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Tipagem molecular de leveduras associadas a vinhos do sul do Brasil : padronização de MSP-PCR Fingerprinting

Ramírez Castrillón, Mauricio January 2012 (has links)
A identificação das leveduras participantes no processo fermentativo de vinhos comerciais e artesanais permite inferir as propriedades organolépticas, concentração de álcool e qualidade do produto final. Assim, a construção de uma base de dados que permita discriminar e identificar leveduras associadas a vinhos é necessário para monitorar o processo fermentativo e controlar os seus contaminantes. A principal proposta deste trabalho foi avaliar a técnica MSP-PCR Fingerprinting usando o oligonucleotídeo iniciador (GTG)5 para discriminar espécies de leveduras associadas a vinho no sul do Brasil. O protocolo foi otimizado usando três cepas variando as concentrações de dNTPs, MgCl2, oligonucleotídeo iniciador e DNA. Foram analisadas 113 cepas de leveduras associadas a vinhos dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Brasil). A análise de clustering do tamanho e distribuição das bandas, baseada no algoritmo QAPgrid, usando distâncias euclidianas, gerou 20 agrupamentos com 22 perfis genéticos. A comparação das sequências da região D1/D2 do gene 26S rDNA e/ou região ITS com a base de dados Genbank usando o algoritmo Mega Blast permitiu identificar 10 espécies dos gêneros Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, entre outros, associadas a vinhos. Assim, o algoritmo QAPgrid foi capaz de analisar a variabilidade inter e intraespecífica dos 113 isolados de forma não aleatória e dependente da similaridade genética. Se propõe o agrupamento molecular usando o primer (GTG)5 associado ao sequenciamento de 10% dos isolados dentro de cada grupo como ferramenta para identificar e monitorar as populações de leveduras de vinhos. / The identification of yeasts involved in commercial and artisanal alcoholic fermentation allows inferences concerning the organoleptic properties and quality of the final product. Thus, the construction of a database that allows discriminating and identifying the wine yeasts is necessary to monitor the fermentation process and control their contaminants. The main purpose of this study was to evaluate the MSP-PCR fingerprinting technique using the primer (GTG)5 for discrimination of wine yeast species in Southern Brazil. The protocol was optimized using three strains varying concentrations of dNTPs mix, MgCl2, primer and DNA. We analyzed 113 strains of yeasts associated with wine from the states of Santa Catarina and Rio Grande do Sul (Brazil). The analysis of cluster size and distribution of bands, based on the QAPgrid algorithm using Euclidean distances generated 20 clusters with 22 genetic profiles. The comparison of sequences of the D1/D2 domain of the gene 26S rDNA and/or ITS region with the GenBank database using the Blast algorithm identified 10 species of the genera Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, and others associated with the wine. The algorithm QAPgrid was able to analyze inter and intra-specific variability of 113 isolates in a non-random manner dependent on genetic similarity. We propose the molecular clustering using the primer (GTG)5 followed by sequencing of 10% of the isolates within each group can function as a tool for identifying and monitoring the wine yeast populations.
