La glicogen sintasa (GS) és un enzim cabdal en el metabolisme de carbohidrats, catalitzant l’addició d’un residu glicosil a l’extrem no reductor d’una cadena de glicogen preexistent. Les GSs eucariotes són enzims altament regulats, tant per al•losterisme com per fosforilació. Gràcies a diferents estructures de GSs resoltes en els darrers anys ja es té una idea aproximada el mecanisme enzimàtic de la reacció, així com els llocs d’unió de la molècula donadora del grup glicosil UDP-glucosa. Tot i que experimentalment es coneix la gran afinitat entre la GS i el glicogen, l’acceptor en la reacció catalítica, se sap poc de la interacció d’ambdós. En el nostre laboratori es va identificar un lloc d’unió a carbohidrats a la superfície de la GS de l’arqueó Pyrococcus abyssi (PaGS) gràcies a la resolució de l’estructura cristal•logràfica d’aquest enzim unit a una molècula de maltohexaosa. En aquesta tesi es demostra que aquest lloc d’unió a carbohidrats de PaGS es tracta d’un lloc d’unió a glicogen funcional ja que, quan el modifiquem per mutagènesi, l’enzim perd la seva capacitat d’unió al glicogen. Aquesta pèrdua d’afinitat té un impacte directe sobre l’eficiència catalítica de PaGS a l’hora d’utilitzar glicogen com a substrat. Per alineament de seqüències deduïm una possible conservació d’aquest lloc d’unió en la glicogen sintasa muscular humana (HMGS). La mutació d’aquest domini de la HMGS resulta en una disminució de l’afinitat per glicogen de l’enzim, un canvi en la seva localització subcel•lular i un clar impacte en la capacitat de l’enzim per acumular glicogen in vivo. D’aquesta manera identifiquem fins a cinc residus aminoacídics, tots allunyats del centre actiu, la mutació dels quals disminueix l’afinitat de l’enzim pel glicogen i que formarien, per tant, part d’un nou lloc d’unió a glicogen no catalític en la HMGS, que es mostra com un element regulador crític responsable de l’eficiència catalítica de l’enzim in vivo. Una vegada establerta la importància del domini d’unió a glicogen en HMGS, mesurem l’afinitat de la isoforma hepàtica de la glicogen sintasa humana (HLGS) pel glicogen. Tot i que ambdues isoformes de la GS humana tenen una alta identitat en la seva seqüència d’aminoàcids, els resultats mostren que HLGS té una menor afinitat pel glicogen. No hem pogut identificar els residus responsables d’aquest canvi d’afinitat. Al nostre laboratori es va descriure per primera vegada com la HMGS transloca al nucli cel•lular quan exhaureix els seus reservoris de glicogen. Els mutants de HMGS que no s’uneixen al glicogen també transloquen al nucli cel•lular, confirmant el glicogen com a únic factor de retenció citoplasmàtic de HMGS. Finalment, en aquesta tesi també s’intenta deduir si la localització nuclear de HMGS té algun paper biològic. Hem aconseguit identificar tres proteïnes que col•localitzen al nucli cel•lular amb HMGS, i que tenen en comú la seva capacitat d’unió a ARN. Hem observat com la incubació amb l’inhibidor de la transcripción actinomicina D de cèl•lules amb HMGS nuclear fa que l’enzim transloqui a la perifèria nucleolar, comportament descrit per moltes altres proteïnes que uneixen ARN. Finalment, un assaig in vitro d’unió entre HMGS i ARN apunta a la possible interacció entre ambdós. Totes aquestes evidències recolzen una possible funció nuclear per a la HMGS. / Thesis title: “Determinants of glycogen binding and translocation of glycogen synthase”. Author: Carlos Martínez Pons. ABSTRACT Glycogen is a glucose polymer synthesized by the cell to store large amounts of glucose and is subsequently mobilized when energy demand increases. The importance of glycogen is reflected in its conservation among archaea, bacteria and eukarya. The glycogen granule is considered as a finely regulated organelle, with most of its proteins locating at the granule thanks to a direct interaction with glycogen through a carbohydrate-binding site. But it still remains unclear if these sites have other implications on protein regulation and catalytic performance. In this thesis we structurally identify a functional non-catalytic glycogenbinding site on a key enzyme of glycogen metabolism. When we mutate this carbohydrate-binding site we observe an alteration of the subcellular distribution of the enzyme and, moreover, a dramatic decrease of its catalytic performance, showing that the glycogen-binding site is not only used to remain bound at the glycogen granule, but that it is necessary for the proper functioning of the enzyme.

