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Construção de minigenes para avaliação de mutações que açlteram o sitio de splicing do gene responsavel pela glicogenose tipo Ia (Doença de Von Gierke)

Reis, Fernanda de Castro 27 July 2018 (has links)
Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Denise Yvonne Janovitz Norato / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-07-27T18:22:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis_FernandadeCastro_M.pdf: 23985784 bytes, checksum: e92f2903bb320c3ac779c96e20940b1a (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A doença de depósito de glicogênio do tipo Ia (GSDIa), é a forma mais comum entre as glicogenose do tipo I (GSDI), com uma freqüência de 1:100.000 nascimentos. É uma doença de herança autossômica recessiva, clinicamente caracterizada por hipoglicemia, hepatomegalia, retardo no crescimento, hiperlipidemia, hiperuricemia e acidose láctica. Esses sintomas são provocados pela deficiência da enzima glicose 6- fosfatase (G6Pase), que cataliza as etapas finais da gliconeogênese e glicogenólise através da conversão da glicose 6-fosfato (G6P) em glicose e fosfato. No passado, muitos pacientes com GSDI morriam pela doença. Atualmente, com o diagnóstico precoce e início de um tratamento contínuo e adequado, complicações como adenomas hepáticos e renais podem ser prevenidas. O isolamento do cDNA humano da G6Pase demonstrou que o gene G6PC é composto de cinco exons, possui um tamanho de 12,5Kb e se localiza no cromossomo 17. Desde sua clonagem, mais de 50 diferentes mutações foram descritas no gene. Em pacientes caucasianos provenientes dos EUA e do Noroeste europeu, as mutações R83C e Q347X são responsáveis por 22,5% e 22,4% de todos os alelos mutantes respectivamente. O diagnóstico de GSDIa pode ser feito através de testes enzimáticos e confirmado pela análise de mutação no gene G6PC. A caracterização do gene da G6Pase possibilitou a identificação de mutações que causam GSDIa. Este fato nos dá a opção de aplicar um diagnóstico baseado em análise de DNA para detecção de portadores e diagnóstico prénatal. A caracterização do gene também possibilita um insight em tomo da relação estrutura-função da catálise da G6Pase, revelando a função estrutural de aminoácidos específicos. No presente estudo, vinte e sete pacientes de GSDIa provenientes de 26 famílias não relacionadas foram investigados. O diagnóstico pela análise da atividade da enzima G6Pase em biópsia de fígado foi confirmado em apenas quatro pacientes. A estratégia dos minigenes foi utilizada para verificar o efeito das mutações intrônicas sob o mecanismo de splicing, não sendo identificados transcritos aberrantes. A perda de exons ou incorporação de fragmentos intrônicos nos exons são mecanismos mutacionais comuns, freqüentemente causados por mudanças nas seqüências conservadas de regiões de sítios de splicing. Da mesma forma seqüências fora dessas regiões também podem afetar a inclusão ou exclusão de exons. Essas alterações que atuam nos mecanismos de splicing podem estar localizadas em introns ou em exons, e padrões de splicing alternativos podem ser determinados pela visualização do tamanho do produto de transcrição. Foram identificadas oito alterações no gene G6PC, incluindo uma nova mutação de ponto encontrada até o momento somente na população brasileira, publicada por nosso grupo, duas mutações intrônicas, uma mutação silenciosa e quatro mutações de ponto previamente descritas. Foi analisado também o polimorfismo T1176C que está em associação com a mutação R83C. Esse polimorfismo pode ser utilizado como marcador para o diagnóstico de portadores e pré-natal de famílias com GSDIa que têm mutações não identificadas e que são informativas para esse marcador. Esse estudo enfatiza que a análise molecular genética é uma