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Seleção de leveduras lipolíticas isoladas de bromélias e produção e caracterização de lipase bruta de Debaryomyces melissophilus Bl81 / Selection of lipolytic yeasts isolated from bromeliads and production and characterization of the Debaryomyces melissophilus BI81 lipase

Lock, Luiza Lux January 2007 (has links)
As leveduras, devido a sua versatilidade, facilidade de cultivo, menor propensão à contaminação e por oferecerem menor risco à saúde pública, têm sido alvo de inúmeras pesquisas direcionadas à produção de enzimas para aplicação em processos industriais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade catalítica de lipases produzidas por leveduras isoladas de folhas de bromélias no Parque de Itapuã visando sua aplicação na biossíntese de ésteres. Realizou-se a triagem das leveduras através das técnicas: crescimento em Tween 80 como única fonte de carbono, fluorimetria utilizando rodamina B e crescimento em meio de cultura contendo cloreto de cálcio. Para a levedura selecionada como melhor produtora lipase, foi feita a curva de crescimento e a caracterização da enzima. Após, a enzima foi submetida ao ensaio de imobilização em poliestireno comercial e em polipropileno poroso (sintetizado durante a pesquisa). Finalmente, foram selecionadas amostras de leveduras que apresentaram atividade lipolítica significativa e uma amostra de baixa atividade para a realização do ensaio de correlação entre o espectro de FT-IR da biomassa microbiana cultivada com ou sem rodamina B e a atividade lipolítica medida através de titrimetria. Verificou-se que leveduras isoladas de bromélias do parque de Itapuã, RS são boas fontes de lipases microbianas. A levedura Debaryomyces melissophilus B181 foi selecionada como a melhor produtora de lipase extracelular, a qual possui características de uma lipase neutra mesofílica com dependência de fatores nutricionais semelhante à Candida sp e com baixa estabilidade frente aos solventes de transesterificação metanol e etanol, porém com maior especificidade de substrato para o óleo de mamona, tornando-se atrativa para aplicação na obtenção de biodiesel a partir deste óleo. Comprovou-se a eficiência do polímero polipropileno poroso, usado como suporte para lipases, através da imobilização da lipase comercial PS AMANO, porém não foi possível imobilizar a lipase em estudo nas condições testadas. A técnica de FT-IR acoplada à quimiometria mostrou-se adequada para diferenciar as amostras de leveduras quanto ao seu perfil de impressão digital metabólico, porém não em relação ao tempo de cultivo. / Yeasts, due to their versatility, culture facilities, less propensity to contamination and for being safer than other microorganisms to the human health, have been the aim of several researches about enzymes production for industrial applications. The aim of this project is to evaluate the catalytic activity of lipases produced by yeasts isolated from the phylloplane of bromeliads in Parque Itapuã for its application in the biosynthesis of esters. Yeasts were selected by the methods: growth using Tween 80 as the only carbon source; fluorimetry using rhodamin B; and growth in media with CaCl2. To the selected yeast as the best lipase producer, the growth curve and the enzyme characterization were performed. After that, the enzyme was submitted to the immobilization technique in commercial polystyrene and polypropylene synthesized during our work. Then, the yeasts samples that had shown a good lipolytic activity and one with a bad activity were selected to the experiment of correlation between the FT-IR spectrum of the microbial biomass cultivated with or without rhodamin B and the lipolytic activity measured by titrimetry. We verified that yeasts isolated from bromeliads from Parque Itapuã, RS, are a good source for microbial lipases. The yeast Debaryomyces melissophilus B181 was selected as the best extracellular lipase producer, which is characterized as a neutral and mesophylic lipase with nutritional dependence similar to Candida sp. The lipase show low stability to the transesterification solvents methanol and ethanol, but has high substrate specificity to castor oil, becoming attractive to biodiesel production from this oil. We proved the efficiency of the polypropylene synthesized through the immobilization of the commercial lipase PS AMANO, but we could not immobilize the Debaryomyces melissophilus B181 lipase in the tested conditions. The FT-IR technique coupled to chemometrics seemed to be appropriate to differentiate yeasts samples by their metabolic fingerprint profile, but not related to the cultivation period.