En l'entramat metabòlic cel·lular, milers de substrats estan interconnectats mitjançant reaccions bioquímiques. Tot i que aquest alt grau d'interrelació podria conduir al flux de substrats en múltiples direccions simultàniament, a la pràctica els fluxos metabòlics passen a través de rutes específiques. Els nostres estudis evolutius sobre el metabolisme del glicogen mostren que els isoenzims que catalitzen les diverses etapes d'aquesta ruta contribueixen a definir i a aïllar els mòduls funcionals, un punt clau per entendre la organització metabòlica en els vertebrats. Aquests isoenzims específics de teixit sorgeixen per duplicació gènica a l'origen dels vertebrats i que les seves propietats bioquímiques co-evolucionen per adaptar-se a les necessitats metabòliques específiques dels teixits on s'expressen. La retroinhibició de les hexoquinases d'alta afinitat o l'activació al·lostèrica de les glicogen sintases, ambdós efectes mediats per la glucosa-6-fosfat, són clars exemples de que les característiques cinètiques dels isoenzims es modulen al llarg de l'evolució dels vertebrats per satisfer les diferents funcions del metabolisme del glicogen. A més, els nostres resultats ajuden a entendre la única situació descrita on, paradoxalment, els isoenzims del metabolisme del glicogen majoritaris en cervell, múscul i fetge es barregen i es co-expressen en el mateix teixit: el fetge embrionari de mamífer. Els resultats presentats en aquesta memòria indiquen que la síntesi de glicogen en el fetge embrionari, essencial per assegurar la supervivència del nounat, requereix la re-organització de l'expressió dels isoenzims que hi participen, a fi d'estabilitzar el contingut de glicogen embrionari en front de les variables condicions fisiològiques maternes.Estudis previs indicaven que els ratolins defectius per la isoforma muscular de la glicogen sintasa mostren greus defectes en el desenvolupament cardíac. Per aprofundir en les bases moleculars d'aquesta alteració, hem caracteritzat la translocació nucleo-citoplàsmica de la glicogen sintasa muscular humana i hem analitzat la seva funció en el nucli. Els nostres resultats mostren com aquest enzim transloca vers al nucli i forma agregats nuclears quan es deplecionen les reserves de glicogen de la cèl·lula. A més, els resultats obtinguts amb els mutants de deleció de l'enzim indiquen que el domini implicat en l'activació al·lostèrica de l'enzim per G6P, la regió rica en arginines, és crucial per a la seva acumulació nuclear. En conjunt, aquestes observacions suggereixen que, a part de la funció metabòlica, la glicogen sintasa podria participar en processos nuclears on es requerís un sensor de l'estat energètic de la cèl·lula. / In the metabolic network of the cell, hundreds of substrates are interconnected through biochemical reactions. Although such interconnection could lead to the simultaneous flow of substrates in numerous directions, in practice metabolic fluxes pass through specific pathways. Our metabolic and evolutionary studies on glycogen metabolism showed that isoenzymes contribute to define and isolate separate functional modules, a key issue to understand metabolic organisation in vertebrates. These tissue-specific isoenzymes are generated by gene duplication at the dawn of vertebrates and their biochemical properties co-evolved to suit specific metabolic roles of the tissues where they are expressed. The retro inhibition of high-affinity hexokinases, or glycogen synthase allosteric activation, both effects mediated by G6P, are clear examples of kinetic features that are modulated through vertebrate evolution to satisfy different roles of glycogen metabolism. Furthermore, our results help to understand the only reported situation where, paradoxally, isoenzymes of glycogen metabolism enzymes from liver, muscle and brain are merged and co-expressed in the same tissue: the mammalian embryonic liver. Our results indicate that embryonic glycogen synthesis in liver, essential for newborn survival, requires the re-design of isoenzyme distribution in order to buffer the embryonic glycogen content in front of changing maternal metabolic conditions. In addition, it has been described that muscle glycogen synthase isoenzyme (MGS) knockout mice show severe developmental heart defects. In order to adress the molecular basis of this growth alteration, we characterised the nucleo-cytoplasmic translocation of MGS and analyzed its nuclear function. We showed that this enzyme translocate into the nucleus and form nuclear aggregates when cells are depleted of glucose and glycogen deposits. Moreover, the results that we obtained with the deletion mutants indicate that the domain involved in the allosteric activation of the enzyme by G6P, the arginine-rich cluster, is crucial for its nuclear acumulation. Taken together, these observations suggest that, in addition to its metabolic function, MGS may participate in nuclear processes which would require a sensor of the cellular enregy state.