alternativa confiável e conveniente ao ensaio enzimático feito em biópsia de figado para o diagnóstico de GSDIa / Abstract: Glycogen storage disease type (GSD) is the most prevalent form among the glycogen storage disease type I (GSDI), with an overall frequency of 1:100.000 live births. It' s an autosomal recessive disorder clinically characterized by hypoglycemia, hepatomegaly, growth retardation, hyperlipidemia, hyperuricemia, and lactic acidemia. These symptoms are caused by a deficiency in glucose 6-phosphatase (G6Pase), which catalyzes the terminal steps in gluconeogenesis and glycogenolysis by converting glucose 6-phosphate (G6P) into glucose and phosphate. In the past, many patients with type I glycogen storage disease used to die. At present, with early diagnosis and initiation of continuous proper treatment such as hepatic and renal adenomas can be prevented. Isolation of human G6Pase cDNA showed that G6PC gene is composed of five exons, spanning approximately 12,5Kb on chromosome 17.From its cloning, more than 50 different mutations have been reported in this gene. In Caucasian patients trom the USA and from North-West Europe, R83C and Q347X account for 25.2% and 22.4% of all mutant alleles respectively. Diagnosis of GSDla can be done by enzymological tests and confirmed by mutation analysis of the G6PC gene. The characterization of the G6Pase gene enabled the identification of the mutations causing GSDla. This fact provides an option on applying DNA-analysis based diagnosis for carrier detection and prenatal diagnosis. The characterization of the gene also provides an insight into the structure-function relation of the G6Pase catalysis, by revealing the structural roles of specific amino acid residues. In the present study, twenty seven GSDla patients trom twenty six unrelated families were investigated. The diagnosis by the G6Pase enzyme activity analysis in the liver biopsy was confirmed only in four patients. The minigenes strategy was used in order to verify the effect of the intronic mutations in the splicing mechanism. No aberrant transcripts were identified. Exon skipping or exon intronic fragment incorporation is an usual mutational mechanism, often caused by changes in the consensus sequences at splicing site region. Likewise, sequences outside these regions can also affect the inclusion or exclusion of exons. Such splicing enhancers may be located in introns or exons, and alternative splicing pattems could be determined by visualization of a sized transcription product. Eight alterations in the G6PC gene were identified, including a new point mutation found so far only in Brazilian population and published by our group, two intronic mutations, a silent mutation, and four point mutations previously described. It was also analyzed the T1176C polymorphism that is in association with the R83C mutation. This polymorphism can be used as a marker in carrier and prenatal diagnosis of GSDla families which have unidentified mutations and are informative for this marker. This study emphasizes that molecular genetic analysis is a reliable and convenient altemative to the enzyme assay in a tresh liver biopsy specimen to diagnose GSDla / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas
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Clonagem e caracterização do gene da glicogênio sintase quinase 3 de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Andrade, Caroline Pinto de January 2008 (has links)
Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.
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Clonagem e caracterização do gene da glicogênio sintase quinase 3 de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Andrade, Caroline Pinto de January 2008 (has links)
Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.
