RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

Orientadora: Maria Célia Bertolini / Banca: Nilce Maria Martinez Rossi / Banca: Rafael Silva Rocha / Banca: Carlos Takeshi Hotta / Banca: Iran Malavazi / Resumo: The fungus Neurospora crassa, a model organism in studies of gene expression, metabolism, photobiology and circadian rhythm, is able to respond and adapt to different environmental stresses, such as heat shock, pH changes, nutrient limitation, osmotic stress, and others. Besides that, N. crassa has the genome sequenced and collections of knocked-out strains are avalaible to the scientific community. A systematic screening analysis performed with mutant strains in genes encoding transcription factors led to identify proteins involved in the glycogen metabolism regulation in this fungus. Glycogen and trehalose are storage carbohydrates that functions as a carbon and energy reserve. Trehalose can also protect membranes and proteins, increasing the tolerance to adverse conditions. In this work, some transcription factors were functionally characterized regarding their role in glycogen and trehalose metabolism regulation. The first condition investigated was the influence of the circadian clock in the glycogen metabolism. We observed that the glycogen accumulation and the expression of genes encoding glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) are rhythmic in a wild-type strain and dependent on the FREQUENCY (FRQ) oscillator, the core component of the N. crassa circadian clock. The VOS-1 transcription factor, that is controlled by clock and can act in the connection between clock and glycogen metabolism, binds to gsn and gpn promoters rhythmically. However, the expres... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Orientador: Silvio Roberto Andrietta / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-29T02:43:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Steckelberg_Claudia_D.pdf: 4836930 bytes, checksum: 7c6daf30b9b5d3ad064233e438e76664 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: Nos últimos anos, houve um aumento significativo de trabalhos que buscam entender a dinâmica de população de leveduras habitante das domas de fermentação alcoólica. Os trabalhos gerados elucidaram questões importantes. Entre elas quais seriam as características básicas para que uma levedura permanecesse em um dado processo. Seguindo este contexto este trabalho teve como finalidade contribuir para o conhecimento das características das cepas de leveduras dominantes dos processos fermentativos industriais das destilarias brasileiras. Buscou-se neste trabalho, descrever os atributos de desempenho fermentativo e composição celular de 19 cepas isoladas de vários processos instalados em diferentes regiões do Brasil e com características particulares. Os atributos estudados foram: capacidade fermentativa; taxonomia numérica; tolerância ao etanol; teores de: trealose, proteínalaminoácido, e ácidos graxos. Com objetivo de comparação dos atributos estudados, avaliou-se uma cepa destinada a indústria de panificação assim como uma isolada de um processo de produção de álcool instalado em território Indiano. Os resultados mostraram que em relação às características fermentativas as cepas embora estejam colocadas em 17 grupos diferentes todas se apresentam como boas fermentativas. Em relação à taxonomia numérica foram classificadas 20 das 22 analisadas. Sendo 8 classificadas como Saccharomyces chevalieri, 5 como Saccharomyces coreanus e 7 como Saccharomyces cerevisiae. Se for considerado a classificação segundo BARNET (1992) todas elas são representantes de S. cerevisiae. Em relação à tolerância ao etanol existe uma faixa que varia entre 0,166 e 0,653 11M. A faixa da concentração de trealose na massa celular abrange concentrações que variam 0,47 a 6,3%. No que diz respeito a quantidade de proteína, essa mostra uma variação de 10% da cepa que apresenta uma maior quantidade para que apresenta a menor. As leveduras que apresentaram maior valor de produção específica de massa celular foram também as que apresentaram uma menor quantidade de material protéico. Em relação à distribuição de aminoácidos nesta proteína, os resultados mostram que todas se apresentam dentro do perfil esperando para linhagens de S. cerevisae. Todas