A doença de armazenamento do glicogênio tipo I (GSDI) é uma doença genética autossômica recessiva caracterizada por hipoglicemia, hiperlactatemia, hiperlipidemia e hiperuricemia. Na GSDIa, ocorre a deficiência da glicose-6-fosfatase (G6Pase) e na GSDIb a deficiência de uma translocase G6P-especifica (G6PT). Ambas apresentam manifestações clínicas semelhantes, porém na GSDIb há alterações dos neutrófilos e o aparecimento de doença inflamatória intestinal. O tratamento é essencialmente dietético, sendo preconizado o uso de amido de milho cru a cada 4 horas. Em lactentes, é utilizada dieta contínua noturna por sonda nasogástrica. Além disso, os pacientes devem fazer a exclusão de lactose, sacarose e frutose da dieta. Na ausência de tratamento, os pacientes apresentam baixa estatura, adenomas hepáticos, hiperfiltração glomerular e risco de morte por hipoglicemia grave. Suplementação vitamínica e de minerais, uso de inibidores da enzima conversora da angiotensia (IECA), alopurinol e citrato de potássio são utilizados de forma individualizada, dependendo das manifestações clínicas apresentadas. Objetivos: Caracterizar os aspectos clínicos, laboratoriais e antropométricos de uma amostra de pacientes brasileiros com GSDI, acompanhados em um serviço de referência para Erros Inatos do Metabolismo. Métodos: Estudo de série de casos de base ambulatorial, com amostragem por conveniência. Foram avaliados dados sobre o método de diagnóstico empregado: clínico, anatomopatológico, dosagem de glicose-6-fosfatase hepática e/ou análise molecular. Além disso, foram coletados dados atuais sobre o tratamento, realizada avaliação antropométrica e avaliados exames laboratoriais e de imagem recentes. Resultados: Vinte e um pacientes foram incluídos; destes, 17 tinham GSDIa e 4 GSDIb, com uma mediana de idade de 10 anos (variou 1-25 anos). Todos os pacientes estavam fazendo tratamento com amido de milho cru com intervalos regulares. A mediana de idade do diagnóstico foi de sete meses ( variou de 1-132 meses), sendo que 19/21 realizaram biópsia hepática para confirmação diagnóstica. Na avaliação antropométrica, o excesso de peso estava presente na maioria dos pacientes (16/21). A baixa estatura foi observada em 4/21 pacientes. Houve correlação entre os escores Z de estatura e de IMC apresentados pelos pacientes (r=0,561; p=0,008). Hepatomegalia e nódulos hepáticos estavam presentes, respectivamente, em 9/14 e 3/14 pacientes. Conclusão: O diagnóstico de GSDI foi tardio em nossa população, visto que os sintomas podem estar presentes desde o nascimento ou nos primeiros meses de vida. Também podemos observar que a maioria dos pacientes foi submetida à biopsia hepática para confirmação do diagnóstico. O quadro clínico característico associado à análise molecular continua sendo um critério seguro e pouco invasivo para o diagnóstico. Outro aspecto importante diz respeito ao tratamento. O uso de grande quantidade de amido de milho tem como efeito colateral o excesso de peso. Contudo, o excesso de peso parece estar associado a um aumento do ganho estatural. / Glycogen storage disease type I (GSDI) is an autosomal recessive genetic disease characterized by hypoglycemia, hyperlactatemia, hyperlipidemia, and hyperuricemia. If left untreated, patients may develop short stature, hepatocellular adenomas, glomerular hyperfiltration, and life-threatening hypoglycemia. In GDIa there is deficiency of glucose-6-phosphatase (G6Pase), and GSDIb is caused by a defect in G6P translocase (or G6PT). In GSD type Ib, the clinical presentation is quite similar to that of GSDIa, but may occur neutropenia with recurrent infections and an increased incidence of inflammatory bowel disease. Management of GSDI is essentially dietary, using uncooked cornstarch at regular four hours intervals. In infants frequent meals and continuous nocturnal infusion through a nasogastric or gastrostomy