La malaltia de Gaucher és una malaltia d'herència autosòmica recessiva, causada per mutacions en el gen GBA, o en alguns pocs casos, per mutacions en el gen PSAP. El gen GBA codifica la hidrolasa lisosòmica Glucocerebrosidasa i el gen PSAP codifica la proteïna activadora de l'enzim anterior, la Saposina C.Fins al moment s'han descrit més de 200 mutacions en el gen GBA causants de la malaltia de Gaucher, que han permès desenvolupar un diagnòstic molecular de la malaltia, i unes poques en el gen PSAP.Aquestes mutacions produeixen una deficiència en alguna d'aquestes dues proteïnes, la Glucocerebrosidasa o la Saposina C, que estan implicades en la via de degradació dels glicoesfingolípids.Algunes de les mutacions descrites en el gen GBA són al·lels complexos, que són portadors de diferents mutacions, produïts per processos de recombinació entre el gen i el seu pseudogèn.En aquest treball presentem el cas d'un individu que va ser dignosticat erròneament com a homozigot per a la mutació N370S, quan realment era portador d'un al·lel complex no descrit fins al moment.A més, hem volgut caracteritzar millor l'al·lel mutant RecNciI i per a això hem analitzat aquesta mutació en població espanyola i argentina, ja que és molt freqüent en aquesta última població, utilitzant diferents mètodes. D'aquesta manera també hem pogut trobar nous individus que tenien al·lels Rec i no s'havien pogut detectar, i entendre millor els mecanismes mitjançant els quals es produeixen aquests al·lels.També s'han analitzat mostres de pacients de la malaltia de Gaucher que eren candidats de ser portadors de mutacions en el gen PSAP. Aquest anàlisi ens ha permès decriure una mutació en la Saposina D que juntament amb una altra mutació ja descrita prèviament és la causant de la patologia.Fins al moment s'han desenvolupat diferents tècniques de teràpia gènica, però en general tenen moltes limitacions. Per una banda els vectors utilitzats poden generar reaccions immunes (adenovirus) o integracions a l'atzar en el genoma (retrovirus). Per altra banda, el gen forani deixa d'expressar-se després d'un cert temps. Per tot això és lògic que s'hagin desenvolupat noves estratègies per a la teràpia de malalties genètiques. Una d'aquestes aproximacions és l'utilització de quimeraplasts, molècules quimèriques de RNA-DNA capaces de promoure la correcció d'una mutació mitjançant els mecanismes de reparació de la cèl·lula. En la malaltia de Gaucher una de les mutacions més freqüents és la L444P. Hem intentat corregir aquesta mutació utilitzant quimeraplasts en fibroblasts d'un pacient de la malaltia de Gaucher homozigot per la mutació L444P.Els resultats obtinguts mostren una molt baixa, o nul·la, eficiència de correcció. Recentment s'han publicat diferents treballs on descriuen també resultats negatius per altres malalties utilitzant aquesta tècnica, deixant en entredit l'eficàcia d'aquesta tècnica.Una de les teràpies que actualment s'està utlitzant en la malaltia de Gaucher és la teràpia de reducció de substrat com a complement o alternativa a la teràpia de reemplaçament enzimàtic. La teràpia de reducció de substrat es basa en la inhibició parcial de la glucosilceramida sintasa (GCS), enzim encarregat de sintetitzar glucosilceramida a partir de ceramida i glucosa. D'aquesta manera s'evita l'acúmul de glucosilceramida que provoca la malaltia.En els darrers anys, els siRNAs (small interference RNAs) s'han utilitzat en diferents tipus d'experiments per inhibir l'expressió gènica. L'objectiu d'aquest treball és la inhibició de la expressió del gen de la GCS mitjançant siRNAs com una possible alternativa terapèutica per a la malaltia de Gaucher.Vam dissenyar quatre siRNAs per a inhibir el gen GCS humà i els vam transfectar en cèl·lules HeLa. Amb dos d'aquests siRNAs vam aconseguir reduir la expressió de GCS a nivell de RNA. També vam comprovar la reducció tant a nivell d'activitat enzimàtica com de formació de glucosilceramida.Després d'aconseguir silenciar el gen de la GCS utilitzant siRNAs, vam decidir probar-ho utilitzant shRNAs (short-hairpin RNAs). Els shRNAs són siRNAs generats per un plasmidi on se li ha insertat la seqüència que s'ha de transcriure per formar aquest shRNA. Vam generar dos shRNAs diferents aconseguint inhibir també l'expressió de GCS. / "Characterization of mutations causing Gaucher disease. Gene therapy approach."The