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Estudo sobre a participação dos eritrocitos na regulação da glicemia : armazenamento e mobilização de glicogenio em eritrocitos de ratos normais e diabeticos e suas relações com o metabolismo de carboidratos no figado

Silva, Carlos Alberto da 13 June 1997 (has links)
Orientador: Antonio Ari Gonçalves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-22T05:48:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_CarlosAlbertoda_D.pdf: 4885610 bytes, checksum: aedd6b59eb89402aeec23a117f5f0cd9 (MD5) Previous issue date: 1997 / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar in vivo e in vitro o conteúdo de glicogênio em eritrócitos de ratos, relacionando este conteúdo com as variações na concentração de glicose e/ou hormônios, tendo em vista a sua possível participação na homeostasia glicêmica. Por isso, estendemos este estudo aos eritrócitos de ratos diabéticos e aos efeitos de substâncias como a metformina e fenobarbital utilizadas no tratamento de diabéticos. Eritrócitos de ratos normais (in vivo e in vitro) aumentaram o conteúdo de glicogênio linearmente à elevação da glicemia e depletaram suas reservas durante a hipoglicemia. O conteúdo eritrocitário de glicogênio é maior na veia supra-hepática e nas artérias de que no ramo venoso. Em ratos submetidos a jejum durante 24h, as reservas eritrocitárias de glicogênio foram depletadas, mas recuperam-se parcialmente durante o jejum de 48 h, mostrando um comportamento idêntico ao dos hepatócitos. Em resposta a uma condição indutora de estresse (natação forçada durante 50 min), também houve depleção das reservas hepáticas e eritrocitárias de glicogênio. "In Vitro" a insulina não modificou o conteúdo de glicogênio dos eritrócitos. No entanto, hormônios glicogenolíticos promoveram intensa depleção das reservas; mesmo na presença de altas concentrações de glicose. Eritrócitos de ratos diabéticos, os quais, apresentam redução na captação e no metabolismo de glicose possuem baixo conteúdo de glicogênio e demonstraram baixa capacidade de incorporar glicose às reservas de glicogênio, in vivo e in vitro. Esta capacidade foi restabelecida parcialmente (in vivo e in vitro), pelo tratamento com fenobarbital ou com metformina. De maneira semelhante, o conteúdo de glicogênio no fígado de ratos diabéticos foi restabelecido. Os ratos controle e diabéticos tratados com metformina e fenobarbital não apresentaram redução na glicemia mostrando que o tratamento não induz hipoglicemia. Quanto à concentração plasmática de lactato, não observamos hiperlactatemia nos ratos tratados com metformina. Nossos resultados mostraram que os eritrócitos são importantes reservatórios de glicose, captando-a durante a passagem pelo fígado e distribuindo-a na periferia. Também foi demonstrado que as reservas eritrocitárias de glicogênio são sensíveis a ação dos hormônios glicogenolíticos, à semelhança do que ocorre nos hepatócitos. Esta propriedade dos eritrócitos pode ser importante durante a hipoglicemia. Este trabalho também mostrou diversas semelhanças entre hepatócitos e eritrócitos no que se refere ao metabolismo de carboidratos de ratos normais e diabéticos. A avaliação periódica do conteúdo de glicogênio eritrocitário poderia constituir um bom índice de avaliação das alterações metabólicas (particularmente dos carboidratos) em estudos ou tratamentos que requerem frequente retiradas de amostras e naqueles em que tais amostragens são postergadas para épocas de sacrifícios ou após a morte natural do animal ou sujeito / Abstract: The major objective in the development of this work was demonstrate that erythrocytes participates in the glycemic homeostasis. The following parameters was evalueted in erythrocytes: glucose consumption, glycogen storage, transport and mobilization and transport of lactate/pyruvate. The hepatic storage and mobilization of glycogen in certain condition was studied, too. In vivo, we showed that erythrocyte glycogen content changed according to glycaemia in vessels. Arteriovenous difference and difference between portal and suprahepatic veins in glycogen content is parallel to glycemia differences. These are evidencies for the occurrence of hydrolysis of glycogen and release to plasma when glycemia falls and that erythrocyte take glucose up and synthetize glycogen when crossing the liver. Also, we presented evidences for an exchange of lactate for glucose between erythrocytes and liver. In accordance to the results above mentioned, erythrocytes incubated in saline at 37°C increased, linearly, their content of glycogen with increase in extracellular glucose concentration and reduced it when glucose concentration diminished. 