tube are recommended. Besides that, fructose, sucrose, and lactose intake must be excluded. Vitamin and minerals supplementation, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, alopurinol and potassium citrate can be used, as well, depending patients`clinical conditions. Objectives: To characterize the clinical, laboratory, and anthropometric profile of a sample of Brazilian patients with GSDI cared at an outpatient referral clinic for inborn errors of metabolism. Methods: This was a cross-sectional outpatient study based on a convenience sampling strategy. Data on diagnosis methods used (clinical, histopathological, Glucose-6-phosphatase in liver and molecular analysis) were accessed. Besides that, data about treatment conducted, anthropometric parameters, and laboratory and image tests follow-up were analysed. Results: Twenty-one patients were included in this study. Seventeen were diagnosed as GSDIa and four GSDIb, with median age of 10 years (range 1–25 years). All were taking uncooked cornstarch therapy. Median age at diagnosis was seven months (range, 1–132 months), and 19 patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation. On anthropometric evaluation, overweight was present in 16/21 patients (n =). Short stature was observed in 4/21 patients. A correlation was found between height-for-age and BMI-for-age z scores (r=0.561; p=0.008). Hepatomegaly, and liver nodules were present 9 /14, and 3 / 14 patients respectively. Conclusions: Diagnosis of GSDI was delayed in our sample, since symptoms can be found on the early months of life. Most patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation, even though the combination of a characteristic clinical presentation and molecular methods can provide a less invasive but definitive diagnosis. Another important is that obesity is a side effect of cornstarch therapy. However it appears to be positively associated with growth in these patients.

A doença de armazenamento do glicogênio tipo I (GSDI) é uma doença genética autossômica recessiva caracterizada por hipoglicemia, hiperlactatemia, hiperlipidemia e hiperuricemia. Na GSDIa, ocorre a deficiência da glicose-6-fosfatase (G6Pase) e na GSDIb a deficiência de uma translocase G6P-especifica (G6PT). Ambas apresentam manifestações clínicas semelhantes, porém na GSDIb há alterações dos neutrófilos e o aparecimento de doença inflamatória intestinal. O tratamento é essencialmente dietético, sendo preconizado o uso de amido de milho cru a cada 4 horas. Em lactentes, é utilizada dieta contínua noturna por sonda nasogástrica. Além disso, os pacientes devem fazer a exclusão de lactose, sacarose e frutose da dieta. Na ausência de tratamento, os pacientes apresentam baixa estatura, adenomas hepáticos, hiperfiltração glomerular e risco de morte por hipoglicemia grave. Suplementação vitamínica e de minerais, uso de inibidores da enzima conversora da angiotensia (IECA), alopurinol e citrato de potássio são utilizados de forma individualizada, dependendo das manifestações clínicas apresentadas. Objetivos: Caracterizar os aspectos clínicos, laboratoriais e antropométricos de uma amostra de pacientes brasileiros com GSDI, acompanhados em um serviço de referência para Erros Inatos do Metabolismo. Métodos: Estudo de série de casos de base ambulatorial, com amostragem por conveniência. Foram avaliados dados sobre o método de diagnóstico empregado: clínico, anatomopatológico, dosagem de glicose-6-fosfatase hepática e/ou análise molecular. Além disso, foram coletados dados atuais sobre o tratamento, realizada avaliação antropométrica e avaliados exames laboratoriais e de imagem recentes. Resultados: Vinte e um pacientes foram incluídos; destes, 17 tinham GSDIa e 4 GSDIb, com uma mediana de idade de 10 anos (variou 1-25 anos). Todos os pacientes estavam fazendo tratamento com amido de milho cru com intervalos regulares. A mediana