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Seleção de leveduras lipolíticas isoladas de bromélias e produção e caracterização de lipase bruta de Debaryomyces melissophilus Bl81 / Selection of lipolytic yeasts isolated from bromeliads and production and characterization of the Debaryomyces melissophilus BI81 lipase

Lock, Luiza Lux January 2007 (has links)
As leveduras, devido a sua versatilidade, facilidade de cultivo, menor propensão à contaminação e por oferecerem menor risco à saúde pública, têm sido alvo de inúmeras pesquisas direcionadas à produção de enzimas para aplicação em processos industriais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade catalítica de lipases produzidas por leveduras isoladas de folhas de bromélias no Parque de Itapuã visando sua aplicação na biossíntese de ésteres. Realizou-se a triagem das leveduras através das técnicas: crescimento em Tween 80 como única fonte de carbono, fluorimetria utilizando rodamina B e crescimento em meio de cultura contendo cloreto de cálcio. Para a levedura selecionada como melhor produtora lipase, foi feita a curva de crescimento e a caracterização da enzima. Após, a enzima foi submetida ao ensaio de imobilização em poliestireno comercial e em polipropileno poroso (sintetizado durante a pesquisa). Finalmente, foram selecionadas amostras de leveduras que apresentaram atividade lipolítica significativa e uma amostra de baixa atividade para a realização do ensaio de correlação entre o espectro de FT-IR da biomassa microbiana cultivada com ou sem rodamina B e a atividade lipolítica medida através de titrimetria. Verificou-se que leveduras isoladas de bromélias do parque de Itapuã, RS são boas fontes de lipases microbianas. A levedura Debaryomyces melissophilus B181 foi selecionada como a melhor produtora de lipase extracelular, a qual possui características de uma lipase neutra mesofílica com dependência de fatores nutricionais semelhante à Candida sp e com baixa estabilidade frente aos solventes de transesterificação metanol e etanol, porém com maior especificidade de substrato para o óleo de mamona, tornando-se atrativa para aplicação na obtenção de biodiesel a partir deste óleo. Comprovou-se a eficiência do polímero polipropileno poroso, usado como suporte para lipases, através da imobilização da lipase comercial PS AMANO, porém não foi possível imobilizar a lipase em estudo nas condições testadas. A técnica de FT-IR acoplada à quimiometria mostrou-se adequada para diferenciar as amostras de leveduras quanto ao seu perfil de impressão digital metabólico, porém não em relação ao tempo de cultivo. / Yeasts, due to their versatility, culture facilities, less propensity to contamination and for being safer than other microorganisms to the human health, have been the aim of several researches about enzymes production for industrial applications. The aim of this project is to evaluate the catalytic activity of lipases produced by yeasts isolated from the phylloplane of bromeliads in Parque Itapuã for its application in the biosynthesis of esters. Yeasts were selected by the methods: growth using Tween 80 as the only carbon source; fluorimetry using rhodamin B; and growth in media with CaCl2. To the selected yeast as the best lipase producer, the growth curve and the enzyme characterization were performed. After that, the enzyme was submitted to the immobilization technique in commercial polystyrene and polypropylene synthesized during our work. Then, the yeasts samples that had shown a good lipolytic activity and one with a bad activity were selected to the experiment of correlation between the FT-IR spectrum of the microbial biomass cultivated with or without rhodamin B and the lipolytic activity measured by titrimetry. We verified that yeasts isolated from bromeliads from Parque Itapuã, RS, are a good source for microbial lipases. The yeast Debaryomyces melissophilus B181 was selected as the best extracellular lipase producer, which is characterized as a neutral and mesophylic lipase with nutritional dependence similar to Candida sp. The lipase show low stability to the transesterification solvents methanol and ethanol, but has high substrate specificity to castor oil, becoming attractive to biodiesel production from this oil. We proved the efficiency of the polypropylene synthesized through the immobilization of the commercial lipase PS AMANO, but we could not immobilize the Debaryomyces melissophilus B181 lipase in the tested conditions. The FT-IR technique coupled to chemometrics seemed to be appropriate to differentiate yeasts samples by their metabolic fingerprint profile, but not related to the cultivation period.