cepas testadas apresentaram os ácidos graxos C-12:0 (ac.láurico), C-14:0 (ac.mirístico), C-16:0 (ac.palmítico) , C-16:1 (ác.palmitoleíco), C-18:0 (ac.esteárico) e C-18:1 (ac.oleíco) em sua composição. Alguma cepas apresentaram ainda o ácido graxo insaturado C14:1 (ac.miristoleíco). Os ácidos graxos insaturados (C-16:1 e C-18:1) são os de maior abundância no material graxo que compõe as cepas testadas, que segundo alguns autores estão vinculados com a tolerância das cepas ao etanol. Alguns indícios de relação entre o teor de ácidos graxos C-16:1 e C-18:1 e a tolerância ao etanol pode ser observado, mas uma correlação exata não pôde ser determinada. A partir da compilação dos dados obtidos neste trabalho é possível afirmar que as cepas isoladas dos diversos processos fermentativos apresentaram variações comportamentais e de composição celular. Entretanto quando se avalia o parâmetro de capacidade fermentativa, todas as cepas são classificadas como adequadas para o processo de fermentação alcoólica. Isto confirma a hipótese que, embora as leveduras apresentem características fermentativas semelhantes, pois do contrário não poderiam estar presentes em um ambiente hostil, como é o das domas de fermentação, cada processo seleciona sua própria linhagem, e que a mesma é provavelmente habitante natural da matéria-prima que a unidade processa / Abstract: In the past years, there has been a significant increase in studies seeking to understand the dynamics of the yeast population inhabiting alcoholic fermentation vats. The studies generated have elucidated important issues. Among them, which would be the basic characteristics for a strain to remain in a processo Following this context, this study has had the purpose of enhancing the knowledge on the characteristics of the dominant strains of industrial fermentation processes of Brazilian distilleries. This study has sought to describe the fermentative performance attributes and the cellular makeup of 19 strains, with particular characteristics, isolated from several processes installed in different regions of Brazil. The attributes studied were: fermentative capacity; Numerical Taxonomy; tolerance to ethanol, and contents of trehalose, protein/amino acids, and fatty acids. In order to compare the attributes studied, one strain assigned to the baking industry as well as one isolated from an alcohol production process installed in the Indian territory were evaluated. The results have shown that ali strains have presented good fermentative characteristics in spite of being divided in 17 different groups. As for the numerical taxonomy, 20 out of the 22 strains analyzed have been classified, of which 8 have been classified as Saccharomyces chevalieri, 5 as Saccharomyces coreanus and 7 as Saccharomyces cerevisiae. If the classification according to BARNET (1992) is considered, ali of them are representative of S. cerevisiae. As for ethanol tolerance, there is a variable range between 0.166 and 0.653 11M. The trehalose concentration level in the cellular mass encompasses concentrations varying from 0.47 to 6.3%. With regard to the amount of protein, this sample has shown a 10% variation of the strain presenting the highest amount to the one presenting the lowest. The strains presenting the highest value of specific cellular mass production were also the ones showing the lowest amount of proteinie material. As for the amino-aeid distribution in this protein, the results have shown that ali of them were within the expeeted profile for S. cerevisae strains. Ali strains tested presented the following fatty aeids in their makeup: C-12:0 (laurie acid), C-14:0 (myristie aeid), C-16:0 (palmitie acid), C-16:1 (palmitoleie aCid), C-18:0 (stearic acid), and C-18:1 (oleie aeid). Some strains have also presented the C14:1 (myristoleic aeid) unsaturated fatty acid. The C-16: 1 and C-18: 1 unsaturated fatty aeids are the most plentiful in the fatty material composing the strains tested and, according to some authors, they are linked to the tolerance of the strains to ethanol. Some indications as for relationship between the content of C-16:1 and C­18: 1 fatty acids and the tolerance to ethanol may be notieed, even though an exaet correlation has not been able to be determined. From the compilation of the data