80th, charge and discharge are well correlated to extracellular glucose concentration (r = 0.942), similarly to that measured " in vivo". Stressing condictions, as 24h fasting or heavy exercise (50 min swiming) almost deplete the erythrocytes glycogen content. Those conditions also acutely deplete glycogen liver stores. This response is characteristic of erythrocytes because they responded " in vitro " to hyperglycemic hormones, glucagon (1 U/ml), adrenaline (200 ng.ml-1 noradrenaline (200 ng.ml-1) and corticosterone (22 µg.ml-1 reducing their content of glycogen, even in the presence of high glucose concentration. This resembles the hepatocytes response to the same hormones. On the other hand, insulin do not affect erythrocyte glycogen content. In contrast to normal, erythrocytes from aloxanized rats showed a pronouced reduction in their hability to store glucose as glycogen. This results suggest that glycogen synthesis is deficient in aloxanized rats, even in the presence of high glucose concentration. Metformin and phenobarbital, substances used as coadjuvant for the treatment of diabetes, also stimulated the accumulation of glycogen in diabetic erythrocytes, in vivo and in vitro. This is another similarity between liver and erythrocytes since those substances are known to recovery the hability of liver to sinthetize and store glycogen. Those data confirm in rats the effects observed in human liver. Our data demonstrated that glucose metabolism is defective in erythrocyte from diabetic rats, affecting both free and stored glucose metabolism. As shown in liver and skeletal muscle, this defect is reversed in erythrocytes by treatment with metformin or Phenobarbital / Doutorado / Fisiologia e Biofisica / Doutor em Ciências Biológicas
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Clonagem e caracterização do gene da glicogênio sintase quinase 3 de Rhipicephalus (Boophilus) microplus

Andrade, Caroline Pinto de January 2008 (has links)
Rhipicephalus (Boophilus) microplus é um parasita que infesta bovinos causando grandes perdas na pecuária. O método convencional para o controle é através do uso de produtos químicos. Esses produtos causam a seleção de carrapatos resistentes a acaricidas e a poluição do meio-ambiente. Uma abordagem alternativa tem sido testada, o qual inclui o uso de vacinas. Entretanto, o sucesso dessa estratégia é dependente da caracterização de antígenos do carrapato. A Glicogênio Sintase Quinase-3β (GSK-3β) é uma serina\treonina quinase que está envolvida no metabolismo do glicogênio, durante a embriogênese do carrapato. O estudo da embriogênese do carrapato é fundamental no desenvolvimento de novas metodologias propostas para o controle desses vetores. A interferência na embriogênese pode resultar em um decréscimo na viabilidade dos ovos ou até em uma letalidade precoce. Nesse trabalho, a região codificadora da GSK-3β do carrapato foi obtida através do 5’RACE, 3’RACE. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em ovário de carrapato foi maior quando comparado com intestino e corpo gorduroso, sugerindo que a GSK-3β está envolvida no desenvolvimento de oócitos. Na embriogênese a transcrição relativa do gene da GSK-3β começou no 1º dia de postura com um aumento gradual até 15º dia. No 18º dia ocorre um declíneo e depois a transcrição relativa do gene aumentou novamente, indicando que a GSK-3β teria alguma função relacionada com o final de embriogênese. A transcrição relativa do gene da GSK-3β em células embrionárias do carrapato (BME26) aumentou com o tratamento de insulina. Quando tratadas com tirfostin (inibidor do receptor de insulina), SB216763 (inibidor específico da GSK-3), e wortimanina (inibidor da PI3K) a transcrição relativa do gene foi semelhante ao controle. O alsterpaullone (inibidor específico da GSK-3) inibiu o desenvolvimento dos embriões tanto em fêmeas injetadas com o inibidor como em fêmeas alimentadas artificialmente, sugerindo que a GSK-3β seria crucial para o desenvolvimento embrionário. / Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a parasite that infests bovines causing losses in cattle production. The conventional method for control is the use of synthetic chemical products. These products cause the selection of acaricideresistant ticks and pollution of the environment. A range of alternative approaches have been taken, which include the use of vaccine. However, the success of this strategy is dependent on the characterization of the tick antigens. The Glycogen Synthase Kinase (GSK-3β) is a serine/threonine kinase that is involved in glycogen metabolism during tick embryogenesis. The tick embryogenesis studies have played a fundamental role in designing new methodologies proposed for the control of these vectors. Interference on embryogenesis can result in the decrease of the egg’s viability or even in early lethality. In this work, the full length cDNA encoding the GSK-3β protein of the tick has been obtained by 5'-RACE and 3'- RACE. The relative transcription of GSK-3β gene in ovaries was higher when compared with gut and fat body, suggesting that GSK-3β was involved in the oocytes development. In the embryogenesis the relative transcription of the GSK- 3β gene started on 1st day with gradual increase until a peak at 15th day post oviposition. In 18th day occured a decline and after the relative transcription increase again. Probably the GSK-3β has some function related with final embryogenesis. The relative transcription of GSK-3β gene in cells BME26 when treated with insulin increased. When treated with tyrphostin, wortimanin and SB216763 did not increase. The alsterpaullone, GSK-3β specific inhibitor, blocks the embryo development of females ticks injected with the inhibitor and with artificial capillary feeding method, suggesting that GSK-3β could have a crucial function in the embryo development.