glycosphingolipid (GSL) lysosomal storage disorders are a group of inherited genetic diseases caused by mutations in the genes coding for enzymes involved in GSL catabolism. These diseases are characterised by the accumulation of the GSL substrates within lysosomes of cells, which results in cellular dysfunction and damage. The most common of the glycosphingolipidoses is Gaucher disease (GD), an autosomal recessive trait due to the accumulation of glucosylceramide caused by deficient activity of the enzyme glucocerebrosidase (EC 3.2.1.45).The glucocerebrosidase gene, lies on a gene-rich region which includes the metaxin gene and the glucocerebrosidase and metaxin highly homologous pseudogenes. The presence of these repetitions leads to DNA rearrangements. Some of these rearrangements give rise to complex alleles that cause the disease, of which RecNciI is the most prevalent. We analysed Gaucher disease patients from Argentina and Spain bearing this allele, and patients who carried mutation L444P, one of the three changes present in the RecNciI allele. Only two patients bearing mutations in the PSAP gene, and not in the GBA gene, have been reported. In both cases, one mutant allele remained unidentified. We report here the identification of the second mutation in one of these patients, being the first complete genotype described so far in a SAP-C deficient-GD patient. This mutation, p.Q430X, is the first one reported in the saposin D domain and probably produces a null allele by nonsense mediated mRNA decay.A number of gene therapy approaches have been developed for the treatment of genetic diseases, most of them based on the use of viral vectors. However, in general they have not been successful and some complications. To overcome these limitations, novel strategies have recently emerged. One of them is chimeraplasty, based on the correction of single-base mutations by mismatch repair mechanisms using chimeric RNA/DNA oligonucleotides, named chimeraplasts. Mutation L444P is one of the most common mutations in many populations. We have attempted to correct mutation L444P in fibroblasts from a Gaucher disease patient using a chimeraplast approach. Our results show a very low efficiency (if any) of chimeraplast correction. In the last few years, small interference RNAs (siRNAs) have been used in a number of different experimental settings to silence gene expression. Enzyme replacement and substrate deprivation therapies are the current approaches to treat Gaucher disease. We present here a new approach based on the inhibition of the GCS gene using siRNAs as a possible future therapeutic strategy for Gaucher disease. A clear reduction in GCS RNA levels, enzyme activity and glucosylceramide synthesis was achieved. Similar results were obtained when using plasmids expressing shRNAs. Also, siRNAs to inhibit the mouse homolog Ugcg gene were successfully assayed.

La via Ras-Raf-MAPK regula funcions cel·lulars com la proliferació, la transformació o l'apoptosi. En càncer sol presentar mutacions activants en algun dels tres gens que codifiquen per a Ras (KRAS, HRAS y NRAS) i en un dels gens que codifiquen per a Raf (BRAF). A més, les mutacions de Ras i Raf són events alternatius ja que mai es donen a la vegada en un mateix tumor, suggerint que aquestes mutacions activen a la mateixa via. En càncer colorectal (CCR) la mutació puntual de BRAF V600E s'associa significativament als casos que presenten inestabilitat de microsatèl·lits (MSI) que solen presentar mutacions per inserció o deleció a seqüències repetitives.En aquesta tesi hem volgut determinar possibles associacions moleculars o clínico-patològiques de la mutació V600E que permetin explicar l'alta capacitat tumorogènica d'aquesta mutació en aquest tipus específic de tumor. Així, en càncer gàstric, que en MSI presenta un patró mutacional molt semblant al colorectal, no hem detectat mutacions de BRAF, ni en casos estables (MSS) ni en MSI, mentre que si que hem confirmat l'associació d'aquesta mutació a MSI en CCR. Sorprenentment, les mutacions de KRAS en càncer gàstric també s'associen significativament a MSI, mentre que en CCR es troben a ambdós fenotips (MSS i MSI). Per un altre costat, en CCR MSI esporàdic, que sol estar provocat per l'hipermetilació del gen MLH1, no hem trobat cap associació de BRAF-V600E amb mutacions als gens KRAS, APC ni