de idade do diagnóstico foi de sete meses ( variou de 1-132 meses), sendo que 19/21 realizaram biópsia hepática para confirmação diagnóstica. Na avaliação antropométrica, o excesso de peso estava presente na maioria dos pacientes (16/21). A baixa estatura foi observada em 4/21 pacientes. Houve correlação entre os escores Z de estatura e de IMC apresentados pelos pacientes (r=0,561; p=0,008). Hepatomegalia e nódulos hepáticos estavam presentes, respectivamente, em 9/14 e 3/14 pacientes. Conclusão: O diagnóstico de GSDI foi tardio em nossa população, visto que os sintomas podem estar presentes desde o nascimento ou nos primeiros meses de vida. Também podemos observar que a maioria dos pacientes foi submetida à biopsia hepática para confirmação do diagnóstico. O quadro clínico característico associado à análise molecular continua sendo um critério seguro e pouco invasivo para o diagnóstico. Outro aspecto importante diz respeito ao tratamento. O uso de grande quantidade de amido de milho tem como efeito colateral o excesso de peso. Contudo, o excesso de peso parece estar associado a um aumento do ganho estatural. / Glycogen storage disease type I (GSDI) is an autosomal recessive genetic disease characterized by hypoglycemia, hyperlactatemia, hyperlipidemia, and hyperuricemia. If left untreated, patients may develop short stature, hepatocellular adenomas, glomerular hyperfiltration, and life-threatening hypoglycemia. In GDIa there is deficiency of glucose-6-phosphatase (G6Pase), and GSDIb is caused by a defect in G6P translocase (or G6PT). In GSD type Ib, the clinical presentation is quite similar to that of GSDIa, but may occur neutropenia with recurrent infections and an increased incidence of inflammatory bowel disease. Management of GSDI is essentially dietary, using uncooked cornstarch at regular four hours intervals. In infants frequent meals and continuous nocturnal infusion through a nasogastric or gastrostomy tube are recommended. Besides that, fructose, sucrose, and lactose intake must be excluded. Vitamin and minerals supplementation, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, alopurinol and potassium citrate can be used, as well, depending patients`clinical conditions. Objectives: To characterize the clinical, laboratory, and anthropometric profile of a sample of Brazilian patients with GSDI cared at an outpatient referral clinic for inborn errors of metabolism. Methods: This was a cross-sectional outpatient study based on a convenience sampling strategy. Data on diagnosis methods used (clinical, histopathological, Glucose-6-phosphatase in liver and molecular analysis) were accessed. Besides that, data about treatment conducted, anthropometric parameters, and laboratory and image tests follow-up were analysed. Results: Twenty-one patients were included in this study. Seventeen were diagnosed as GSDIa and four GSDIb, with median age of 10 years (range 1–25 years). All were taking uncooked cornstarch therapy. Median age at diagnosis was seven months (range, 1–132 months), and 19 patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation. On anthropometric evaluation, overweight was present in 16/21 patients (n =). Short stature was observed in 4/21 patients. A correlation was found between height-for-age and BMI-for-age z scores (r=0.561; p=0.008). Hepatomegaly, and liver nodules were present 9 /14, and 3 / 14 patients respectively. Conclusions: Diagnosis of GSDI was delayed in our sample, since symptoms can be found on the early months of life. Most patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation, even though the combination of a characteristic clinical presentation and molecular methods can provide a less invasive but definitive diagnosis. Another important is that obesity is a side effect of cornstarch therapy. However it appears to be positively associated with growth in these patients.

