci.Sorprenentment, en injectar 4F2hc en l'oòcit, es va observar un increment d'una activitat de transport descrita per Rosa Devés com y(+)L en eritròcits. Aquesta activitat es caracteritza per una inducció de transport d'aminoàcids dibàsics de fomm independent de sodi i neutres de forma dependent de sodi. S'ha demostrat que l'efecte del sodi sobre el transport d'aminoàcids neutres consisteix en la reducció de l'afinitat en unes 50 vegades. La predicció d'estructura de 4F2hc deduïda a partir de la seqüència d'aminoàcids era la d'una proteïna amb un únic domini transmembrana, fet que va plantejar els mateixos dubtes que amb la proteïna rBAT respecte a quina era l'entitat molecular responsable del transport.En analitzar en més detall la seqüència d'aminoàcids de les dues proteïnes es va observar que hi havia un residu de cisteïna, just després del primer domini transmembrana que estava conservat en ambdues proteïnes. Es va hipotetitzar que aquest residu seria el responsable de la formació d'un pont disulfur amb la possible subunitat lleugera de la qual no es coneixia la seqüència.D'aquesta forma es van identificar dues proteïnes, rBAT i 4F2hc, com una nova família de proteïnes implicades en el transport d'aminoàcids. En aquell moment, i a causa del fet que l'BAT induïa transport de cistina en oòcits, es va plantejar la hipòtesi que rBAT fos un gen candidat per a la cistinúria. La cistinúria és una malaltia autosòmica recessiva que presenta com a fenotip bioquímic la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina. A causa de la solubilitat baixa de la cistina, aquesta precipita formant càlculs renals. Per demostrar aquesta hipòtesi, s'havien de trobar nous fets experimentals que estiguessin d'acord amb totes les alteracions descrites per a aquesta malaltia. Així, es va estudiar la localització subcel.lular i l'expressió durant el desenvolupament de la proteïna rBAT. Es va demostrar que la proteïna l'BAT es localitza en el domini apical del túbul proximal S3 i que la seva expressió era postnatal. Aquests fets coincidien amb el que es coneixia del transport de cistina i del lloc on residia el defecte causant de la cistinúria. D'aquesta forma, tots els fets apuntaven a rBAT com a gen candidat.Com a primer pas per detenninar si aquesta hipòtesi era certa, el nostre grup va aïllar i caracteritzar el cDNA corresponent a l'rBAT humà i es va iniciar la recerca de mutacions (principalment de tipus puntual) mitjançant la tècnica coneguda com SSCP en la seqüència codificant del gen d'individus cistinúrics. Així, es van descobrir 6 mutacions puntuals, entre les quals destacava la mutació Met461Thr, per trobar-se en homozigosi. Per mutagènesi dirigida es va construir un cDNA de rBAT humà amb aquesta mutació i es va analitzar funcionalment en oòcits. Es va observar que aquest mutant presentava un defecte en el transport mesurat tres dics després de la injecció, fet que reafirmava la implicació d'rBAT en la cistinúria. Sorprenentment, en realitzar el transport sis dies després de la injecció es va veure que no hi havia diferències respecte a la proteïna salvatge. Per poder explicar aquest comportament de manera més detallada i reafirmar de manera més forta la implicació d'rBAT en la cistinúria, vaig construir i analitzar el mutant Met467Lys, resultats que explico més endavant en l'apartat de "resultats".Aixi i tot, nos resultats obtinguts pel grup d'A Busch a Tübingen, en coI.laboració amb el nostre grup, van suscitar gran controvèrsia. Aquests resultats demostraven que l'activitat induïda per rBAT estava d'acord amb un intercanviador d'aminoàcids. Diferents grups van publicar que no podien comprendre com un intercanviador podria servir com a mecanisme de reabsorció d'aminoàcids. A més, cal