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Mobilização do glicogenio e trealose endogenos de leveduras industriais

Paulillo, Silene Cristina de Lima 28 July 2018 (has links)
Orientadores : Fumio Yokoya, Luiz Carlos Basso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T22:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulillo_SileneCristinadeLima_D.pdf: 19959597 bytes, checksum: eca8391f2ae422d2c20626045858d0fb (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O resumo podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos
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Metabolismo do glicogênio em Neurospora crassa : um estudo molecular e bioquímico e análise de interação proteína-proteína /

Paula, Renato Magalhães de January 2004 (has links)
Orientador: Maria Célia Bertolini / Resumo: Glicogênio representa um dos principais carboidratos de reserva em muitos organismos e seu metabolismo está sob o controle de um complexo mecanismo envolvendo o balanço de nutrientes e sinais ambientais. A proteína glicogenina constitui a molécula iniciadora do processo de síntese de glicogênio, sendo as etapas seguintes efetuadas pelas enzimas glicogênio sintase e enzima ramificadora. Glicogênio sintase é a enzima limitante no processo e é regulada alosterismo e fosforilação reversível. Neste trabalho foi realizada uma caracterização do metabolismo de glicogênio no fungo N. crassa enfocando as enzimas glicogenina, glicogênio sintase e glicogênio sintase quinase-3. A proteína glicogenina (GNN) foi caracterizada do ponto de vista molecular, bioquímico e funcional. O cDNA codificando para esta proteína foi isolado e a seqüência polipeptídica deduzida mostrou uma proteína de 664 aminoácidos, uma das maiores proteínas glicogenina já isoladas. A inativação do gene gnn resultou em uma linhagem mutante incapaz de acumular glicogênio. A produção da proteína GNN em E. coli resultou em um polipeptídeo altamente susceptível à proteólise e formas truncadas da proteína mostraram ser mais estáveis e igualmente ativas nos processos de auto- e trans-glicosilação, além de servirem de substrato para ação da glicogênio sintase. Tais formas também foram capazes de complementar funcionalmente mutantes de S. cerevisiae. Além disso, a expressão do gene gnn foi mostrado ser regulado durante crescimento vegetativo e deprivação de carbono. Os resíduos Tyr196 e Tyr198 foram identificados como os sítios de glicosilação, os quais contribuem diferencialmente para este processo. Análise das interações entre GNN e a proteína glicogênio sintase de N. crassa (GSN) demonstrou que a região C-terminal da GNN é a mais importante para a interação. Entretanto, o...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glycogen represents one of the main reserve carbohydrates in many organisms and its metabolism is under control of a complex mechanism involving the balance of nutrients and environmental signals. The protein glycogenin is the initiator molecule in glycogen biogenesis and the subsequent steps are carried out by the enzymes glycogen synthase and branching enzyme. Glycogen synthase is the rate-limiting enzyme in the process and is regulated both by alosterism and reversible phosphorylation. In this work we performed a characterization of the glycogen metabolism in the filamentous fungus Neurospora crassa, focusing on the enzymes glycogenin, glycogen synthase and glycogen synthase kinase-3. The protein glycogenin (GNN) was characterized under the molecular, biochemical and functional aspects. The cDNA encoding for this protein was isolated and the deduced polypeptide sequence showed a protein with 664 residues, one of the largest glycogenins isolated so far. The inactivation of the gnn gene rendered a mutant strain that was no longer able to accumulate glycogen. The production of GNN protein in E. coli cells resulted in a polypeptide highly susceptible towards proteolysis and truncated forms were more stable and equally active, judged by their abilities to self- and trans-glucosylate, and to serve as substrate for glycogen synthase elongation. These proteins were also able to recover the glycogen deficiency phenotype in a S. cerevisae mutant strain. Moreover, the gnn gene expression was shown to be ...(Complete abstract, click electronic access below) / Doutor