A doença de armazenamento do glicogênio tipo I (GSDI) é uma doença genética autossômica recessiva caracterizada por hipoglicemia, hiperlactatemia, hiperlipidemia e hiperuricemia. Na GSDIa, ocorre a deficiência da glicose-6-fosfatase (G6Pase) e na GSDIb a deficiência de uma translocase G6P-especifica (G6PT). Ambas apresentam manifestações clínicas semelhantes, porém na GSDIb há alterações dos neutrófilos e o aparecimento de doença inflamatória intestinal. O tratamento é essencialmente dietético, sendo preconizado o uso de amido de milho cru a cada 4 horas. Em lactentes, é utilizada dieta contínua noturna por sonda nasogástrica. Além disso, os pacientes devem fazer a exclusão de lactose, sacarose e frutose da dieta. Na ausência de tratamento, os pacientes apresentam baixa estatura, adenomas hepáticos, hiperfiltração glomerular e risco de morte por hipoglicemia grave. Suplementação vitamínica e de minerais, uso de inibidores da enzima conversora da angiotensia (IECA), alopurinol e citrato de potássio são utilizados de forma individualizada, dependendo das manifestações clínicas apresentadas. Objetivos: Caracterizar os aspectos clínicos, laboratoriais e antropométricos de uma amostra de pacientes brasileiros com GSDI, acompanhados em um serviço de referência para Erros Inatos do Metabolismo. Métodos: Estudo de série de casos de base ambulatorial, com amostragem por conveniência. Foram avaliados dados sobre o método de diagnóstico empregado: clínico, anatomopatológico, dosagem de glicose-6-fosfatase hepática e/ou análise molecular. Além disso, foram coletados dados atuais sobre o tratamento, realizada avaliação antropométrica e avaliados exames laboratoriais e de imagem recentes. Resultados: Vinte e um pacientes foram incluídos; destes, 17 tinham GSDIa e 4 GSDIb, com uma mediana de idade de 10 anos (variou 1-25 anos). Todos os pacientes estavam fazendo tratamento com amido de milho cru com intervalos regulares. A mediana de idade do diagnóstico foi de sete meses ( variou de 1-132 meses), sendo que 19/21 realizaram biópsia hepática para confirmação diagnóstica. Na avaliação antropométrica, o excesso de peso estava presente na maioria dos pacientes (16/21). A baixa estatura foi observada em 4/21 pacientes. Houve correlação entre os escores Z de estatura e de IMC apresentados pelos pacientes (r=0,561; p=0,008). Hepatomegalia e nódulos hepáticos estavam presentes, respectivamente, em 9/14 e 3/14 pacientes. Conclusão: O diagnóstico de GSDI foi tardio em nossa população, visto que os sintomas podem estar presentes desde o nascimento ou nos primeiros meses de vida. Também podemos observar que a maioria dos pacientes foi submetida à biopsia hepática para confirmação do diagnóstico. O quadro clínico característico associado à análise molecular continua sendo um critério seguro e pouco invasivo para o diagnóstico. Outro aspecto importante diz respeito ao tratamento. O uso de grande quantidade de amido de milho tem como efeito colateral o excesso de peso. Contudo, o excesso de peso parece estar associado a um aumento do ganho estatural. / Glycogen storage disease type I (GSDI) is an autosomal recessive genetic disease characterized by hypoglycemia, hyperlactatemia, hyperlipidemia, and hyperuricemia. If left untreated, patients may develop short stature, hepatocellular adenomas, glomerular hyperfiltration, and life-threatening hypoglycemia. In GDIa there is deficiency of glucose-6-phosphatase (G6Pase), and GSDIb is caused by a defect in G6P translocase (or G6PT). In GSD type Ib, the clinical presentation is quite similar to that of GSDIa, but may occur neutropenia with recurrent infections and an increased incidence of inflammatory bowel disease. Management of GSDI is essentially dietary, using uncooked cornstarch at regular four hours intervals. In infants frequent meals and continuous nocturnal infusion through a nasogastric or gastrostomy tube are recommended. Besides that, fructose, sucrose, and lactose intake must be excluded. Vitamin and minerals supplementation, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitor, alopurinol and potassium citrate can be used, as well, depending patients`clinical conditions. Objectives: To characterize the clinical, laboratory, and anthropometric profile of a sample of Brazilian patients with GSDI cared at an outpatient referral clinic for inborn errors of metabolism. Methods: This was a cross-sectional outpatient study based on a convenience sampling strategy. Data on diagnosis