recordar, que el fenotip de la cistinúria consisteix en la hiperexcreció d'aminoàcids bàsics i cistina, mentre que rBAT també indueix transport d'aminoàcids neutres. L'explicació d'aquest interrogant ha estat també un dels objectius de la meva tesi.Un detall important i no comentat fins ara és que la cistinúria és una malaltia heterogènia. S'han descrit tres tipus de cistinúria basant-se en les concentracions d'aminoàcids bàsics i cistina en homozigots i heterozigots per a la malaltia i en funció de l'absorció intestinal.El nostre grup va observar quc hi havia famílies on no hi havia una cosegregació entre el locus rBAT i la cistinúria, fet que plantejava la possibilitat que la cistinúria fos una malaltia deguda a mutacions en diferents gens, Una anàlisi més precisa del fenotip d'aquestes famílies va permetre dir que els tipus II i III de cistinúria no són causats per mutacions en rBAT. Quins podrien ser aquests altres gens candidats de cistinúria? Un possible candidat seria un altre transportador de cistina que estigués en els segments S1 i S2 del túbul renal. En aquesta línia, Segal, el 1977, va detectar fent servir vesicules apicals de ronyó de rata dos components de transport de cistina: un d'afinitat alta i capacitat baixa compartit amb aminoàcids bàsics (que podria correspondre a l'activitat deguda a rBAn i no altre d'afinitat baixa (K., =0.93 mM) i capacitat alta. A més, per estudis de microperfusió en túbuls aïllats, Vòlkl i Silbemagl van demostrar que al voltant del 90% de la cistina infosa pel túbul era reabsorbida pel túbul contornejat distal i que aquesta reabsorció era inhibida per fenilalanina a una concentració de 10 mM. Així, el gen o els gens responsables d'aquest sistema de transport podrien ser també gens de cistinúria. Un altre gen candidat seria la possible subunitat lleugera, que igual que per a la proteïna 4F2hc estaria lligada a rBAT per ponts disulfur. Quines evidències hi ha sobre la presència d'aquesta subunitat?:1. Si es fan experiments de transferència western fent servir un anticòs dirigit contra la proteïna rBAT amb membranes de ronyó, el pes que es detecta és diferent en funció de la presència o no d'agents reductors. Així, en absència d'agents reductors es detecten bandes de 125 kD de mobilitat electroforètica i de més alt pes molecular, mentre que la seva movilitat en presència d'agents reductors és de 94 kD. En tractar amb endoglicosidasa F aquesta banda de 94 kD passa a tenir una mobilitat que està d'acord amb el pes molecular deduït a partir de la seqüència d'aminoàcids. Per experiments de transferència western en gels de dues dimensions (primera dimensió no reductora, segona dimensió reductora) i per experiments de "crosslinking" amb reducció posterior, s'ha observat que la banda de 94 kD forma part d'aquest complex. Malauradament, no s'ha pogut immunoprecipitar aquest complex com s'havia fet en el cas de l'antigen 4F2, que demostrava directament que aquestes dues proteïnes interaccionen directament.2. L'expressió de la proteïna rBAT en cèl.lules heteròlogues (COS, MDCK) no suposa cap activitat de transport: la proteïna o no arriba a la membrana o si hi arriba no indueix cap activitat de transport. En aquestes cèl.lules transfectades no s'han detectat per transferència western aquestes bandes de pes molecular més alt (125 kD).3. Ens podem preguntar llavors si podem detectar aquests complexos de pes molecular més alt en l'oòcít de "Xenopus". En condicions no reductores s'ha observat una lIeugera banda de 125 kD (en comparació amb la intensilat de la banda de 94 kD), banda que s'ha postulat que seria homòloga a la detectada en membranes de ronyó.Així, totes aquestes evidències experimentals estan a favor d'un model on la proteïna rBAT estaria