Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T14:08:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 281335.pdf: 2427402 bytes, checksum: fcd04bec714a61e4eedf82f41ef096c9 (MD5) / Candida glabrata é considerado um importante patógeno fúngico emergente devido principalmente ao incremento de pacientes imunossuprimidos, e ao uso indiscriminado de compostos azólicos, resultando em altas taxas de mortalidade pela resistência inata desta levedura aos antifúngicos normalmente utilizados. Estratégias que objetivam a pronta identificação deste patógeno são extremamente importantes já que permitem a pronta implementação de um tratamento medicamentoso apropriado. A utilização de trealose por C. glabrata é apontada como importante metodologia diagnóstica na pratica laboratorial, já que é característica marcante desta levedura a utilização de apenas glicose e trealose como fontes de carbono. Resultados prévios indicavam que esta levedura cresce em trealose graças à secreção no meio de cultura de uma trealase ácida que prontamente hidrolisa o dissacarídeo, permitindo a rápida fermentação da glicose liberada. No genoma de C. glabrata encontramos a ORF CAGL0K05137g, similar ao gene (ATH1) que codifica para a trealase ácida de S. cerevisiae. No intuito de verificar a identidade do gene postulado no genoma de C. glabrata como sendo da trealase ácida, utilizamos tanto estratégias de deleção da ORF do genoma, como subclonagem e expressão heteróloga dessa sequência gênica em S. cerevisiae. A deleção em C. glabrata confirmou a identidade do gene, não só pela ausência de crescimento em meios de cultura contendo trealose como fonte de carbono, como também pela perda da atividade trealase ácida periplasmática e/ou secretada pelas células. Além disso, nossos resultados indicam o envolvimento deste gene na manutenção da homeostase celular durante o estresse salino. A seqüência de DNA correspondente foi também subclonada de forma a sobrexpressar este gene em S. cerevisiae, confirmando o gene CgATH1 como sendo o responsável pela síntese de uma trealase ácida. A ORF clonada foi seqüenciada e comparada à ORF CAGL0K05137g, mostrando uma identidade de 98% entre as sequências. Acreditamos que a caracterização molecular da trealase ácida em C. glabrata permitirá melhorias no diagnóstico laboratorial, bem como uma melhor compreensão do papel desta enzima, e do metabolismo de trealose, na fisiopatologia deste importante patógeno oportunista e de outros fungos de interesse médico. / Candida glabrata is considered an important and emergent fungal pathogen due mainly to an increase in immunosuppressive patients, and to the indiscriminate use of azolic compounds, resulting in high mortality rates by the innate resistance of this yeast towards the normally used antifungals. Strategies that objectify the fast identification of this pathogen are extremely important, because they will allow the immediate implementation of an appropriate medical treatment. The utilization of trehalose by C. glabrata is pointed out as an important diagnostic methodology in the laboratorial practice, since it is a striking feature of the yeast to use only glucose and trehalose as carbon sources. Previous results indicate that this yeast grows in trehalose thanks to the secretion of an acid trehalase in the culture media that promptly hydrolyses the disaccharide, allowing the fast fermentation of the released glucose. In the genome of C. glabrata we found the ORF CAGL0K05137g, similar to the gene (ATH1) encoding for the acid trehalase of S. cerevisiae. In order to verifying the identity of the postulated gene in the genome of C. glabrata as an acid trehalase, we thus utilized strategies for the deletion of the ORF from the genome, as well as cloning and heterologous expression of this genetic sequence in S. cerevisiae. The deletion in C. glabrata confirmed the identity of the gene, not only because of absence of growth in culture media containing trehalose as a carbon source, but also to the loss of periplasmic and/or secreted acid trehalase activity by the cells. Besides, our results indicate the involvement of this gene in the maintenance of cellular homeostasis during a saline stress. The corresponding DNA sequence was also subcloned so that the gene could be overexpressed in S. cerevisiae, confirming the CgATH1 gene as being responsible for the synthesis of an acid trehalase. The cloned ORF was sequenced and compared to the ORF CAGL0K05137g, showing 98% identity between the sequences. We believe that the molecular characterization of the acid trehalase in C. glabrata will allow improvements in the laboratorial diagnostic, as well as a better understanding of this enzyme#s role, and of trehalose metabolism, in the physiopathology of this important opportunistic pathogen and of other fungi of medical interest.