p53. En canvi, si que hem detectat una clara associació de V600E amb l'hipermetilació de MLH1. A més, analitzant els mateixos tumors per la metilació dels gens p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT i THBS1 hem associat BRAF-V600E i l'hipermetilació de MLH1 a un estat d'hipermetilació genòmica. D'una altra banda, no hem trobat cap associació de BRAF amb cap característica clínico-patològica a excepció de la localització ja que BRAF-V600E es detecta significativament en els casos proximals. També hem analitzat casos de CCR de pacients HNPCC, que tenen MSI per mutacions germinals enlloc de per metilació. No hem detectat cap mutació V600E de BRAF en aquests tumors, tant si tenen mutacions germinals a MLH1, MSH2 o MSH6 o no tenen mutació coneguda però compleixen criteris clínics com els d'Amsterdam o els de Bethesda més estrictes. Això confirma que V600E no es dóna específicament als casos MSI sinó en els casos amb hipermetilació de MLH1, i que aquests solen tenir més metilació genòmica que la resta de tumors.Apart, també hem analitzat KRAS en casos de CCR MSS, MSI esporàdics amb i sense hipermetilació de MLH1 i HNPCC. Així, la freqüència de mutacions a KRAS és més alta si no hi ha hipermetilació de MLH1, independentment del seu origen esporàdic o hereditari. No obstant, en els casos esporàdics aquestes mutacions afecten sobretot al codó 12 mentre que en els casos hereditaris afecten al codó 12 i al 13 equitativament. A més, els casos HNPCC amb mutació a MLH1 tenen una freqüència de mutacions a KRAS menor que si la mutació germinal té lloc a MSH2 o MSH6. Finalment, les diferències mutacionals de KRAS i BRAF en CCR esporàdic i hereditari suggereixen una modulació diferent de la via Ras-Raf-MAPK així com una possible activació d'altres vies moleculars alternatives depenent de l'estat en que es trobi el fons genètic i epigenètic del tumor. A més, l'absència total de la mutació V600E de BRAF a HNPCC la converteix en una eina fiable, ràpida i de baix cost per al diagnòstic molecular com a criteri d'exclusió de càncer familiar. / The Ras-Raf-MAPK pathway regulates functions such as cell proliferation, transformation and apoptosis. In cancer activating mutations are present in the three Ras genes (KRAS, HRAS and NRAS) and in one Raf gene (BRAF). Moreover, Ras and Raf mutations hardly ever are found together in the same tumor suggesting that they activate the same pathway. In colorectal cancer (CRC) the BRAF hotspot mutation V600E is associated to microsatellite instability (MSI), which is characterised by insertion/deletion mutations in repetitive sequences. Here we have determined possible molecular or clinico-pathological associations of V600E to understand its higher tumorogenic capabilities in this subset of tumors.We found that BRAF was not mutated in gastric cancer with MSI or without (MSS), although gastric and colorectal MSI tumors presented the same mutational patterns. Interestingly, gastric cancer only presented KRAS mutations in MSI tumors. Furthermore, in sporadic MSI CRC (which is usually caused by MLH1 hypermethylation) BRAF-V600E was not associated to KRAS, APC or p53 mutations but it was to MLH1 hypermethylation and to genomic hypermethylation after analysing p16, p14, RASSF1A, APC, MGMT and THBS1. In addition, V600E was associated significantly to tumors located in the proximal colon. Moreover, tumors from HNPCC (a hereditary form of MSI cancer caused by germline mutations in mismatch repair genes) never had V600E mutations.We have also analysed KRAS in CRC showing MSS, sporadic MSI with or without MLH1 hypermethylation and HNPCC. We found that KRAS mutation frequency is higher if MLH1 is not hypermethylated, independently of its sporadic or hereditary origin. And although in sporadic tumors these mutations are located in codon 12, in the hereditary ones they are located in codons 12 or 13 equally. Furthermore, HNPCC tumors carrying germline MLH1 mutations have less KRAS mutations than tumors with germline mutations in MSH2 or MSH6. Finally, we concluded that KRAS and BRAF differences in sporadic and hereditary CRC suggest a different Ras-Raf-MAPK modulation and possible alternative activation pathways depending on the genetic and epigenetic background of the tumor. Moreover, V600E is a reliable, fast and cheap tool for HNPCC diagnosis to exclude a hereditary origin.