associada a una altra proteïna ("subunitat lleugera") mitjançant ponts disulfur. Aquesta possible proteïna seria, doncs, un altre gen candidat de cistinúria.OBJECTIUSTenint en compte els antecedents descrits en l'apartat anterior es van plantejar els següents tres objectius inicials:1. Reafirmar la implicació d'rBAT en la malaltia cistinúria construint per mutagènesi dirigida cDNA d'rBAT que continguessin alteracions en la seqüència d'aminoàcids.Així es va construir el mutant Met467Lys i es va caracteritzar en oòcits l'activitat induïda per intentar explicar el possible defecte que patien pacients cistinúrics que tinguessin la proteïna rBAT amb aquesta alteració.2. Intentar comprendre els mecanismes dc reabsorció d'aminoàcids bàsics i cistina partint de les activitats induïdes per rBAT i 4F2hc en l'oócit de "Xenopus". D'aquesta manera també es volia comprendre com alteracions en l'activitat b(0,+) induïda per rBAT podrien explicar el fenotip cistinúric.3. Estudiar el paper de les proteïnes rBAT i 4F2hc com a components i/o activadors dels sistemes de transport b(0,+) i (+)L respectivament.Es volia detenninar primer quina era l'estructura del transportador per poder identificar més tard quina era l'entitat molecular responsable del transport i aixi entendre com aquestes dues proteïnes (la cadena lleugera i la cadena pesada) interaccionaven entre si.CONCLUSIONS1. Es reafirma la implicació del gen rBAT en la cistinúria de tipus 1. Dues de les mutacions trobades en pacients cistinúrics, Met467Lys i Met46TThr, no són completament funcionals a causa d'un problema en el trànsit cap a la membrana plasmàtica.2. El transportador b(0,+) funciona com un intercanviador obligatori d'aminoàcids amb estequiometria 1:1. En aquesta tesi hem vist que el potencial de membrana i l'intercanvi amb aminoàcids neutres són les principals forçes que penneten acumular aminoàcids. Aquest mecanisme explica completament el fenotip de la cistinúria de tipus I. El transportador y(+)L també funciona com un intercanviadar d'aminoàcids, però de forma asimètrica ja que únicament permet la sortida d'aminoàcids bàsics, a causa probablement de les baixes concentracions de sodi intracel·lulars.3. Els transportadors b(0,+) i y(+)L formen part d'una gran família de transportadors heteromultimèrics constituïts per dues subunitats: una subunitat llengera (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-l, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, etc) responsable de l'especificitat de substracte, i una subunitat pesada (4F2he, rBAT), necessària per a l'expressió en superfície de la subunitat lleugera. Aquestes dues proternes interaccionen a través d'un pont disulfur entre 2 residus de cisteïna que estan altament conservats. A part d'aquesta interacció covalent, són necessàries altres interaccions entre altres dominis com ara l'extrem C-terminal d'rBAT. Així, rBAT determina propietats funcionals del transportador b(0,+).4. La mutació L334R trobada en un pacient espanyol amb LPI i la mutació V170M trobada en pacients jueus amb cistinúria de tipus no-I, provoquen un defecte en la funció de la proteïna y(+)LAT-1 i b(0,+)AT, respectivament.5. S'ha identificat una nova família de transportadors lisosomals formada per 3 membres, MfP, LyCAT i LyMAT. LyCAT funciona com un transportador lisosomal d'aminoàcids bàsics, mentre que LyMAT funciona com un transportador lisosomat de múltiples aminoàcids. El domini C-terminal d'aquestes proteïnes en determina la locaIització subcel·lular. Estudis posteriors permetran implicar el transportador Iisosomal LyCAT en la regulació de la síntesi de NO en macròfags, com permeten suggerir les dades obtingudes en la present tesi. / l. It is reaffirmed the implication of the gene rBAT in the