Orientadores : Fumio Yokoya, Luiz Carlos Basso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-28T22:55:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paulillo_SileneCristinadeLima_D.pdf: 19959597 bytes, checksum: eca8391f2ae422d2c20626045858d0fb (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: O resumo podera ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic digital document / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:39Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-09Bitstream added on 2014-08-13T18:01:31Z : No. of bitstreams: 1 000746865_20141209.pdf: 573680 bytes, checksum: 39e1c41cf48b90af6f3ef88dc4a388af (MD5) / The production of fuel ethanol in Brazil is currently obtained by fermentation of sugar cane juices and/or molasses which have around 20% of dissolved solids leading the alcoholic yield to be smaller than that desired. Thus, large volumes of vinasse are generated, leading to high energy consumption in distillation. Taking into account the renewed interest in improving the process to obtain higher levels of ethanol, and reduce expenses associated with the process, new studies are being conducted to determine the adequacy of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae in the fermentation of concentrated media with fermentable sugars. In this context the present work aims to study the fermentation characteristics of five industrial strains, four used in Brazilian industries PE-2, CAT-1, SA-1 and BG, and a Ethanol REDTM, used in corn bioethanol production. The fermentation process was carried out in simple batch at 30° and 37°C with 250 rpm rotation. The sucrose concentration in the fermentation medium varied between 21 and 30% (w/v) focusing on Very High Gravity Fermentation Technology conditions - musts with high levels of fermentable sugars, with or without supplementation with peptone and yeast extract at pH 5.0; and with high cell density. The fermentation profile was assessed by determining parameters such as biomass, cell viability, consumption of carbon source, ethanol and production of used for trehalose. Wine with ethanol content ranging between 17 to 20% (v/v) was obtained at the end of the fermentation musts which had sucrose 30 to 35% (w/v). Supplementation with nitrogen source led to an improvement in the performance of industrial yeasts fermentation. High levels of trehalose were observed during the fermentation process as compared to the cells in stationary phase used as inoculum, as well as growing cells, suggesting that industrial strains have the ability to adapt to the stressing conditions of caused by high gravity...

Orientador: José Roberto Ernandes / Banca: Rubens Monti / Banca: João Atílio Jorge / Resumo:A produção de etanol combustível no Brasil é atualmente obtida através da fermentação de mostos de cana de açúcar que apresentam em torno de 20% de sólidos dissolvidos, levando a um rendimento alcoólico abaixo do desejado, gerando grandes volumes de vinhaça, induzindo a um grande consumo de energia na destilação. Com o interesse renovado na melhoria do processo para a obtenção de níveis mais altos de etanol e diminuição de gastos associados ao processo, novos estudos estão sendo realizados para verificar a adequação de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae na fermentação de meios concentrados em açúcares fermentescíveis. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar o perfil fermentativo de quatro linhagens industriais brasileiras; PE-2, CAT-1, SA-1 e BG, além da Ethanol REDTM, usada preferencialmente na produção de etanol a partir do milho. Neste trabalho os processos de fermentação foram conduzidos em batelada simples, a 30°C E 37°C e com rotação de 250 rpm, a concentração de sacarose no meio de fermentação variou entre 21, 30 e 35% (m/v), com ênfase às condições de Very High Gravity Fermentation Technology - Tecnologia de Fermentação de Mostos com Altos Teores de Açúcares Fermentescíveis, com ou sem suplementação com peptona e extrato de levedo, e com alta densidade celular. O perfil fermentativo foi avaliado determinando parâmetros de etanol e produção de trealose. Vinhos com teores de etanol variando de 16 a 20% (v/v) foram obtidos ao final da fermentação de mostos contendo sacarose de 30 a 35% (m/v). A completa utilização da sacarose e manutenção da viabilidade celular em experimentos com reciclo celular mostrou ser viável a aplicação da fermentação de mostos concentrados para a produção de bioetanol, pelo menos com sacarose 30%, a 30° C. A suplementação com fonte de nitrogênio pode induzir a melhoria no desempenho fermentativo das leveduras... / Abstract: The