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Caracterização funcional de duas proteínas de Neurospora crassa identificadas em complexos DNA-proteína /

Savassa, Susilaine Maira. January 2013 (has links)
Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Marcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Marcos Roberto Mattos Fontes / Resumo: O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo muito utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para o estudo dos mecanismos moleculares e bioquímicos da regulação do metabolismo de glicogênio. A presente proposta de trabalho é uma consequência de experimentos anteriores realizados com o objetivo de identificar proteínas (fatores de transcrição ou não) que se ligam à região promotora do gene gsn, o qual codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória do processo de síntese do carboidrato. Esses estudos combinaram experimentos de ensaios de retardamento em gel utilizando fragmentos do promotor gsn e proteínas do extrato total do fungo, acoplados à análise proteômica e identificação das proteínas por espectrometria de massas. Os experimentos resultaram na identificação de algumas proteínas do fungo, as quais podem ou não estar envolvidas na regulação da expressão do gene. Alguns estudos preliminares com estas proteínas foram anteriormente realizados no laboratório e apontaram um provável papel das mesmas na regulação do metabolismo do carboidrato em N. crassa. Duas dessas proteínas, as codificadas pelas ORFs NCU3482 e NCU06679 foram objeto de estudo neste trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização das linhagens mutantes nestas ORFs, além da produção e purificação das proteínas na forma recombinante. Foram realizadas análises morfológicas da linhagem mutante na ORF NCU06679, tais como: crescimento colonial e radial, crescimento linear e análise microscópica das extremidades das hifas. Esses experimentos foram realizados em comparação com a linhagem selvagem do fungo e, mostraram esta proteína está envolvida no processo de desenvolvimento do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The present work is a consequence of previous experiments performed in the laboratory to identify proteins that bind to the promoter region of the gsn gene which encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Previous studies were performed by using a combination of DNA gel shift assay coupled to proteomic analysis, followed by identification of proteins by mass spectrometry. The assays resulted in the identification of proteins likely involved in the regulation of gene expression. Preliminary studies with these proteins have previously been carried out and suggested that they might have a role in the regulation of glycogen metabolism in N. crassa. Two of them, the ORFs NCU3482 and NCU06679 gene products were object of study in this work. The main objective was to characterize the mutant strains in both proteins and to produce and purify the recombinant proteins. Morphological analyzes were performed in the ORF NCU06679 mutant strain such as colony and radial linear growth and microscopic examination of the ends of the hyphae. These experiments showed that this protein is involved in the fungus development since growth and ability to conidiate were deficient when compared to the wild-type strain. The expression of gsn and gpn (encodes glycogen phosphorylase, the regulatory enzyme in glycogen degradation) genes were analyzed by qPCR and the results showed differences in gene expression of both genes during vegetative growth of the NCU06679 mutant strain when compared to the wild-type strain. The protein encoded by ORF NCU06679 was produced as a recombinant protein and the purification... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Participação das vias gliconeogênica, glicogênica e lipogênica no processo de osmorregulação, in vitro, em tecidos do caranguejo Neohelice granulata (DANA, 1851)