type I cystinuria. Two of the mutations found in cystinuric patients, Met467Lys and Met467Thr, are not thoroughly functional due to a problem in the travel toward the plasma membrane.2. The carriers b(0,+) operates as a obligatory exchanger of amino acids with 1: 1 stoichiometry. In this thesis, we have seen that the membrane potential and the exchange with neutral amino acids are the principal forces that permit to accumulate amino acids. This mechanism fully explains the phenotype of the type I cystinuria. The carrier y(+)L also operates as an exchanger of amino acids, but in a asymmetrical way, since solely permits the exit of basic amino acids, because probably of the lower intracellular sodium concentrations.3. The carriers b(0,+) and y(+)L form part or a great heteromultimerics carriers family constituted by two subunits: a light subunit (LAT-l, LAT-2, ascAT, y(+)LAT-I, y(+)LAT-2, XCAT, b(0,+)AT, ... ) responsible for the substrate specificity and a heavy subunit (4F2hc, rBAT) necessary for the expression in surface or the light subunit. These two proteins interact to through a disulfur bridge between two residues of cisteine that are highly preserved. In addition to this covalent interaction, they are necessary other domains as the extreme C-terminal of rBAT. Then, rBAT it determines functional properties or the transporter.4. The mutation L334R found in a Spanish patient with LPI and the mutation Vl70M found in Jewish patients with non-type I cystinuria provoke a defect in the function of the proteins y(+)LAT-I and b(0,+)AT, respectively.5. It has been identified a new family of lysosomal carriers formed by 3 members: MTP, LyCAT and LyMAT. LyCAT operates as a lysosomal carrier of basic amino acids, while LyMAT operates as a Iysosomal carrier of multiples amino acids. The C-terminal domain or these proteins determines their subcelular localization. Subsequent studies will alIow to imply the Iysosomal carrier LyCAT, in the regulation of the synthesis of NO in macrophages, as permit to suggest the data obtained in the present thesis.

El objetivo de esta tesis es: (1) determinar si el consumidor español asocia la grasa intramuscular (GIM) a la aceptabilidad de la carne de cerdo; (2) incrementar la GIM a través de estrategias nutricionales (adición de acido linoleico conjugado, reducción de vitamina A, reducción de proteína, lisina, suplementación con arginina y leucina). Los resultados mostraron que desde el punto de vista gustativo el consumidor prefiere la carne con un mayor contenido de GIM. Se obtuvo un incremento de la GIM al reducir el nivel de proteína (sin modificar la lisina) o al reducir el nivel de lisina (sin modificar la proteína) y al utilizar una línea genética grasa y no en una línea genética más magra. Se puede concluir que la modificación de la GIM a través de la dieta depende del genotipo, y que las modificaciones de los niveles de proteína y lisina son las más eficaces. / The objective of this thesis was: (1) to test if Spanish consumers associate intramuscular fat (IMF) content with acceptability of pork meat; (2) to increase IMF through nutritional strategies (supplementation with conjugated linoleic acid, reduction of vitamin A, reduction of protein, lysine, supplementation with arginine and leucine). Results showed that from the point of view of taste, consumers prefer the meat with a high IMF content. An increase of IMF was observed when dietary protein or lysine were reduced (without modifying lysine or protein content, respectively) in a fatter but not in a leaner genotype. It can be concluded that modification of IMF content through the diet depends on the genotype, and that changes in dietary protein and lysine levels elicit the greatest response.