production of fuel ethanol in Brazil is currently obtained by fermentation of sugar cane juices and/or molasses which have around 20% of dissolved solids leading the alcoholic yield to be smaller than that desired. Thus, large volumes of vinasse are generated, leading to high energy consumption in distillation. Taking into account the renewed interest in improving the process to obtain higher levels of ethanol, and reduce expenses associated with the process, new studies are being conducted to determine the adequacy of industrial strains of Saccharomyces cerevisiae in the fermentation of concentrated media with fermentable sugars. In this context the present work aims to study the fermentation characteristics of five industrial strains, four used in Brazilian industries PE-2, CAT-1, SA-1 and BG, and a Ethanol REDTM, used in corn bioethanol production. The fermentation process was carried out in simple batch at 30° and 37°C with 250 rpm rotation. The sucrose concentration in the fermentation medium varied between 21 and 30% (w/v) focusing on Very High Gravity Fermentation Technology conditions - musts with high levels of fermentable sugars, with or without supplementation with peptone and yeast extract at pH 5.0; and with high cell density. The fermentation profile was assessed by determining parameters such as biomass, cell viability, consumption of carbon source, ethanol and production of used for trehalose. Wine with ethanol content ranging between 17 to 20% (v/v) was obtained at the end of the fermentation musts which had sucrose 30 to 35% (w/v). Supplementation with nitrogen source led to an improvement in the performance of industrial yeasts fermentation. High levels of trehalose were observed during the fermentation process as compared to the cells in stationary phase used as inoculum, as well as growing cells, suggesting that industrial strains have the ability to adapt to the stressing conditions of caused by high gravity... / Mestre

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-25T20:04:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 289069.pdf: 722734 bytes, checksum: e7dbc3e1a0538c756cfe254ff14b6aac (MD5) / Candida glabrata é uma levedura encontrada normalmente no trato digestivo humano e mucosas humanas, mas em pacientes imunocomprometidos pode causar infecções sistêmicas de alta morbidade e mortalidade. Esta levedura perdeu vários genes envolvidos no metabolismo de açúcares, sendo capaz de assimilar somente glicose e trealose, uma característica importante no diagnóstico laboratorial deste patógeno emergente. Nosso trabalho se propôs a analisar o metabolismo da trealose, e as enzimas intracelulares (trealase neutra e trealase ácida) envolvidas na degradação deste açúcar. Nossos resultados indicam que embora C. glabrata metabolize a trealose de forma semelhante a outras leveduras (a trealose acumulada na fase estacionária do crescimento é prontamente degradada após suprir as células com glicose), a atividade da trealase neutra nestas células aparentemente não seria responsável pela degradação da trealose uma vez que sua atividade não aumentava no período de maior hidrólise deste açúcar. Nossos resultados também mostram que a alta atividade da trealase ácida presente nas células de C. glabrata, atrapalha a determinação da trealase neutra nestas células (baseado apenas na diferença de pH ótimo da atividade). Neste contexto a utilização de uma linhagem (RY01) deletada no gene CgATH1, e portanto sem atividade trealase ácida, foi fundamental para melhor caracterizar a atividade trealase neutra nesta levedura, e sua possível regulação. Esta enzima não mostrou maior atividade na fase exponencial do crescimento quando a glicose está presente como fonte de carbono, nem ativação por AMPc via proteína cinase A, embora os resultados indiquem que a trealase neutra de C. glabrata degrada trealose na fase exponencial, pois na cepa deletada RY01 observou-se um queda brusca nos níveis de trealose durante esta fase do crescimento. Diferenças significativas foram também observadas na metabolização de trealose durante o estresse térmico em C. glabrata, quando comparada a outras leveduras. / Candida glabrata is a yeast normally found in the human digestive tract and mucous membranes, but in immunocompromised patients can cause systemic infections with high morbidity and mortality. This yeast has lost many genes involved in sugar metabolism, being able to assimilate only glucose and trehalose, an important feature in the laboratory diagnosis of this emerging pathogen. Our study aimed to analyze the metabolism of trehalose, and the intracellular enzymes (neutral trehalase and acid