En aquesta tesi s'ha realitzat una aproximació genètica i molecular a les malalties Gangliosidosi GM1 i Morquio B. Aquestes dues malalties són causades per mutacions en un únic gen, el gen GLB1. Aquest gen codifica per la proteïna beta-galactosidasa lisosòmica, de manera que mutacions al gen GLB1 alteren la funcionalitat d'aquesta proteïna. Això pot conduir a l'acumulació dels diferents substrats que normalment són degradats per la beta-galactosidasa: el gangliòsid GM1, el queratà sulfat i diferents oligasacàrids proteics. En aquesta tesi es presenten els resultats de la cerca de mutacions en 49 pacients amb Gangliosidosi GM1 i 5 amb Morquio B. Els pacients estudiats provenien bàsicament d'Espanya i d'Argentina. Es van poder identificar 52 mutacions diferents de les que 32 no havien estat descrites prèviament. A més a més, per a la majoria de mutacions identificades es va poder establir una correlació entre la mutació trobada i un fenotip determinat de la malaltia. La mutació R59H va ser la mutació més prevalent a les poblacions analitzades, essent especialment prevalent als pacients d'ètnia gitana, on aquesta va ser l'única mutació descrita. A més a més, en aquests pacients la mutació R59H sempre es va trobar associada a un mateix haplotip, cosa que indicaria un origen únic del canvi R59H dins de la població gitana.Posteriorment, algunes de les mutacions identificades van ser expressades in vitro utilitzant com a sistema d'expressió les cèl.lules COS-7 transfectades amb Lipofectamina. D'aquesta manera es van expressar 15 variants mutades de la beta-galactosidasa. Les variants causants de la forma infantil (la forma més severa) van mostrar una activitat enzimàtica residual nul.la, mentre que 3 variants associades a formes més lleus (el tipus adult i la malaltia de Morquio B) van resultar en activitats residuals amb un rang del 7-15%. Per altra banda, 3 canvis que eren polimòrfics (no patogènics) van ser els que van presentar una activitat enzimàtica residual més elevada, al voltant del 30-60%. Així doncs, es va poder concloure que el sistema d'expressió emprat era un bon sistema per establir correlacions entre les activitats residuals de les variants mutades i el fenotip associat a cadascuna d'elles.Finalment, es van dur a terme una sèrie d'experiments per entendre el mecanisme que regula el procés d'splicing alternatiu del gen GLB1. Aquest gen codifica dues proteïnes diferents (la beta-galactosidasa i l'EBP) gràcies a un mecanisme d'splicing alternatiu. Al transcrit de l'EBP, els exons 3, 4 i 6 són exclosos del transcrit madur. Diferents experiments van mostrar que el mecanisme d'NMD ("Nonsense-mediated decay") s'encarrega d'eliminar les combinacions d'exons errònies, fent que únicament els dos transcrits funcionals romanguin estables a la cèl.lula. Paral.lelament, mitjançant la cotransfecció de plasmidis que codificaven diferents proteïnes SR junt amb un minigèn construït amb els exons implicats en l'splicing alternatiu del gen GLB1, es va poder comprovar que les proteïnes SR tenien la capacitat de modificar la proporció en que es generaven les diferents combinacions d'exons en els transcrits obtinguts a partir del minigèn. Això indicaria que les proteïnes SR, que juguen un paper essencial en el procés d'splicing cel.lular, podrien tenir també una funció en la regulació de l'splicing alternatiu del gen GLB1.