Les molècules ramificades poden jugar un paper clau en la síntesi en fase sòlida de compostos amb una elevada complexitat estructural. En aquest sentit i concretament en la síntesi de pèptids i peptidomimètics, els aminoàcids trifuncionals hi juguen un paper fonamental. En aquesta tesi s'han utilitzat aquest tipus de molècules per tal d'obtenir estructures complexes com són els pèptids cíclics, els foldàmers i noves quimioteques. Com a plataformes ramificadores s'han utilitzat derivats trifuncionals de prolina, com la cis-gamma-amino-L-prolina i la trans-4-hidroxi-L-prolina. Així, la present tesi doctoral descriu tres projectes diferents els quals comparteixen l'ús de la síntesi en fase sòlida com a metodologia sintètica, així com la utilització d'aminoàcids trifuncionals. Els diferents projectes es basen en: (i) estudi de grups protectors ortogonals en la síntesi de pèptids cíclics en fase sòlida; (ii) síntesi, estudis estructurals i aplicacions de fòldamers gamma-peptídics derivats de la gamma-amino-L-prolina; i (iii) síntesi en fase sòlida d'una llibreria d'inhibidors de la lisil-tRNA sintetasa (LysRS) de Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. CAPÍTOL 1: En la síntesi en fase sòlida és del tot imprescindible disposar de grups protectors ortogonals per tal d'obtenir uns resultats satisfactoris al final d'una síntesi complexa. Tot i això, no sempre s'arriba als resultats esperats. El primer capítol d'aquesta tesi descriu els problemes derivats de treballar amb els grups protectors d'amines Fmoc i Alloc quan estan continguts en el mateix aminoàcid trifuncional. El problema que es descriu és l'eliminació prematura del grup Fmoc en les condicions d'eliminació dels grup Alloc. Així, s'estableix l'origen del problema i s'estableixen metodologies alternatives d'acoblament per tal d'evitar subproductes no desitjats. Aquest mateix capítol descriu la síntesi en fase sòlida de tetra-beta-pèptids cíclics utilitzant un sistema de protecció tetraortogonal. CAPÍTOL 2: Els gamma-pèptids són els foldàmers més estudiats fins al moment, ja que se n'ha descrit propietats força interessants com ara l'antimicrobiana o la seva capacitat per travessar la membrana de cèl·lules eucariotes, fet que els converteix en bons candidats a transportadors de fàrmacs. La rellevància que estan adoptant aquests peptidomimètics es deu bàsicament al fet que aquestes molècules no naturals poden millorar alguns inconvenients dels pèptids naturals, com pot ser la baixa estabilitat en front a proteasses. El segon capítol d'aquesta tesi doctoral descriu la síntesi en fase sòlida de gamma-pèptids derivats de la cis-gamma-amino-L-prolina. A més a més, estudis estructurals mitjançant l'ús de tècniques de dicroïsme circular i ressonància magnètica nuclear estableixen que aquest tipus de compostos formen llaços C9, donant com a resultat en una estructura regular una sèrie de girs concatenats d'aquest tipus, estructura que també es pot descriure com a hèlix 9. Aquest mateix capítol descriu algunes propietats d'aquest compostos, com ara la seva capacitat de travessar membranes cel·lulars, la baixa toxicitat, l'elevada estabilitat en front a proteasses o l'activitat antimicrobiana. L'entrada cel·lular de cada pèptid es quantifica mitjançant tècniques de fluorimetria de plaques i de citometria de flux i es visualitza al microscopi confocal. CAPÍTOL 3: El tercer capítol descriu la síntesi d'una llibreria de compostos potencials inhibidors de la lisil-tRNA sintetassa (LysRS) del Plasmodium falciparum, paràsit causant de la malària. S'ha vist que les aminoacil-tRNA sintetasses poden ser dianes terapèutiques força vàlides, ja que tot i ser enzims essencials en totes les espècies, aquestes es poden inhibir d'una forma espècie-específica. En la ruta biològica de la traducció en la que participen les tRNA sintetasses es forma un complex intermedi, l'aminoacil adenilat, en el qual es va basar el disseny dels inhibidors. Així, aquest capítol descriu la síntesi de sulfamats en fase sòlida i la seva posterior utilització en la síntesi d'una llibreria de 90 inhibidors. / Branched molecules, such as trifunctional amino acids, can play important roles in the creation of complex structures using solid-phase synthesis. This thesis describes the use of proline derived trifunctional amino acids such as cis-gamma-aminoproline and trans-4-hidroxyproline for the synthesis of cyclic peptides, foldamers and libraries. Thus, this thesis has been divided into three different chapters, which share both the use of these trifunctional molecules and the use of solid-phase peptide synthesis as a common methodology. The first chapter describes several problems derived from the use of orthogonal protecting groups in the