methods used (clinical, histopathological, Glucose-6-phosphatase in liver and molecular analysis) were accessed. Besides that, data about treatment conducted, anthropometric parameters, and laboratory and image tests follow-up were analysed. Results: Twenty-one patients were included in this study. Seventeen were diagnosed as GSDIa and four GSDIb, with median age of 10 years (range 1–25 years). All were taking uncooked cornstarch therapy. Median age at diagnosis was seven months (range, 1–132 months), and 19 patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation. On anthropometric evaluation, overweight was present in 16/21 patients (n =). Short stature was observed in 4/21 patients. A correlation was found between height-for-age and BMI-for-age z scores (r=0.561; p=0.008). Hepatomegaly, and liver nodules were present 9 /14, and 3 / 14 patients respectively. Conclusions: Diagnosis of GSDI was delayed in our sample, since symptoms can be found on the early months of life. Most patients underwent liver biopsy for diagnostic confirmation, even though the combination of a characteristic clinical presentation and molecular methods can provide a less invasive but definitive diagnosis. Another important is that obesity is a side effect of cornstarch therapy. However it appears to be positively associated with growth in these patients.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

O Rhipicephalus microplus é um parasita obrigatório hematófago, monoxeno, que gera grande impacto econômico a partir da ação espoliativa sobre o seu hospedeiro preferencial. A glicogênio sintase quinase 3 (GSK-3), uma proteína altamente conservada e ubiquamente expressa entre diversas espécies, foi identificada no carrapato bovino sob a isoforma GSK-3β. Envolvida na modulação da atividade da proteína glicogênio sintase, como um agente regulador da síntese de glicogênio, essa proteína atua no metabolismo energético do R. microplus. A GSK-3 também está envolvida na via de sinalização Wnt, e por isso, já foi descrita como uma quinase essencial para a formação do embrião, estando diretamente envolvida no processo reprodutivo deste carrapato. Neste contexto, a GSK-3β é uma candidata para o desenvolvimento de novas alternativas de controle do carrapato bovino. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi estudar a participação da proteína GSK-3β na fisiologia do R. microplus a partir da inibição de sua atividade. Ensaios in vitro e in vivo foram realizados para testar a inibição química e imunológica da atividade dessa proteína. Anticorpos contra peptídeos sintéticos baseados na sequência da GSK-3β (anti- SRm0218 e anti-SRm86100) usados neste trabalho não foram capazes de inibir a atividade dessa proteína, no entanto, a inibição da GSK-3β foi alcançada quando células embrionárias de R. microplus foram submetidas à inibição química, por meio de um inibidor específico. Este resultado sustenta o potencial dessa proteína como alvo para o desenvolvimento de uma alternativa de controle do carrapato bovino, pois a sua inibição possivelmente atuaria negativamente na capacidade reprodutiva do carrapato R. microplus. / Rhipicephalus microplus is a monogenetic, hematophagous ectoparasite that has a large economic impact due to associated losses in the cattle industry. Glycogen synthase kinase 3 (GSK-3) is a highly conserved and ubiquitously expressed protein in several species. It has been identified as GSK-3β isoform in the cattle tick, and is involved in the modulation of glycogen synthase activity, as a regulator of glycogen synthesis with a role in energy metabolism of R. microplus. GSK-3β is also involved in the Wnt signaling pathway. It is a fundamental kinase for embryo development, and is directly linked with R. microplus reproductive process. Thus, the aim of this study was to investigate the role of GSK-3β in R. microplus physiology by inhibiting its activity. In vitro and in vivo assays were carried out to test its immunological and chemical inhibition. Rabbit antibodies against synthetic peptides based on GSK-3β sequence (anti-SRm0218 and anti-SRm86100) used in this work were not capable to inhibit GSK- 3β activity, but GSK-3β inhibition was reached when R. microplus embryo cells were cultivated with a specific inhibitor. This result supports the potential of this protein as a target to develop a new cattle tick control method, because its inhibition probably acts detrimentally in the reproductive capacity of the tick.