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Tipagem molecular de leveduras associadas a vinhos do sul do Brasil : padronização de MSP-PCR Fingerprinting

Ramírez Castrillón, Mauricio January 2012 (has links)
A identificação das leveduras participantes no processo fermentativo de vinhos comerciais e artesanais permite inferir as propriedades organolépticas, concentração de álcool e qualidade do produto final. Assim, a construção de uma base de dados que permita discriminar e identificar leveduras associadas a vinhos é necessário para monitorar o processo fermentativo e controlar os seus contaminantes. A principal proposta deste trabalho foi avaliar a técnica MSP-PCR Fingerprinting usando o oligonucleotídeo iniciador (GTG)5 para discriminar espécies de leveduras associadas a vinho no sul do Brasil. O protocolo foi otimizado usando três cepas variando as concentrações de dNTPs, MgCl2, oligonucleotídeo iniciador e DNA. Foram analisadas 113 cepas de leveduras associadas a vinhos dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Brasil). A análise de clustering do tamanho e distribuição das bandas, baseada no algoritmo QAPgrid, usando distâncias euclidianas, gerou 20 agrupamentos com 22 perfis genéticos. A comparação das sequências da região D1/D2 do gene 26S rDNA e/ou região ITS com a base de dados Genbank usando o algoritmo Mega Blast permitiu identificar 10 espécies dos gêneros Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, entre outros, associadas a vinhos. Assim, o algoritmo QAPgrid foi capaz de analisar a variabilidade inter e intraespecífica dos 113 isolados de forma não aleatória e dependente da similaridade genética. Se propõe o agrupamento molecular usando o primer (GTG)5 associado ao sequenciamento de 10% dos isolados dentro de cada grupo como ferramenta para identificar e monitorar as populações de leveduras de vinhos. / The identification of yeasts involved in commercial and artisanal alcoholic fermentation allows inferences concerning the organoleptic properties and quality of the final product. Thus, the construction of a database that allows discriminating and identifying the wine yeasts is necessary to monitor the fermentation process and control their contaminants. The main purpose of this study was to evaluate the MSP-PCR fingerprinting technique using the primer (GTG)5 for discrimination of wine yeast species in Southern Brazil. The protocol was optimized using three strains varying concentrations of dNTPs mix, MgCl2, primer and DNA. We analyzed 113 strains of yeasts associated with wine from the states of Santa Catarina and Rio Grande do Sul (Brazil). The analysis of cluster size and distribution of bands, based on the QAPgrid algorithm using Euclidean distances generated 20 clusters with 22 genetic profiles. The comparison of sequences of the D1/D2 domain of the gene 26S rDNA and/or ITS region with the GenBank database using the Blast algorithm identified 10 species of the genera Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, and others associated with the wine. The algorithm QAPgrid was able to analyze inter and intra-specific variability of 113 isolates in a non-random manner dependent on genetic similarity. We propose the molecular clustering using the primer (GTG)5 followed by sequencing of 10% of the isolates within each group can function as a tool for identifying and monitoring the wine yeast populations.
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Tipagem molecular de leveduras associadas a vinhos do sul do Brasil : padronização de MSP-PCR Fingerprinting

Ramírez Castrillón, Mauricio January 2012 (has links)
A identificação das leveduras participantes no processo fermentativo de vinhos comerciais e artesanais permite inferir as propriedades organolépticas, concentração de álcool e qualidade do produto final. Assim, a construção de uma base de dados que permita discriminar e identificar leveduras associadas a vinhos é necessário para monitorar o processo fermentativo e controlar os seus contaminantes. A principal proposta deste trabalho foi avaliar a técnica MSP-PCR Fingerprinting usando o oligonucleotídeo iniciador (GTG)5 para discriminar espécies de leveduras associadas a vinho no sul do Brasil. O protocolo foi otimizado usando três cepas variando as concentrações de dNTPs, MgCl2, oligonucleotídeo iniciador e DNA. Foram analisadas 113 cepas de leveduras associadas a vinhos dos estados de Santa Catarina e Rio Grande do Sul (Brasil). A análise de clustering do tamanho e distribuição das bandas, baseada no algoritmo QAPgrid, usando distâncias euclidianas, gerou 20 agrupamentos com 22 perfis genéticos. A comparação das sequências da região D1/D2 do gene 26S rDNA e/ou região ITS com a base de dados Genbank usando o algoritmo Mega Blast permitiu identificar 10 espécies dos gêneros Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, entre outros, associadas a vinhos. Assim, o algoritmo QAPgrid foi capaz de analisar a variabilidade inter e intraespecífica dos 113 isolados de forma não aleatória e dependente da similaridade genética. Se propõe o agrupamento molecular usando o primer (GTG)5 associado ao sequenciamento de 10% dos isolados dentro de cada grupo como ferramenta para identificar e monitorar as populações de leveduras de vinhos. / The identification of yeasts involved in commercial and artisanal alcoholic fermentation allows inferences concerning the organoleptic properties and quality of the final product. Thus, the construction of a database that allows discriminating and identifying the wine yeasts is necessary to monitor the fermentation process and control their contaminants. The main purpose of this study was to evaluate the MSP-PCR fingerprinting technique using the primer (GTG)5 for discrimination of wine yeast species in Southern Brazil. The protocol was optimized using three strains varying concentrations of dNTPs mix, MgCl2, primer and DNA. We analyzed 113 strains of yeasts associated with wine from the states of Santa Catarina and Rio Grande do Sul (Brazil). The analysis of cluster size and distribution of bands, based on the QAPgrid algorithm using Euclidean distances generated 20 clusters with 22 genetic profiles. The comparison of sequences of the D1/D2 domain of the gene 26S rDNA and/or ITS region with the GenBank database using the Blast algorithm identified 10 species of the genera Saccharomyces, Dekkera, Candida, Pichia, Torulaspora, and others associated with the wine. The algorithm QAPgrid was able to analyze inter and intra-specific variability of 113 isolates in a non-random manner dependent on genetic similarity. We propose the molecular clustering using the primer (GTG)5 followed by sequencing of 10% of the isolates within each group can function as a tool for identifying and monitoring the wine yeast populations.
