No sabem quin nom serà emprat en la posteritat per a caracteritzar la nostra era però amb tota seguretat se la podria nomenar l'Era química, tal és el nombre de molècules sintetitzades per l'home que impregnen l'ambient que ens envolta en la nostra vida diària. Per això el nostre concepte de civilització moderna és inconcebible sense un entorn químic superimpost a l'entorn natural. Si la vida humana és millor gràcies a les nostres creacions químiques, o bé serà destruïda per elles, avui més que mai és una qüestió sense resposta (E. Pellegrino, 1976). Amb aquestes declaracions de Pellegrino, es posa de relleu que el propi home és capaç de provocar, a vegades inconscientment, canvis importants en el Medi Am bient, que alteren les repercussions que podríem conside rar "naturals"i els beneficis perseguits es converteixen moltes vegades en perjudicis. Entre ells, l'anomenada "contaminació ambiental" és la causa de trastorns sobre la nostra salut i origen de noves malalties. En aquesta Tesi s'estudien els efectes sobre l'organisme humà d'alguns d'aquestos agents contaminants, els nomenats electrofílics, que es troben abundantment repartits a l'atmosfera de les àrees industrials i urbanes, en molts ambients laborals, i sobre tot al fum del tabac. Aquestos compostos electrofílics són capaços, una vegada ingressats al nostre organisme, de formar enllaços covalents amb les cèl·lules i provocar en elles lesions irreversibles com a mutagènesi i carcinogènesi. Per agreujar més la situació, l'home disposa de sistemes enzimàtics capaços d'augmentar la toxicitat d'alguna d'aquestes substàncies, o inclus de convertir en tòxiques algunes que d'antuvi no ho eren.Sortosament el nostre organisme compta amb diferents mètodes de defensa contra aquestes agressions, entre els que s'hi troben els sistemes de metabolització que permeten eliminar aquestes substàncies el més ràpidament possible. Els compostos electrofílies segueixen majoritàriament la via metabòlica de la conjugació amb el glutation (GSH), mitjançant l'acció de les Glutation S-Transferasa (GST), la qual cosa priva la toxicitat d'aquests agents i facilita la seva excreció. Així doncs, aquest sistema Glutation-Glutation S-Transferasa té un paper clarament detoxificador i pro tector davant d'aquests compostos. El producte final d'aquesta conjugació és un tioèter inactiu, que s'elimina fàcilment per l'orina. Els tioèters seran, per tant, un reflex del grau d'exposició de l'organisme als compostos electrofílics però, a més, ens permetran diferenciar, a igualtat d'ex posició, la millor o pitjor capacitat de detoxificació de cada individu. De tot això es dedueix que, per a valorar la importància d'un contaminant, no és suficient quantificar la seva concentració ambiental, que és el que podríem nomenar "grau de contaminació externa", sinó que s'han de tenir en compte també les interaccions amb els sistemes biològics (metabolització) que poden modificar el compost inicial. D'aquestes interaccions s'obté el que coneixem com a "grau de contaminació interna" o real, que serà molt variable per a cada individu, i no necessàriament coincidirà amb la contaminació externa. Es per tot això que adquireixen tant de valor els no menats indicadors biològics, com a expressió molt fiable de la nomenada Exposició Interna. Els tioèters urinaris han de considerar-se com a indicadors biològics i incluir-se en els plans de monitorització de Salut Pública, com de fet ja passa a d'altres països. En primer lloc, caldrà una coordinació de les funcions de tots els professionals, com són: químics, fisiòlegs, farmacèutics, farmacòlegs, etc., sobrepassant inclus els límits de competències tradicionalment impostes. Existeixen diferents nivells d'actuació i distintes tasques per a tots, i només petits conflictes territorials i jurisdiccionals poden entorpir la bona coordinació d'aquests especialistes en el gran paper que els té reservat la Salut Pública. El farmacòleg, a part de la funció clàssica de descobrir i desenvolupar nous productes, ha de tenir també un paper preponderant en el control d'agents químics em prats en la ramaderia, agricultura i indústria. Ha de dependre d'ells també l'ensenyar i portar a terme treballs d'investigació bàsica, que permetin després, establir sistemes de vigilància i informació, a fi de què la utilització dels agents químics sigui racional. Per tant, allà on existeixi un problema d'interacció d'agents químics amb la vida, la presència del farmacòleg es fa indispensable i adquireix una gran significació social. (E. Pellegrino, 1976).