Les mutacions germinals en el gen APC són les responsables de la majoria de casos de poliposi adenomatosa familiar. APC participa en diferents processos cel·lulars que inclouen la regulació del cicle cel·lular, l'apoptosi, l'adhesió cel·lular, la migració cel·lular, la transducció de senyals, l'acoblament de microtúbuls i la segregació dels cromosomes. Encara que tots aquests processos estan potencialment lligats amb el càncer, sembla que la funció supressora tumoral del gen resideix en la seva capacitat per regular de manera acurada els nivells intracel·lulars de la β-catenina, component central de la via de Wnt. Aquesta via és important en el desenvolupament embrionari per determinar llinatges cel·lulars específics i en l'homeòstasi cel·lular de determinats teixits com la mucosa intestinal. A part del seu paper clau en la via de Wnt, APC participa en la inestabilitat cromosòmica del càncer colorectal, encara que els mecanismes concrets a través dels quals actua són encara desconeguts en bona part. Els resultats descrits en els tres capítols d'aquesta tesi donen lloc al concepte global que és en les lesions benignes del còlon, els adenomes, ja siguin de pacients de FAP com de càncer colorectal esporàdic, on s'acumulen gran nombre d'alteracions genètiques que afecten a mecanismes molt diversos del funcionament cel·lular, essent especialment importants aquelles alteracions que afecten a la via de Wnt. Totes les alteracions detectades permeten la progressió tumoral ja que afecten a la proliferació, mitosi i moltes altres funcions importants per la cèl·lula. El coneixement de les alteracions moleculars que afecten als adenomes és important per proporcionar més evidències dels mecanismes moleculars i cel·lulars implicats en els primers estadis de la progressió tumoral i donar lloc a noves estratègies de diagnòstic precoç i teràpies preventives, tan importants en la lluita contra el càncer. / Classical Familial Adenomatous Polyposis (FAP) syndrome is caused by APC germline mutations. APC plays important roles in different cellular processes such as cell cycle regulation, apoptosis, cellular adhesion, cellular migration, signal transduction, microtubule binding and chromosome segregation. Although all these processes are potentially related to cancer, it seems that the main tumoral suppressor activity is mediated by its capacity to accurately regulate the β-catenin intracellular levels, which is a central member of the Wnt signalling pathway. This pathway is important in the embryonic development and in cellular homeostasis in certain tissues such as intestinal mucosa. In colorectal cancer, APC is not only believed to be playing a key role in Wnt signalling, but also it is important in chromosomal instability (CIN), although the mechanisms in which APC is participating are still largely unknown.The results presented in this thesis and divided in 3 chapters give us the general idea that in the benign lesions of the colon, called adenomas, in FAP and in sporadic colorectal cancer patients, is where a great number of genetic alterations are accumulated affecting different functional mechanisms in the cell. Those aberrations that alter the Wnt signalling pathway are especially important in the process of tumorigenesis. All the reported alterations enable the tumoral progression because they target proliferation, mitosis and other important functions of the cell. A better understanding of the molecular defects in adenomas is crucial to discover all the molecular and cellular mechanisms operating in the early stages of colorectal cancer and give clues for early diagnosis and prevention.

Esta tesis es una contribución al conocimiento del síndrome de Maroteux-Lamy en el terreno de la genética molecular. El síndrome de Maroteaux-Lamy o mucopolisacaridosis de tipo VI (MPS VI) es una grave enfermedad hereditaria muy poco frecuente en humanos, provocada por la deficiencia de un único gen, que codifica la hidrolasa lisosómica N-acetilgalactosamino-4-sulfatasa o arilsulfatasa B (ARSB). La primera publicación incluída en la tesis engloba los resultados del análisis de las mutaciones encontradas en el gen ARSB de pacientes españoles y argentinos con MPS VI. Se han identificado todos los alelos responsables de la enfermedad, de los cuales 9 no habían sido publicados anteriormente. Mediante estudios de RT-PCR se han obtenido evidencias de que algunas de las mutaciones podían provocar la destrucción del correspondiente transcrito mutado mediante el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay . El estudio también ofrece datos relativos a la clínica de los pacientes analizados, incluyendo la edad de diagnóstico, los principales síntomas fenotípicos y la concentración de glicosaminoglicanos totales excretados en orina, que constituyen datos importantes a la hora de intentar establecer relaciones