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Seleção de leveduras lipolíticas isoladas de bromélias e produção e caracterização de lipase bruta de Debaryomyces melissophilus Bl81 / Selection of lipolytic yeasts isolated from bromeliads and production and characterization of the Debaryomyces melissophilus BI81 lipase

Lock, Luiza Lux January 2007 (has links)
As leveduras, devido a sua versatilidade, facilidade de cultivo, menor propensão à contaminação e por oferecerem menor risco à saúde pública, têm sido alvo de inúmeras pesquisas direcionadas à produção de enzimas para aplicação em processos industriais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade catalítica de lipases produzidas por leveduras isoladas de folhas de bromélias no Parque de Itapuã visando sua aplicação na biossíntese de ésteres. Realizou-se a triagem das leveduras através das técnicas: crescimento em Tween 80 como única fonte de carbono, fluorimetria utilizando rodamina B e crescimento em meio de cultura contendo cloreto de cálcio. Para a levedura selecionada como melhor produtora lipase, foi feita a curva de crescimento e a caracterização da enzima. Após, a enzima foi submetida ao ensaio de imobilização em poliestireno comercial e em polipropileno poroso (sintetizado durante a pesquisa). Finalmente, foram selecionadas amostras de leveduras que apresentaram atividade lipolítica significativa e uma amostra de baixa atividade para a realização do ensaio de correlação entre o espectro de FT-IR da biomassa microbiana cultivada com ou sem rodamina B e a atividade lipolítica medida através de titrimetria. Verificou-se que leveduras isoladas de bromélias do parque de Itapuã, RS são boas fontes de lipases microbianas. A levedura Debaryomyces melissophilus B181 foi selecionada como a melhor produtora de lipase extracelular, a qual possui características de uma lipase neutra mesofílica com dependência de fatores nutricionais semelhante à Candida sp e com baixa estabilidade frente aos solventes de transesterificação metanol e etanol, porém com maior especificidade de substrato para o óleo de mamona, tornando-se atrativa para aplicação na obtenção de biodiesel a partir deste óleo. Comprovou-se a eficiência do polímero polipropileno poroso, usado como suporte para lipases, através da imobilização da lipase comercial PS AMANO, porém não foi possível imobilizar a lipase em estudo nas condições testadas. A técnica de FT-IR acoplada à quimiometria mostrou-se adequada para diferenciar as amostras de leveduras quanto ao seu perfil de impressão digital metabólico, porém não em relação ao tempo de cultivo. / Yeasts, due to their versatility, culture facilities, less propensity to contamination and for being safer than other microorganisms to the human health, have been the aim of several researches about enzymes production for industrial applications. The aim of this project is to evaluate the catalytic activity of lipases produced by yeasts isolated from the phylloplane of bromeliads in Parque Itapuã for its application in the biosynthesis of esters. Yeasts were selected by the methods: growth using Tween 80 as the only carbon source; fluorimetry using rhodamin B; and growth in media with CaCl2. To the selected yeast as the best lipase producer, the growth curve and the enzyme characterization were performed. After that, the enzyme was submitted to the immobilization technique in commercial polystyrene and polypropylene synthesized during our work. Then, the yeasts samples that had shown a good lipolytic activity and one with a bad activity were selected to the experiment of correlation between the FT-IR spectrum of the microbial biomass cultivated with or without rhodamin B and the lipolytic activity measured by titrimetry. We verified that yeasts isolated from bromeliads from Parque Itapuã, RS, are a good source for microbial lipases. The yeast Debaryomyces melissophilus B181 was selected as the best extracellular lipase producer, which is characterized as a neutral and mesophylic lipase with nutritional dependence similar to Candida sp. The lipase show low stability to the transesterification solvents methanol and ethanol, but has high substrate specificity to castor oil, becoming attractive to biodiesel production from this oil. We proved the efficiency of the polypropylene synthesized through the immobilization of the commercial lipase PS AMANO, but we could not immobilize the Debaryomyces melissophilus B181 lipase in the tested conditions. The FT-IR technique coupled to chemometrics seemed to be appropriate to differentiate yeasts samples by their metabolic fingerprint profile, but not related to the cultivation period.