Amb l'objectiu d'identificar gens potencialment involucrats en la fisiopatologia de la diabetis mellitus de tipus 2 i l'obesitat es va realitzar al nostre laboratori un experiment d'hibridació sostractiva amb músculs de rates Zucker ZDF obeses i diabètiques i rates. Un dels gens identificats en aquest estudi no havia estat descrit anteriorment; se'l va anomenar DOR, de l'anglès "Diabetes and Obesity Regulated gene". La manca absoluta d'informació prèvia a la literatura sobre DOR fa que la finalitat general d'aquesta tesi sigui identificar i caracteritzar la seva funció a nivell cel·lular. Per aquest motiu primerament es va analitzar la seqüència de la proteïna en busca de senyals o dominis que poguessin aportar informació sobre la seva funció. Diversos indicis indicaven que DOR podia ser una proteïna implicada en la regulació de la transcripció. Concretament, la presència d'una putativa caixa LxxLL, típica de coactivadors de receptors nuclears, indicaven que DOR podia ser un coactivador. Experiments amb vectors reporter van confirmar que la proteïna DOR exerceix de coactivador dels receptors nuclears TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. Posteriorment es va realitzar una fusió de la proteïna DOR amb el domini d'unió a DNA del factor de transcripció de llevat Gal4 (Gal4 DBD). D'aquesta manera es va demostrar que DOR té un domini d'activació de la transcripció, ja que aquesta proteïna de fusió és capaç d'activar l'expressió d'un reporter de Gal4. A més, través de fusions amb el Gal4 DBD de fragments de la proteïna DOR, es va poder mapar en quina regió de la proteïna es localitza aquest domini d'activació de la transcripció. La cerca a bases de dades va detectar diverses proteïnes de diferents espècies amb homologia amb DOR, que podien ser, per tant, ortòlegs de la proteïna. La fusió d'aquests possibles ortòlegs amb el Gal4 DBD també era capaç d'activar l'expressió del reporter de Gal4. En cèl·lules C2C12 en que s'havia reduït l'expressió de DOR per l'acció d'un siRNA específic, la capacitat dels receptors nuclears TRα i PPARγ d'activar l'expressió dels seus reporters es veia disminuïda, cosa que indica que la presència de DOR és important per a l'acció d'aquests receptors nuclears. Tot i contenir una putativa caixa LxxLL vam poder comprovar que aquesta no és el principal domini d'interacció de DOR amb els receptors nuclears, ja que la mutació de la caixa no aboleix la capacitat de DOR de coactivar aquests receptors. La caixa, en canvi, és important per al domini d'activació de la transcripció de DOR, ja que la versió mutada de la proteïna és menys potent a l'hora de coactivar els diferents receptors nuclears. Vam analitzar també la localització intracel·lular de la proteïna. Mitjançant estudis amb proteïnes de fusió de DOR amb la proteïna fluorescent GFP, així com amb estudis d'immunolocalització, vam poder comprovar que DOR es localitza al nucli, cosa que és coherent amb la seva funció com a coactivador. Tot i això en determinades condicions DOR es pot localitzar al citosol. En aquest sentit vam poder determinar a DOR les regions responsables de la seva localització nuclear i de la sortida del nucli de la proteïna que té lloc en determinades condicions. Per últim vam analitzar el paper de possibles modificacions post-traduccionals en l'activitat i la localització de DOR. A través de la mutació de llocs putatius de fosforilació per diferents cinases vam deduir que tant l'activitat com la vida mitja de DOR es veu afectada per fosforilacions per aquestes cinases. A més vam comprovar que DOR també es regula per modificacions en lisines, ja que la mutació de lisines de la proteïna també afecta a la seva localització i a la seva vida mitja. / To initially identify genes responsible for the alterations associated to diabetes, we screened genes differentially expressed in Zucker diabetic (ZDF) rats and non-diabetic lean rats by PCR-select cDNA subtraction. One of the genes differentially expressed had not been described before. We named it DOR for "Diabetes and Obesity Regulated gene". The study of the protein sequence suggested that DOR could be a nuclear protein that may participate in transcriptional regulation. To assess whether DRCoA regulates nuclear hormone receptor activity we performed reporter vector assays with several nuclear receptors. Our results confirmed that DOR is able to coactivate the nuclear receptors TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. We also constructed a fusion protein of DOR with the DNA binding domain of the yeast transcription factor Gal4 (Gal4 DBD). This allowed us to demonstrate that DOR has a transcription activation domain, as this fusion protein is able to activate the expression of a reporter vector for Gal4. The fusion of several fragments of the protein with the Gal4 DBD served us to delimitate the region of DOR responsible for the activation of the transcription. We also analyzed the cellular distribution of the protein. As could be expected, DOR localizes to the nucleus of the cells, although in certain conditions is localized in the cytoplasm. We determined the regions of the protein responsible for this nuclear localization, as well as the signals responsible for the exit of the protein to the cytoplasm in certain conditions. Lastly we analyzed the role of post-translational modifications in the activity, stability and localization of the protein.