trehalase) involved in its hydrolysis. Our results indicate that although C. glabrata metabolizes trehalose in a similar way as other yeasts (trehalose accumulated during the stationary phase of growth is rapidly hydrolyzed after supplying the cells with glucose), the neutral trehalase activity in this cells seemed not to be involved in trehalose degradation as its activity did not increase during the period of higher sugar hydrolysis. Our results also show that the high activity of the acid trehalase present in C. glabrata cells, impairs the accurate determination of the neutral trehalase in these cells (based only in optimal pH activity differences). In this context, the use of a strain (RY01) deleted in the CgATH1 gene, and consequently without acid trehalase activity, was pivotal to better characterize the neutral trehalase activity in this cells, and its possible regulation. This enzyme did not show higher activity during the exponential phase of growth when glucose is present as carbon source, neither AMPc activation through protein cinase A, although our results indicate that the C. glabrata neutral trehalase hydrolyses trehalose during the exponential phase, since in the RY01 deleted strain a rapid drop in trehalose levels during this growth phase was observed. Significant differences were also observed in trehalose metabolism during heat stress in C. glabrata, when compared with other yeasts.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-23T12:58:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 240343.pdf: 1955445 bytes, checksum: fa69475304c95acd9e5f725520a68454 (MD5) / Neste trabalho foram utilizadas três cepas da levedura Saccharomyces cerevisiae como biocatalisadores em reações de redução enantiosseletivas de -cetoésteres e acetofenonas substituídas, em diferentes sistemas biocatalíticos. A fim de verificar a influência do metabolismo nas reações de redução, a cepa W303-1A foi cultivada em diferentes fontes de carbono. A proteção destas células utilizadas em n-hexano foi avaliada através da adição de açúcares (trealose e sacarose) e da imobilização em montmorilonita K10. A levedura industrial L70, cultivada em fontes de carbono respiráveis, foi utilizada em meio orgânico com adição de trealose, e em sistema bifásico (ácido cítrico-K2HPO4 pH 4,5). A imobilização desta cepa em Mont-K10 também foi avaliada. Por fim, utilizou-se o fermento de pão comercial na redução dos substratos carbonílicos em n-hexano, na forma livre e imobilizada, e em sistema bifásico. Alíquotas das reações foram retiradas periodicamente e analisadas por cromatografia gasosa quiral, a fim de determinar a percentagem de conversão e o excesso enantiomérico. De modo geral, a L70 mostrou-se um biocatalisador mais interessante para fins sintéticos do que a W303-1A, sendo que com o uso do fermento de pão foram obtidas maiores conversões a produtos quirais. Concluindo, o uso de S. cerevisiae como biocatalisador em reações de redução de compostos carbonílicos mostra-se como uma metodologia eficiente para a produção de álcoois quirais com alta pureza enantiomérica.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia / Made available in DSpace on 2012-10-22T11:58:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 231250.pdf: 874276 bytes, checksum: 846bed5b1854a38b996651a325db6b12 (MD5) / A levedura Candida glabrata tem sido apontada como importante patógeno emergente, sendo a segunda espécie mais comumente envolvida na etiologia das candidíases, infectando principalmente indivíduos imunodeficientes e imunocomprometidos. Devido à resistencia natural aos antifúngicos azólicos e à alta taxa de mortalidade associada a C. glabrata, os testes rápidos para sua identificação constituem importante ferramenta para a escolha terapêutica. Este microrganismo se destaca da maioria das leveduras por ser capaz de apenas consumir dois açúcares: a glicose e o dissacarídeo trealose (Gli 1-1 Gli). De fato, os testes rápidos de identificação têm como princípio justamente a habilidade desta levedura em hidrolisar as moléculas de trealose em duas de glicose. Dada a importância da metabolização da trealose para C. glabrata, no presente trabalho foi realizada uma caracterização bioquímica do catabolismo de trealose por esta levedura. Nossos resultados mostram que C. glabrata consome e fermenta eficientemente a trealose presente no meio de cultura, com parâmetros cinéticos e produtividades de biomassa e etanol semelhantes aos observados durante a fermentação da glicose. De fato, o crescimento em trealose não foi afetado pelo inibidor mitocondrial antimicina A, confirmando a eficiente fermentação deste dissacarídeo por