same molecule. For instance, it describes that, in certain cases, the Fmoc protecting group can be removed when eliminating the Alloc one, not for its removing conditions but for the free amine that are kept free once the Alloc group has been removed. The use of several protecting groups at the same time was also tested in the synthesis of cyclic tetra-beta-peptides using a tetra-orthogonal protecting scheme. The second chapter describes the solid-phase synthesis of abiotic foldamers derived from proline derivatives. This chapter also describes that these compounds can fold forming a series of C9 turns, which, in an idealised structure, can form an helix 9. The labelling of these gamma-peptides with a fluorescent probe followed by their confocal microscopy study reveal that these gamma-peptides are able to cross the cell membrane of eukaryotic cells, a property that makes them good candidates as drug carriers for drug delivery. Actually, the conjugation of one of them with a PNA reveals that this gamma-peptide can transport this big non-membrane permeable molecule inside the cell, demonstrating its value for such application. In the third chapter, the solid phase synthesis of sulfamates is described, as well as their application in the synthesis of inhibitors of the lysil-tRNA synthetase (LysRS) of "Plasmodium falciparum"

El creixement de la indústria aqüícola depèn, en part, de reduir el contingut de farina de peix de les dietes. Actualment les dietes comercials contenen un 30 - 40% de proteïna vegetal, però percentatges majors de substitució provoquen un menor creixement i una menor eficiència d'utilització de l'aliment. Aquests efectes estan provocats per la presència en les fonts vegetals de factors antinutricionals, sucres complexes, per la limitació del fòsfor, la pitjor palatabilitat i per un perfil no balancejat d'aminoàcids.Existeix una estreta relació entre el contingut d'aminoàcids de la dieta (especialment aminoàcids essencials), els aminoàcids lliures dels teixits, el metabolisme d'aquests teixits i la utilització dels aminoàcids per sintetitzar proteïnes. Estudiar aquestes relacions és necessari per millorar la utilització dietes amb un elevat (> 30%) contingut de proteïna vegetal. Per fer aquests estudis es van marcar dietes amb diferent percentatge de substitució (0%, 50%, 75%, 100%) amb isòtops estables (13C i 15N). Es va fer el seguiment postprandial (11 i 24h) de la proteïna de la dieta, analitzant la incorporació de marcatge en els components principals (proteïna, lípid i glicogen) dels teixits (fetge, múscul blanc i paquet visceral), així com en els aminoàcids lliures de plasma i múscul.Els nostres estudis demostren que en les dues espècies estudiades (truita irisada i orada) es pot substituir un 50% de la farina de peix per fonts vegetals sense alterar l'ús de la proteïna de la dieta.En la truita, la dieta de 75% de substitució va provocar una major oxidació de la proteïna de la dieta, incidint negativament sobre el creixement. Ara bé, en aquest grup, el patró de distribució dels marcadors en components principals de teixits era similar al de la situació control. En canvi, el 100% de substitució va provocar en aquesta espècie un increment del reciclatge dels aminoàcids del múscul, una disminució de la relació essencials/no essencials en plasma i múscul, així com una major activitat de la gluconeogènesi hepàtica. D'altra banda, el seguiment dels hidrats de carboni de la dieta 100% vegetal (mitjançant marcatge amb midó-13C) va posar de manifest la baixa disponibilitat d'aquests.En l'orada, un 75% de substitució va provocar una major oxidació de la proteïna de la dieta. En aquesta espècie, la disponibilitat dels aminoàcids de la dieta 100% vegetal era menor en comparació als altres grups, fet que va provocar un increment del reciclatge proteic en múscul, evidenciat per el major enriquiment en 13C de l'alanina, l'aspartat i la prolina, així com per la disminució de la relació essencials/no essencials. A diferència de la truita, l'orada no va presentar problemes de digestió i absorció dels hidrats de carboni de la dieta 100% vegetal.La tècnica de marcatge amb isòtops ha permès fer aquests estudis sense problemes de contaminació ambiental i personal. A més, l'estudi del fraccionament isotòpic del 15N ha resultat un eina molt útil per determinar el reciclatge proteic. D'altra banda, els nostres estudis mostren que el 15N pot ser un bon marcador de l'origen de la proteïna de la dieta. / High percentage (>40%) of plant sources in feedstuffs for carnivorous fish generally provoke a decrease of the growth. This is associated with the minor quality of the plant proteins in comparison with the animal proteins.The aim of this thesis was to study