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Biodiversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de bromélias do Parque de Itapuã-Viamão/RS

Landell, Melissa Fontes January 2006 (has links)
As bromélias abrigam uma grande diversidade de organismos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes presentes no filoplano de bromélias e avaliar seu potencial biotecnológico. Foram coletadas 50 amostras de folhas de bromélias no Parque Estadual de Itapuã/RS (Praia da Pedreira e Praia de Fora). Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5%Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem, amostras de água dos tanques de bromélias e de flores foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados pela metodologia convencional. A análise da biodiversidade foi realizada através do índice de Shannon-Weaver. Dos 191 isolados obtidos, 182 foram identificados, sendo 11% leveduras de afinidade ascomicética, 67,6% de afinidade basidiomicética, 19,8% de fungos leveduriformes e 1,6% de algas. Doze isolados de leveduras tiveram as regiões ITS e D1/D2 do 26SrDNA sequenciadas e pertencem a uma espécie ainda não descrita do gênero Rhodotorula. A diversidade e a riqueza de leveduras foram maiores na Praia da Pedreira (H=3,225 e S=34) que na Praia de Fora (H=2,820 e S=26). Cento e noventa e um isolados tiveram sua capacidade para produzir enzimas testada. Desses, 40,2% foram positivos para amilase, 49,2% para caseinase, 14,8% para gelatinase, 58,0% para celobiase, 36,0% para lactase e 61,3% para esterase. O filoplano das bromélias apresentou uma grande biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes,.demonstrando ser um bom substrato para o isolamento de leveduras produtoras de enzimas de interesse industrial.
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Bioprospecção de leveduras killer com potencial para aplicação em biotipagem de microorganismos patogênicos humanos

Fuentefria, Alexandre Meneghello January 2007 (has links)
Uma das formas de se realizar estudos epidemiológicos de dispersão de patógenos é pela discriminação intra-específica (biotipagem) desses microrganismos em subgrupos (biotipos). Métodos fenotípicos que permitem a discriminação de linhagens clínicas são almejados principalmente pela facilidade de execução e por terem menor custo, quando comparados com os métodos moleculares. O sistema killer, baseado em padrões de sensibilidade à toxina, pode representar uma ferramenta simples, barata, sensível e reprodutível para biotipagem de microrganismos de importância clínica. Neste estudo, foi pesquisada a presença deste fenótipo em 595 isolados de alimentos e de fontes ambientais, de onde foram selecionadas 32 cepas para testes de identificação molecular, caracterização genética do fenótipo killer, caracterização morfológica do mecanismo de ação da toxina e aplicação em painéis de biotipagem.A linhagem KYQU89 (CBS10423), proveniente de queijo, foi detectada como uma espécie nova, com seqüência idêntica a dois isolados killer oriundos de insetos. As três linhagens demonstraram ser relacionadas ao clado Ovoides no gênero Trichosporon, sendo caracterizadas por sequenciamento da região D1/D2 do rDNA , da região interespaçadora ITS e perfil bioquímico. A espécie nova foi denominada Trichosporon insectorum. Vinte linhagens killer foram selecionadas para compor um painel de biotipagem sobre cem isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A partir dos padrões de sensibilidade à toxina, foi gerado um dendrogramademonstrando a total discriminação das linhagens. A ação letal da toxina sobre as células destas duas espécies de Cryptococcus foi observada por microscopia eletrônica de varredura e óptica, evidenciando que não houve a formação de poros na parede celular, mas sim uma provável interferência no ciclo celular da célula. Da mesma forma, um painel de 11 linhagens killer selecionadas foi utilizado para a biotipagem de cepas multi-resistentes de Staphylococcus epidermidis, provenientes de dois hospitais em Porto Alegre, RS, também sendo capaz de discriminá-las totalmente. / One of the forms of performing epidemiological studies of dispersion of pathogenic microorganisms is by means of intra-specific