genotipo-fenotipo. Cumpliendo con otro de los objetivos de la tesis, se realizó el análisis haplotípico de cuatro mutaciones comunes identificadas en pacientes españoles y argentinos con MPS VI y se apuntó a un posible origen único para dichos cambios. La segunda publicación presenta los estudios de expresión y caracterización bioquímica de la mayor parte de las proteínas mutadas que no habían sido descritas con anterioridad por otros autores. Por primera vez en la bibliografía, se explicitó que el cDNA mutado se había expresado en el mismo contexto haplotípico que en el paciente en relación con los dos cambios exónicos presentes en las bases de datos de SNPs, p.V358M y p.S384N. Ambas variantes se expresaron también de forma individual, siendo de especial interés los resultados obtenidos para el cambio p.S384N, que tradicionalmente se ha considerado como mutación patogénica sin que se hayan realizado estudios de expresión. El análisis bioquímico de la actividad enzimática in vitro de las proteínas mutadas se completó mediante análisis de western blot. También se realizaron estudios de inmunofluorescencia indirecta para valorar el grado de localización de la proteína ARSB mutada en los lisosomas de fibroblastos de pacientes. Finalmente se realizaron estudios a nivel de RNA para las mutaciones que introducen codones de parada prematuros en la secuencia codificante (sin sentido, de splicing). Mediante el tratamiento de cultivos de fibroblastos de pacientes con el inhibidor de la síntesis proteica cicloheximida, se puso de manifiesto que el mecanismo de nonsense-mediated RNA decay era responsable de la degradación de los transcritos portadores de cuatro de las mutaciones. El trabajo que ocupa el tercer artículo es una aproximación a una forma de terapia complementaria a la de sustitución enzimática ya establecida para los pacientes de MPS VI, que se podría aplicar a los pacientes portadores de mutaciones sin sentido. Se trata del primer intento en esta enfermedad de intentar suprimir los codones de terminación prematura mediante el uso de antibióticos aminoglicósidos. Los ensayos se realizaron tanto en células transfectadas como en una línea de fibroblastos humanos. Las mutaciones escogidas permitieron ensayar la influencia del contexto nucleotídico del codón de parada en la determinación de la eficacia de la supresión de terminación. Las células se incubaron en presencia de gentamicina y se compararon los niveles de mRNA y de actividad enzimática con los obtenidos en células sin tratar. Los resultados evidenciaron que, en líneas generales, el tratamiento con gentamicina para la supresión de codones sin sentido incrementa, aunque poco, la capacidad catalítica de la ARSB, y que la eficacia del proceso parece depender del contexto nucleotídico. / Maroteaux-Lamy syndrome or mucopolysaccharidosis type VI (MPS VI) is a rare lysosomal, autosomal recessive storage disorder caused by a deficiency of the lysosomal enzyme N-acetylgalactosamine 4-sulfatase or arylsulfatase B (ARSB). The first aim of the thesis was to analyze the spectrum of mutations responsible for the disorder in Spanish and Argentinian MPS VI patients. We identified all the ARSB mutant alleles, nine of them novel. Clinical data of Spanish and Argentinian patients was also provided. Haplotype analysis indicated a common origin for most of the mutations found more than once. It was very difficult to stablish genotype-phenotype correlations. RT-PCR studies showed that some of these alleles could be responsible of the degradation of the ARSB mRNA transcripts by the mechanism of nonsense-mediated RNA decay.In the second study, functional characterization of seven missense mutations and polyporphisms found in the ARSB gene was presented. All the ARSB mutations studied had a significant effect on enzyme activity. Mutations were expressed on COS-7 cells in their original haplotype context with respect two non-synonymous SNPs, p.V358M and p.S384N. Our results showed that change p.S384N, formerly described as a pathogenic mutation, should be considered a functional polymorphism. Western blot analyses showed that the expressed mutations significantly reduced the amount of mature protein. Sub-cellular localization studies of ARSB proteins in fibroblasts from MPS VI patients were performed. RNA analysis confirmed that nonsense-mediated RNA decay had taken place for all mutant alleles which were candidates for causing RNA degradation by this mechanism.Finally, we reported the preliminary in vitro assays for restoring some amount of full-length and active ARSB protein, by means of gentamicin-induced translational read-through of premature stop codon mutations on different termination contexts. Gentamicin treatment on transfected COS-7 cells and fibroblasts from a MPS VI patient showed a slight recovery of ARSB activity and cDNA levels.