Lopes, Bettega Costa January 2014 (has links)
Os estuários são ecossistemas que apresentam uma constante variação no seu ambiente físico-químico, como teor de oxigênio dissolvido, temperatura ambiente, e principalmente de salinidade da água. O presente trabalho teve como objetivo investigar os efeitos do estresse osmótico (hipo e hiperosmotico) agudo (1h), in vitro, sobre as vias gliconeogênica, glicogênica e lipogênica em tecidos de caranguejos N. granulata. No presente estudo não foram constatadas variações na incorporação de 14C-alanina em glicose ou glicogênio no hepatopâncreas e nas brânquias anteriores. No entanto, foi constatada uma diminuição significativa (p<0,05) na incorporação de 14C-alanina em glicose nas brânquias posteriores durante os ajustes osmóticos a um meio mais concentrado. No hepatopâncreas não foram observadas variações na conversão de 14C-alanina em lipídeos, porém, nas brânquias anteriores houve uma diminuição na síntese de 14C-lipídeo a partir de 14C-alanina no choque hiperosmótico, enquanto que nas brânquias posteriores houve um aumento na síntese de lipídeos durante o choque hiposmótico. O presente trabalho mostra claramente que o fluxo de carbonos da alanina pode ser direcionado tanto para o metabolismo da glicose como de lipídios com o objetivo de aumentar ou diminuir os níveis de aminoácidos intracelulares.
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Efeito do trans-resveratrol sobre a longevidade e o metabolismo de glicogênio de Drosophila melanogaster em diferentes idades

Fernandes, Felipe Amorim January 2006 (has links)
O trans-resveratrol é uma fitoalexina natural encontrada em uvas, amoras, amendoim e muitas espécies de plantas. Em uvas o trans-resveratrol é responsável pela proteção natural contra doenças e sua concentração depende da origem geográfica, da variedade e dos métodos de fabricação do vinho; sendo considerado por muitos autores como um geroprotetor. O objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito do transresveratrol na longevidade e no metabolismo de carboidratos (glicogênio, atividade e expressão da enzima glicogênio fosforilase - GFT) de Drosophila melanogaster em diferentes idades (0, 7, 14, 18 e 21 dias). Para a análise da longevidade espécimes de D. melanogaster com idade de 10 dias foram colocados em vidros contendo meio de cultura padrão acrescido de água ou dimetilsulfóxido (DMSO) 0,03%, ou trans-resveratrol nas concentrações de 1, 10 ou 20μM para ovoposição durante 24 horas, a prole recebeu os seus respectivos tratamentos durante toda a vida. Para as análises do metabolismo de glicogênio os espécimes de D. melanogaster foram colocados em meio de cultura padrão adicionado de água ou dimetilsulfóxido 0,03% (DMSO) ou ainda, trans-resveratrol na concentração de 1μM dissolvido em DMSO (0,03%) para ovoposição; seus ovos foram mantidos até a eclosão, durante a fase adulta os animais continuaram a receber os seus respectivos tratamentos até os pontos em que foram feitas as determinações bioquímicas e moleculares. Os resultados indicam que o tratamento com trans-resveratrol modulou o metabolismo de carboidratos em fêmeas e em machos de forma diferenciada; contudo, este composto não foi capaz de alterar a expressão gênica da GFT. Nas fêmeas tratadas com trans-resveratrol 1μM verificou-se um aumento de 127% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Já nos machos tratados com trans-resveratrol 1μM observou-se um acréscimo de 50% na longevidade quando comparado ao grupo controle. Em ambos sexos tratados com Trans-resveratrol 10 e 20μM não houve aumento significativo da longevidade. Com base nos resultados podemos sugerir que o trans-resveratrol como outros antioxidantes descritos na literatura tem seus efeitos benéficos na menor dose administrada, podendo nas doses mais elevadas estar atuando como um pró-oxidante. Os resultados obtidos sugerem que o trans-resveratrol modula o metabolismo do glicogênio tanto em machos como em fêmeas e aumenta a longevidade do modelo experimental testado.

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