C. glabrata. Na fase exponencial de crescimento em trealose foi detectado acúmulo de até 2,5 g/L de glicose no meio, indicando a possível hidrólise extracelular do dissacarídeo. A análise de uma possível atividade trealase na superficie das células revelou a presença de uma trealase ácida com um pH ótimo de 4,4. Esta enzima é sintetizada durante o crescimento em trealose, mas este açúcar não é aparentemente o indutor da atividade uma vez que níveis altos da enzima foram detectados também após o crescimento em glicerol, o mesmo ocorrendo durante a desrepressão das células após o consumo da glicose. Nossos resultados mostram também que C. glabrata secreta a trealase ácida para o meio de cultura, sendo que aproximadamente 30% da atividade enzimática total é secretada após o crescimento em trealose ou glicerol. A trealase ácida secretada para o meio de cultura apresenta uma massa molecular aparente, deduzida por filtração em gel, de 275 kDa na sua forma ativa. Entretanto, a análise de proteínas através de eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE) revelou uma proteína com massa molecular aparente de aproximadamente 130 kDa, que pelo padrão de migração e forte ligação à lectina concanavalina A, indica tratar-se de uma glicoproteína. Esta glicoproteína apresenta uma massa molecular coincidente com o peso teórico da proteína codificada pelo gene CAGLOK05137g de C. glabrata, gene com ~60% de homologia a outras trealases ácidas de leveduras, sugerindo que a enzima ativa seja um dímero. A trealase ácida secretada por C. glabrata apresentou alta afinidade pela trealose, com valores de Km e Vmax de 3,4 mM e 80 U (mg de proteína)-1, respectivamente, além de possuir relativa estabilidade, mostrando-se altamente específica para seu substrato, a trealose. The yeast C. glabrata has been recognized as an important emergent pathogen, and is considered the second most common cause of candidiasis, infecting predominantly immunodeficient and immunocompromised patients. Due to its low sensitivity to antifungal azoles and high mortality, rapid identification tests are important in order to choose the appropriate therapeutic treatment. This microorganism differs from other yeasts because it assimilates only two sugars: glucose and the disaccharide trehalose (Glu 1-1 Glu). Indeed, the rapid identification tests are based on the ability of this yeast to hydrolyze trehalose into two molecules of glucose. Due to the importance that trehalose metabolism has for C. glabrata, in this work a biochemical characterization of trehalose catabolism by this yeast was performed. Our results show that C. glabrata consumes and ferments efficiently the trehalose present in the medium, with kinetic parameters and biomass and ethanol productivities similar to those observed during glucose fermentation. Indeed, growth on trehalose was not affected by the mitochondrial inhibitor antimycin A, confirming the efficient fermentation of this disaccharide by C. glabrata. During the exponential growth phase on trehalose up to 2.5 g/L of glucose was accumulated in the medium, suggesting the possible extracellular hydrolysis of the disaccharide. The analysis of a putative trehalase activity at the cell surface revealed the presence of an acid trehalase with pH optimum of 4.4. This enzyme is synthesized during growth on trehalose, but this sugar seems not to be an inducer of the activity as high levels of this enzyme were also detected after growth on glycerol, the same occurring during the derepression of the cells after glucose consumption. Our results also indicate that C. glabrata secretes the acid trehalase into the medium, and approximately 30% of the total enzymatic activity is secreted after growth on trehalose or glycerol. The acid trehalase secreted into the culture medium shows an apparent molecular mass, deduced by gel filtration, of 275 kDa in its native form. However, the analysis of proteins by denaturant gel electrophoresis (SDS-PAGE) reveled a protein with a molecular mass of approximately 130 kDa, which due to its migration pattern and strong binding to concanavalin A, indicates is a glycoprotein. This glycoprotein has a molecular mass coincident with the theorical weight of the protein encoded by the C. glabrata CAGLOK05137g gene, a gene with ~60% of homology with other yeast acid trehalases, suggesting that the active enzyme is a dimer. The acid trehalase secreted by C. glabrata shows a relative high affinity for trehalose, with Km and Vmax values of 3.4 mM and 80 U (mg of protein)-1, respectively. In addition, this enzyme was relatively stable, and seem to be highly specific for its substrate, trehalose.