Este trabajo se centra en el estudio de la implicación de los genes MAPT y PGRN en la degeneración lobar frontotemporal (DLFT). Se describen 2 nuevas mutaciones en estos genes (P301T en el gen MAPT y la A303AfsX57 en el gen PGRN) y no se encontraron variaciones en el número de copias del gen MAPT en las muestras estudiadas, apoyando que la existencia de alteraciones en la dosis génica de MAPT no seria una causa de DLFT. El mecanismo patogénico de la mutación P301T es potencialmente múltiple e incluye la reducción de la capacidad de promover el ensamblaje entre tau y los microtúbulos, la estimulación del ensamblaje de filamentos anómalos de tau y la creación de un nuevo sitio de fosforilación en la proteína tau. El mecanismo patogénico de la mutación A303AfsX57 es la haploinsuficiencia. Respeto al fenotipo clínico los pacientes con mutaciones en el gen MAPT presentan una historia familiar con patrón autosómico dominante de inicio precoz, siendo el diagnóstico clínico más frecuente el de demencia frontotemporal, si bien en ocasiones pueden presentar sintomatología similar a la degeneración corticobasal o la parálisis supranuclerar progresiva. El examen neuropatológico muestra una DLFT con presencia de depósitos de filamentos de proteína tau hiperfosforilada. Los pacientes con mutaciones en el gen PGRN suelen presentar una edad de inicio más tardía que los pacientes con mutaciones en el gen MAPT. El fenotipo clínico de estos pacientes suele ser también similar a la demencia frontotemporal, si bien la importante alteración del lenguaje puede conducir a un diagnóstico de afasia progresiva no fluente. El examen neuropatológico muestra una DLFT con inclusiones ubiquitin positivas (DLFT-U) con presencia de inclusiones neuronales intranucleares. Estas inclusiones, sin embargo no son patognomónicas de la presencia de mutaciones en PGRN. La proteína depositada en las inclusiones neuronales ubiquitinadas presentes en los pacientes con mutaciones en PGRN es la TDP-43. Por otro lado se describe que la frecuencia del genotipo H1/H1 de MAPT en pacientes con DLFT no es significativamente diferente de la frecuencia en controles sanos en nuestro estudio. Tampoco encontramos diferencias en la ratio cerebral 4R/3R de RNAm de MAPT en pacientes con DLFT. Estos hallazgos sugieren que los eventos post-traduccionales podrían ser el principal factor que causa el depósito de isoformas específicas de tau en algunas taupatías, como algunos subtipos de la DLFT. Sin embargo, el incremento de la ratio 4R/3R de RNAm de MAPT en los portadores del genotipo H1/H1 sugiere que esta alteración podría ser el mecanismo a través del cual este genotipo incrementa el riesgo para desarrollar una taupatía. Finalmente se realizó un estudio de correlación clínico-genético-patológica en 32 casos con DLFT confirmada patológicamente. En este estudio se hallaron un amplio espectro de entidades clínicas y neuropatológicas, si bien se pudo establecer alguna asociación clínico-genética-patológica: el sustrato patológico de la demencia frontotemporal es impredecible, las mutaciones en el gen MAPT y los fenotipos clínicos de afasia progresiva no fluente y degeneración corticobasal se asocia a DLFT tau-positiva, mientras que la presencia de signos de motoneurona, la demencia semántica o las mutaciones en PGRN se asocian a DLFT-U. / In this work we describe two new mutations. The first is a mutation (P301T) in the MAPT gene in a patient with familial frontotemporal dementia and parkinsonism, and a pattern of autosomal dominant inheritance. The fact that this new mutation is located in the same codon that other missense mutations (P301L and P301S) associated with tau pathology, highlights the importance of this site for the physiological function of tau protein. The second is a mutation in the PGRN gene (A303AfsX57) associated with late-onset frontotemporal dementia and with "cat's eye" shaped intranuclear and cytoplasmatic ubiquitin immunoreactive inclusions in the neuropathological exam. The A303AfsX57 mutation is consistent with a nucleotide deletion in exon 8 (c908delC). This deletion causes a frameshift at codon 303 that introduces a premature termination codon (A303AfsX57). Furthermore we determine that MAPT gene copy number variation is not involved in 70 patients with clinical diagnosis of FTLD.On the other hand we evaluated the 4R/3R tau mRNA ratio in 18 patients with frontotemporal lobar degeneration (FTLD), and the effect of the H1/H1 genotype on this ratio. The 4R/3R mRNA ratio in frontal cortex was similar in FTLD patients and controls. The H1/H1 genotype carriers showed a significant increase in 4R/3R mRNA ratio, suggesting that this genotype could modulate the tau mRNA splicing.Finally we performed a clinicopathological correlation and genetic analysis in 32 consecutive patients with neuropathological diagnosis of FTLD or CBD. According to previous studies, we described a broad spectrum of clinical and pathological features in these patients. However, we found certain degree of association of some clinical subtypes to specific pathological substrates: pathology underlying sporadic FTD is heterogeneous and not predictable. MAPT mutations and clinical diagnosis of PNFA and CBD were associated to tau-positive pathology. The presence of signs of lower MND and SD correlated with FTLD-U.