the effect of the fish meal substitution (0, 50, 75,100%) by plant protein on the use of dietary protein in rainbow trout and gilthead sea bream. Diets were marked with protein enriched in 13C and 15N. The incorporation of 13C-protein and 15N-protein in the principal components (lipid, protein, glycogen) of tissues (muscle, liver, gut), and in the free amino acids of plasma and muscle was measured11 and 24 hours after forced-feeding.In both species, 50% of fish meal substitution did not change the use of dietary protein in comparison with control group (0%). In trout, 75% of substitution provoked a major oxidation of dietary protein but the distribution of the markers in the principal components of tissues was similar to that of the control situation. Total substitution (100%) provoked in trout an increase amino acids turnover in muscle, a decrease in the ratio essential / not essential amino acids in plasma and muscle, and an activation of the hepatic gluconeogenesis. The follow-up of the carbohydrates of the diet 100% vegetable (diet labeled with starch - 13C) showed the low availability of sugars.In gilthead sea bream, 75 % of substitution provoked a major oxidation of dietary protein. In this species, the availability of the amino acids was lower in 100% substituted diet than in the control group. It provoked an increase of protein turnover in muscle. Sea bream did not show problems of digestion and absorption of the carbohydrates of 100% diet.The study of 15N fractionation allowed to study the protein turnover and the origin of dietary protein.

Although the genome sequence and gene content are available for an increasing number of organisms, eukaryotic selenoproteins remain poorly characterized. In these proteins, selenium (Se) is incorporated in the form of selenocysteine(Sec), the 21st amino acid. Selenocysteine is cotranslationally inserted in response to UGA codons (a stop signal in the canonical genetic code). The alternative decoding is mediated by a stem-loop structure in the 3'UTR of selenoprotein mRNAs (the SECIS element). Selenium is implicated in male infertility, cancer and heart diseases, viral expression and ageing. In addition, most selenoproteins have homologues in which Sec is replaced by cysteine (Cys).Genome biologists rely on the high-quality annotation of genomes to bridge the gap from the sequence to the biology of the organism. However, for selenoproteins, which mediate the biological functions of selenium, the dual role of the UGA codon confounds both the automatic annotation pipelines and the human curators. In consequence, selenoproteins are misannotated in the majority of genome projects. Furthermore, the finding of novel selenoprotein families remains a difficult task in the newly released genome sequences.In the last few years, we have contributed to the exhaustive description of the eukaryotic selenoproteome (set of eukaryotic selenoproteins) through the development of a number of ad hoc computational tools. Our approach is based on the capacity of predicting SECIS elements, standard genes and genes with a UGA codon in-frame in one or multiple genomes. Indeed, the comparative analysis plays an essential role because 1) SECIS sequences are conserved between close species (eg. human-mouse); and 2) sequence conservation across a UGA codon between genomes at further phylogenetic distance strongly suggests a coding function (eg. human-fugu). Our analysis of the fly, human and Takifugu and Tetraodon genomes have resulted in 9 novel selenoprotein families. Therefore, 20 distinct selenoprotein families have been described in eukaryotes to date. Most of these families are widely (but not uniformly) distributed across eukaryotes, either as true selenoproteins or Cys-homologues.The correct annotation of selenoproteins is thus providing insight into the evolution of the usage of Sec. Our data indicate a discrete evolutionary distribution of selenoprotein in eukaryotes and suggest that, contrary to the prevalent thinking of an increase in the number of selenoproteins from less to more complex genomes, Sec-containing proteins scatter all along the complexity scale. We believe that the particular distribution of each family is mediated by an ongoing process of Sec/Cys interconversion, in which contingent events could play a role as important as functional constraints. The characterization of eukaryotic selenoproteins illustrates some of the most important challenges involved in the completion of the gene annotation of genomes. Notably among them, the increasing number of exceptions to our standard theory of the eukaryotic gene and the necessity of sequencing genomes at different evolutionary distances towards such a complete annotation.