As leveduras são de relevante importância dentro da agroindústria sucroalcooleira devido sua participação no processo fermentativo de produção de álcool. Deste modo, faz-se necessário o conhecimento deste agente fermentativo com destaque para Saccharomyces cerevisiae, principal gênero. O objetivo deste trabalho foi estudar a linhagem de levedura S. cerevisiae Y904, exposta a condições não proliferantes, após fermentação em meio que sofreu adição de óleo vegetal e sua possível correlação com manutenção da viabilidade celular. Foram realizadas análises para contagem de unidades formadoras de colônias, viabilidade celular, concentração celular, nitrogênio total na levedura e no meio, carboidratos totais, trealose e glicogênio. As leveduras submetidas a condições não proliferantes apresentaram menores teores de carboidratos totais, com destaque para trealose e glicogênio, em relação às leveduras comerciais. Saccharomyces cerevisiae sofreu queda de viabilidade acentuada após 24 h em solução fisiológica, em condições não proliferantes, sob agitação de 90 rpm e temperatura de 30 ± 1°C, seguida de uma acentuada autólise a partir de 120 h (5°dia), provavelmente, devido ao teor de carboidratos de reserva da célula que se encontravam em valores extremamente baixos, da ordem de 0,15 mg de trealose em 100 mg da matéria seca e 4 mg de glicogênio em 100 mg da matéria seca. A partir desse ponto entraram em total desorganização celular. / Yeast is highly important in sugar and alcohol agroindustry due to its role in the fermentative process of alcohol production. Thus, it is necessary to know this microorganism, most specially the Saccharomyces cerevisiae, the main species. The objective of this work was to study the strain Y904 of the yeast Saccharomyces cerevisiae under non-proliferating conditions after fermentation in a medium in which it was added vegetable oil and verify its possible correlation with the maintenance of the cellular viability. Analyses were performed in order to determine colony forming units, cellular viability, cellular concentration, total nitrogen in yeast and in medium, total carbohydrates and trehalose and glycogen contents. The yeast submitted to non-proliferating conditions presented a lower content of total carbohydrates, specially trehalose and glycogen, when compared to commercial yeasts. The viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae Y904 markedly decreased after 24 hours in physiological solution under non-proliferating conditions in a shaker for 90 rpm at 30 ± 1°C. It was observed an accentuated autolysis from the 120 th hour (5 th day) on. This was probably because of the very low content of the carbohydrates of reserve in the cells, 0.15 mg of trehalose and 4.0 mg of glycogen in 100 mg of dry weight. From this point the cells began a total cellular disorganization.