discrimination (biotyping) of these microorganisms in sub-groups (biotype). Phenotypic methods that allow the clinical discrimination of strains are needed, especially because they are easy to perform and have low cost, when compared to molecular methods. The killer system, based on patterns of sensitivity towards the toxin, can represent a simple, cheap, sensible and reproductive tool for biotyping of microorganisms of clinical importance. In our study, the presence of this phenotype was evaluated in 595 isolates from natural environments and food and 32 killer strains were selected for molecular identification, genetic characterization of killer phenotype, morphologic characterization of the mechanism of action, and application in biotyping panels.The strain KYQU89 (CBS10423), isolated from cheese, was found to be a new species, with D1/D2 sequence identical to two killer isolates from insects. The three strains were shown to be related to the Ovoides clade of the genus Trichosporon, and were characterized bysequencing of the D1/D2 region of the LSU rDNA and physiological profiles the new species was called Trichosporon insectorum. Twenty killer strains were selected to compose a panel of biotyping against one hundred clinical and environmental isolates of Cryptococcus neformans and Cryptococcus gattii. Basedon the killer sensitivity patterns, a dendrogram demonstrating the total discrimination of the strains was done. The lethal action of the toxin on the cells of Cryptococcus was observed by means of optical and scanning electron microscopy, showing that there was no formation of pores on the cell surface of the sensitive cells in contact with the toxins, but a probable interference in the cell cycle. In the same way, a panel of 11 selected killer strains was used for the biotyping of multi-resistant Staphylococcus epidermidis strains, provenient from two hospitals in Porto Alegre, RS, being also capable of discriminating all the strains.
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Bioprospecção de leveduras killer com potencial para aplicação em biotipagem de microorganismos patogênicos humanos

Fuentefria, Alexandre Meneghello January 2007 (has links)
Uma das formas de se realizar estudos epidemiológicos de dispersão de patógenos é pela discriminação intra-específica (biotipagem) desses microrganismos em subgrupos (biotipos). Métodos fenotípicos que permitem a discriminação de linhagens clínicas são almejados principalmente pela facilidade de execução e por terem menor custo, quando comparados com os métodos moleculares. O sistema killer, baseado em padrões de sensibilidade à toxina, pode representar uma ferramenta simples, barata, sensível e reprodutível para biotipagem de microrganismos de importância clínica. Neste estudo, foi pesquisada a presença deste fenótipo em 595 isolados de alimentos e de fontes ambientais, de onde foram selecionadas 32 cepas para testes de identificação molecular, caracterização genética do fenótipo killer, caracterização morfológica do mecanismo de ação da toxina e aplicação em painéis de biotipagem.A linhagem KYQU89 (CBS10423), proveniente de queijo, foi detectada como uma espécie nova, com seqüência idêntica a dois isolados killer oriundos de insetos. As três linhagens demonstraram ser relacionadas ao clado Ovoides no gênero Trichosporon, sendo caracterizadas por sequenciamento da região D1/D2 do rDNA , da região interespaçadora ITS e perfil bioquímico. A espécie nova foi denominada Trichosporon insectorum. Vinte linhagens killer foram selecionadas para compor um painel de biotipagem sobre cem isolados clínicos e ambientais de Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A partir dos padrões de sensibilidade à toxina, foi gerado um dendrogramademonstrando a total discriminação das linhagens. A ação letal da toxina sobre as células destas duas espécies de Cryptococcus foi observada por microscopia eletrônica de varredura e óptica, evidenciando que não houve a formação de poros na parede celular, mas sim uma provável interferência no ciclo celular da célula. Da mesma forma, um painel de 11 linhagens killer selecionadas foi utilizado para a biotipagem de cepas multi-resistentes de Staphylococcus