La presencia de glucógeno en las neuronas ha sido motivo de controversia durante las pasadas décadas. Sin embargo, está aceptado que las neuronas expresan la maquinaria necesaria para sintetizar glucógeno, pero no para degradarlo. La presencia de la glucógeno sintasa (GS) en las neuronas es un misterio y no existe ningún estudio que analice cuál es su función fisiológica en este tipo neuronal. Recientemente se ha establecido un paralelismo entre la GS neuronal y el caballo de Troya, ya que múltiples estudios han demostrado que una hiper-activación de la GS y la consecuente acumulación de glucógeno desencadenan la entrada en apoptosis. A pesar de ello, la neurona gasta energía para su transcripción y traducción, lo que hace pensar que su presencia en la neurona es importante para su correcto funcionamiento. Los objetivos de esta tesis doctoral son los siguientes: 1. Caracterización del metabolismo de glucógeno y de su presencia en neuronas. 2. Estudio de la maquinaria de degradación de glucógeno en neuronas y su regulación en hipoxia 3. Análisis de la síntesis de glucógeno en neuronas expuestas a hipoxia. 4. Evaluación de la función biológica de la GS en neuronas bajo condiciones de hipoxia. Los resultados de esta tesis revelan que las neuronas tienen una síntesis de glucógeno activa, y, además, lo acumulan en condiciones basales. Además, poseen la maquinaria necesaria para la degradación de glucógeno y degradan sus propias reservas en condiciones de hipoxia. La capacidad neuronal de degradación de glucógeno está presente en una situación in vivo, ya que las neuronas del modelo Drosophila melanogaster movilizan sus reservas en condiciones de hipoxia, y las neuronas de Purkinje en el ratón lo hacen tras una anoxia post-mortem prolongada. La maquinaria de degradación del polisacárido, desconocida hasta el momento, está mediada por la expresión de la glucógeno fosforilasa (GP). Las neuronas expresan la isoforma cerebral del enzima, pero no la muscular, como en el caso de los astrocitos. Esta isoforma está presente tanto en neuronas en cultivo como en neuronas procedentes de cortes de cerebro de ratón adulto. La hipoxia causa la defosforilación y activación de la GS. La GS sintetiza glucógeno activamente, aunque los niveles netos del polisacárido disminuyen en hipoxia. Por tanto, está teniendo lugar un ciclo aparentemente fútil en donde la síntesis y degradación se encuentran activas. Finalmente se ha demostrado que el metabolismo del glucógeno forma parte de la maquinaria de protección que activa la neurona para resistir a la hipoxia. En consecuencia, las neuronas que carecen la GS tienen una mortalidad más elevada que aquellas que sí que expresan el enzima. En el modelo de la mosca, el metabolismo del glucógeno neuronal también juega un papel en la tolerancia a la hipoxia y moscas con niveles reducidos de GS específicamente en la neurona muestran un empeoramiento en la respuesta tras un período de bajo oxígeno. En conclusión, esta tesis presenta evidencias de que las neuronas poseen un metabolismo activo de glucógeno que, además, juega un papel clave en la tolerancia de estas células a condiciones de hipoxia. / The presence of glycogen in neurons has been a matter of debate for the past decades. However, it is accepted that neurons express the necessary machinery to synthesize glycogen, but not for degrading it. The presence of Glycogen Synthase (GS) in neurons is a mystery and there is no study which approaches its physiological function in this cellular type. Recently a parallelism has been drawn between GS and the Trojan horse, since several studies have shown that an over-activation of GS and an accumulation of glycogen cause apoptosis in the neurons. Nevertheless, neurons waste energy for transcribing and synthesizing the protein, which suggests that its presence might be important for the normal functioning of the neurons. The aims of the thesis are the follows 1) Characterization of glycogen metabolism and its presence in neurons 2) Study of the glycogen degradation machinery in neurons and its regulation in hypoxia 3) Analysis of the synthesis of glycogen in neurons exposed to hypoxia 4) Evaluation of the biological function of GS in neurons under hypoxia conditions The results of this thesis reveal that there is an active glycogen synthesis under normal conditions. In addition, they express the necessary machinery to degrade the polysaccharide and degrade it under hypoxia conditions. The neuronal capacity of glycogen degradation is present in the in vivo situation, both in neurons from Drosophila melanogaster and from mice. The glycogen degradation machinery is mediated through the expression of glycogen phosphorylase (GP). Neurons express the brain isoform of the enzyme, but not the muscle, as astrocytes do. This isoform is present in neuronal cultures, as well as in neurons from adult mice brain slices. Hypoxia causes the dephosphorylation and activation of GS. GS actively synthesizes glycogen, although the global glycogen levels diminished in hypoxia. Indeed, an apparent futile cycle is taking place under hypoxia, where both synthesis and degradation are activated. Finally, we have demonstrated that glycogen metabolism is part of the protection machinery the neuron activates for tolerating the hypoxia conditions. Consequently, neurons without GS have a higher mortality rate that these who actively express the enzyme. In Drosophila melanogaster, flies with reduced GS levels specifically in neurons have an impaired phenotype in their reponse to hypoxic conditions. In conclusion, this thesis presents evidences that show neurons have an active glycogen metabolism which plays a key role in the neuronal response to hypoxia.