Entre centenas de espécies brasileiras de pirilampos, o Pyrearinus termitilluminans é o único cujo ciclo de vida se passa integralmente nos cupinzeiros luminosos localizados no Brasil central claramente observados durante a estação das chuvas. A emissão de luz nos elaterídeos tem a função de atração de presas para a alimentação. A bioluminescência desses animais desaparece nos meses de seca juntamente com a nuvem de presas aladas. Assim, o metabolismo de trealose aqui estudado poderia prover informações sobre da capacidade da larva de sobreviver em ambientes edáficos. As concentrações de trealose e glicose são determinadas nos extratos de larvas com um sistema DIONEX® de cromatografia iônica. A trealase foi medida com 17 mM de trealose. O glicogênio foi estimado com uma amiloglicosidase. Paralelamente o estresse oxidativo associado com a restrição de água foi monitorado através da determinação do TBARS, juntamente com a catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase. Nas larvas submetidas ao ensaio na câmara climática (25% de umidade) a trealase (159,69±10,95 mU/animal) estava 80 vezes mais alta do que a do grupo controle (2,02±1,41mU/animal). As larvas sob estresse apresentaram distintos níveis de trealose e glicose (29,85±3,20 µmol/animal e 18,27±0,82 µmol/animal, respectivamente) quando comparadas com o grupo controle (64,61±1,54 µmol/animal e 2,16±0,11 µmol/animal, respectivamente). A elevação dos níveis das enzimas antioxidantes (4, 4,3 e 2,4 vezes respectivamente) com níveis invariáveis de TBARS apontam para a ação antioxidante contra a produção elevada de espécies reativas de oxigênio. Os insetos submetidos à restrição hídrica perderam aproximadamente 35% do peso. O aumento da atividade da trealase, com concomitante decréscimo dos níveis de trealose, sugerem que esse açúcar poderia ser usado como fonte hídrica. Entretanto, os níveis de glicose, 10 vezes mais elevados no grupo sob estresse poderia ser usado na via de biossíntese de trealose uma vez que os níveis de glicogênio estão diminuídos. As mudanças no metabolismo de trealose e o desbalanço no equilíbrio redox, poderiam fornecer importantes informações fisiológicas desses insetos sob estresse hídrico. / The life cycle of Pyrearinus termitilluminans (Coleoptera: Elateridae) takes place totally into the so-called luminous termite mounds located in Central Brazil, which are clearly observed during the rainy season. Light emission by the elaterid larvae acts like a trap attracting flying insects. The bioluminescence disappears in the dry months together with the food supply. The trehalose metabolism study described here could provide information about larva capacity to survive throughout hard climatic changes. Trehalose and glucose concentrations are determined in the larva extracts with a DIONEX® ion chromatography system. The trehalase activity was measured with 17 mM trehalose. The glycogen level was estimated with amyloglucosidase. In parallel oxidative stress associated to water deprivation was evaluated through determination of TBARS and the catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activities. In larvae submitted to dryness in a growth chamber (25% humidity) we have found 80-fold higher trehalase activity (159.69±10.95 mU/animal) than in the control group raised under room conditions (2.02±1.41 mU/animal). Stressed larvae showed distinct trehalose and glucose contents (29.85±3.20 µmol/animal and 18.27±0.82 µmol/animal, respectively) when compared with the control group(64.61±1.54 µmol/animal and 2.16±0.11 µmol/animal, respectively), whereas the glycogen level was lower (11.53±2.01 mg/animal and 28.26±2.31 mg/animal, respectively). Elevation of the antioxidant enzyme levels (4-fold, 4.3-fold and 2.4-fold respectively) with maintenance of TBARS pointed to depletion to exacerbated production of reactive oxygen species. Insects submitted to water restriction lost about 35% wet weight. The observed increase of trehalase activity and concomitant decrease of trehalose level suggest that trehalose could be used as a metabolic water source. Moreover, the 10-fold higher glucose level in the stressed group could be used by the trehalose biosynthetic pathway as the glycogen level decreases in parallel. The trehalose metabolic and redox balance changes described here may shed light on the yet unknown physiological mechanisms of larval elaterid adaptation to water stress.