epidermidis, provenientes de dois hospitais em Porto Alegre, RS, também sendo capaz de discriminá-las totalmente. / One of the forms of performing epidemiological studies of dispersion of pathogenic microorganisms is by means of intra-specific discrimination (biotyping) of these microorganisms in sub-groups (biotype). Phenotypic methods that allow the clinical discrimination of strains are needed, especially because they are easy to perform and have low cost, when compared to molecular methods. The killer system, based on patterns of sensitivity towards the toxin, can represent a simple, cheap, sensible and reproductive tool for biotyping of microorganisms of clinical importance. In our study, the presence of this phenotype was evaluated in 595 isolates from natural environments and food and 32 killer strains were selected for molecular identification, genetic characterization of killer phenotype, morphologic characterization of the mechanism of action, and application in biotyping panels.The strain KYQU89 (CBS10423), isolated from cheese, was found to be a new species, with D1/D2 sequence identical to two killer isolates from insects. The three strains were shown to be related to the Ovoides clade of the genus Trichosporon, and were characterized bysequencing of the D1/D2 region of the LSU rDNA and physiological profiles the new species was called Trichosporon insectorum. Twenty killer strains were selected to compose a panel of biotyping against one hundred clinical and environmental isolates of Cryptococcus neformans and Cryptococcus gattii. Basedon the killer sensitivity patterns, a dendrogram demonstrating the total discrimination of the strains was done. The lethal action of the toxin on the cells of Cryptococcus was observed by means of optical and scanning electron microscopy, showing that there was no formation of pores on the cell surface of the sensitive cells in contact with the toxins, but a probable interference in the cell cycle. In the same way, a panel of 11 selected killer strains was used for the biotyping of multi-resistant Staphylococcus epidermidis strains, provenient from two hospitals in Porto Alegre, RS, being also capable of discriminating all the strains.
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Biodiversidade e potencial biotecnológico de leveduras e fungos leveduriformes associados ao filoplano de bromélias do Parque de Itapuã-Viamão/RS

Landell, Melissa Fontes January 2006 (has links)
As bromélias abrigam uma grande diversidade de organismos. O objetivo do presente trabalho foi analisar a biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes presentes no filoplano de bromélias e avaliar seu potencial biotecnológico. Foram coletadas 50 amostras de folhas de bromélias no Parque Estadual de Itapuã/RS (Praia da Pedreira e Praia de Fora). Fragmentos das folhas foram submetidos a lavagens sucessivas com 0,5%Tween 20. Diluições decimais seriadas da última lavagem, amostras de água dos tanques de bromélias e de flores foram inoculadas em meio YM modificado e incubadas a 25°C por 5-7 dias. Representantes dos diferentes morfotipos foram purificados e identificados pela metodologia convencional. A análise da biodiversidade foi realizada através do índice de Shannon-Weaver. Dos 191 isolados obtidos, 182 foram identificados, sendo 11% leveduras de afinidade ascomicética, 67,6% de afinidade basidiomicética, 19,8% de fungos leveduriformes e 1,6% de algas. Doze isolados de leveduras tiveram as regiões ITS e D1/D2 do 26SrDNA sequenciadas e pertencem a uma espécie ainda não descrita do gênero Rhodotorula. A diversidade e a riqueza de leveduras foram maiores na Praia da Pedreira (H=3,225 e S=34) que na Praia de Fora (H=2,820 e S=26). Cento e noventa e um isolados tiveram sua capacidade para produzir enzimas testada. Desses, 40,2% foram positivos para amilase, 49,2% para caseinase, 14,8% para gelatinase, 58,0% para celobiase, 36,0% para lactase e 61,3% para esterase. O filoplano das bromélias apresentou uma grande biodiversidade de leveduras e fungos leveduriformes,.demonstrando ser um bom substrato para o isolamento de leveduras produtoras de enzimas de interesse industrial.

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