A poluição por metais pesados é um dos mais sérios problemas ambientais da atualidade devido tanto ao aumento de sua aplicação, como de sua natureza imutável. A importância em se estudar os metais, deve-se aos seus intensos efeitos tóxicos para o homem e todos os outros seres vivos. O cádmio é um metal não essencial e representa um grande potencial de danos a seres humanos e ao meio ambiente. A trealose é um dissacarídeo que participa como protetor em microrganismos em diferentes condições de estresses. Neste trabalho foi analisada a influência da trealose em resposta ao estresse oxidativo induzido pelo cádmio em linhagens de Saccharomyces cerevisiae. As linhagens utilizadas neste estudo são deficientes em genes importantes no metabolismo de trealose, na síntese (S. cerevisaie tps1) e na degradação (S. cerevisaie nth1) do dissacarídeo, desta forma foi possível analisar o papel da trealose frente ao estresse induzido pelo cádmio. Inicialmente, analisou-se o crescimento das linhagens em meio líquido com diferentes concentrações de cádmio, onde observou-se inibição no crescimento. A tolerância ao CdCl2 foi realizada através do plaqueamento, verificou-se que não existe formação de colônias em concentração superior a 25ppm. A incorporação de cádmio é maior quando foram usadas células viáveis coletadas na fase logarítmica. A linhagem tps1 possui uma incorporação de cádmio 3 vezes menor quando comparada às demais linhagens. A adição de glutationa reduzida ao meio extracelular não provocou alteração de incorporação de cádmio, porém ao adicionarmos aminoácidos (que formam a glutationa) ocorreu diminuição da incorporação em todas as linhagens. Quanto a formação de radicais livres intracelulares obtivemos que a linhagem tps1, possui um alto nível de oxidação celular mesmo na condição sem cádmio e quando exposta ao mesmo, apresentou um aumento na oxidação apesar de uma incorporação menor do metal que as demais linhagens. Análise da peroxidação lipídica realizada antes e após exposição das células ao cádmio, mostraram danos aos lipídeos. Observamos que células da linhagem nth1 (excesso de trealose) também sofrem esses danos, ou seja, a presença de um excesso de trealose não impediu a presença de danos aos lipídeos. Células da linhagem tps1 apresentaram maior dano lipídico que as demais linhagens evidenciando que, a ausência da trealose deixa os lipídeos mais susceptíveis a alterações deletérias. Procedeu-se também a análise da carbonilação de proteína onde observamos que na presença de cádmio não ocorreu carbonilação de proteínas, apenas a linhagem nth1 na concentração de 800ppm apresentou proteínas carboniladas, fato este relacionado a grande quantidade de radicais livres formados. As três linhagens após exposição à concentração de 50ppm de cádmio, apresentaram um aumento nos níveis de resíduos sulfidrílicos enquanto que na concentração de 800ppm apresentaram queda dos resíduos sulfidrílicos. Os resultados apresentados neste trabalho ajudaram a compreender o papel da trealose em células de S. cerevisiae frente ao estresse causado pelo cloreto de cádmio. / Pollution with heavy metals is one of the most serious environmental problems nowadays, which had in such a way to the increase of its application as, of its imutable nature. The importance of studying metals is directly related to intensive toxic effects to all living beings in our world. Cadmium is a non essential metal and represents a great danger to the human beings and also to the environmental. Trehalose is a disaccharide that participates as a protector in different conditions of stress. In this work the influence of trehalose in oxidative stress induced by cadmium was analyzed in different strains of Saccharomyces cerevisiae. The strains used in this study were not effective in important genes of the metabolism of trehalose, in the synthesis (S. cerevisaie tps1) and also in the degradation (S. cerevisaie nth1), so it was possible to analyze the performance of the trehalose in relation to the stress induced for cadmium. Initially the growth with different cadmium concentrations in medium liquid was analyzed, and the growth inhibition was observed. The tolerance to the CdCl2 was carried out by the growth on plates and one could observe that the formation was not present in concentrations up to 25ppm. Cells collected in the logarithmic phase had bigger cadmium incorporation. The strains tps1 presented a lower cadmium incorporation (3 times) when compared with other strains. The addition of reduced glutathione to the extracellular did not cause any alteration of in the cadmium incorporation, however, by adding amino acids, the ones which form glutathione, a reduction of the cadmium incorporation in all the strains occurred. The tps1 strains showed high level of cellular oxidation in control condition (without cadmium), and the cadmium incorporation showed an increase in the oxidation.Analyses of the lipid peroxidation carried out before and after exposition of the cells to cadmium showed damages to the lipids. We observe that cells of the strain nth1 (excess of trehalose) also suffer these damages. The presence of an excess of trehalose protected the lipids. Cells of the strain tps1 presented greater lipidic damage than the other strains, making clear that the absence of trehalose make the lipids more probable to have deleterious alterations. It was also performed a protein carbonilation analysis at cadmium presence and it did not induce a carbonilation of proteins. The stains nth1, whose concentration was 800ppm, presented carbonilated protein due to the high levels of ROS. The three strains after the exposition of 50ppm of cadmium showed an increase while on the concentration of 800ppm, it presented a drop on the levels of sulphydryl residues. The results presented in this work helped to understand the role of trehalose on Saccharomyces cerevisiae cells during cadmium stress.