obtained in this study, it is possible to state that the strains isolated from several fermentation processes have shown behavioral and cellular makeup variations. However, when the fermentative capacity parameter is evaluated, ali strains are classified as suitable for the alcoholic fermentation processo This fact confirms the hypothesis that, although some strains have similar fermentative eharacteristics, since, otherwise, they could not inhabit a hostile environment such as the one in the fermentation vats, each process selects its own strain, and such strain is probably a natural inhabitant of the raw-material of the unit processing it / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

RESUMO As fosfatases alcalinas sao enzimas que participam da atividade catalitica na hidrolise de ésteres fosfóricos. Nesta Dissertação, investigou-se a sua adsorção em monocamadas de Langmuir e também em filmes do tipo Langmuir-Blodgett (LB) de fosfolipídios em diferentes temperaturas. Esses sistemas são considerados como modelos para membranas biológicas. O efeito de um dissacarídeo (trealose), bem como as impurezas contidas na amostra do açúcar, foi testado na subfase que suporta a monocamada,. Constatou-se que a trealose nao purificada altera a isoterma superficial de monocamadas do sal de sódio do acido dimiristoilglicerofosfatidico, DMPA, e atua como um bom agente de ligação entre camadas sucessivas do fosfolipídio para a obtenção de filmes LB. Já para trealose purificada nao se observaram esses efeitos. A caracterização das impurezas foi realizada por espectroscopia na região do infravermelho e por absorção atômica, detectando-se a presença de moléculas anfifílicas e de íons metálicos (Na+, K+, Ca2+, Mg2+), respectivamente. Dois tipos de fosfatases alcalinas foram usadas: uma purificada de placa óssea de ratos por extração com tensoativo nâo-iônico, chamada de DSAP e outra purificada de conídia de Neurospora crassa, denominada CNCAP. As interações com o fosfolipídio foram estudas por meio das mudanças nas curvas -A e a adsorção em filmes LB de DMPA/Zn2+ e DMPA/trealose, por meio da técnica de microbalança a cristal de quartzo (QCM). A presença das enzimas nos filmes foi também comprovada pela detecção de suas atividades catalíticas na hidrolise do PNPP (p-nitrofenilfosfato). Para a DSAP, a melhor atividade foi obtida quando a imobilização da proteína ocorreu a baixa temperatura (10º C). / ABSTRACT Alkaline phosphatases (AP) are unspecific enzymes that hydrolyze phosphate esthers. In this Dissertation we have studied the adsorption of two forms of AP in phospholipid Langmuir monolayers and Langmuir-Blodgett films, considered as biomembrane models, at different temperatures. Further, the effect of the presence of a disaccharide, trehalose, as well as some impurities present in its commercial form, in the subphase of the monolayers was tested. We concluded that the use of trehalose without further purification alters the surface pressure-area (Pi-A) curves of the monolayers. In addition, it acts as a good linking agent between successive layers in the Langmuir-Blodgett films of the sodium salt of 1,2-dimirystoyl-sn-glicero-3-phosphate acid, DMPA. In the presence of purified trehalose instead, these effects were not observed. No difference was noticed in the Pi-A curves of DMPA for trehalose concentrations between 10-3 mmol L-1 to 0.1 mmol L-1. The characterization of the impurities by atomic absorption and infrared spectroscopy reveal the presence of amphiphilic compounds as well as electrolytes such as: sodium, magnesium, calcium and potassium Two forms of AP were used: one purified from rat osseous plates using detergent solubilization, named DSAP, and the other from Neurospora crassa conidia, CNCAP. Enzyme interaction with phospholipids was followed by changes in Pi-A curves, and their adsorption on DMPA/Zn2+ or DMPA/trehalose LB films using the quartz crystal microbalance technique, QCM. Their presence within the films was also monitored by catalytic activity assays, using PNPP (p-nitrophenylphosphate) as hydrolysis substrate. For DSAP, the highest enzymatic activity was observed when the immobilization was carried out at low temperature (10o C).

Entre centenas de espécies brasileiras de pirilampos, o Pyrearinus termitilluminans é o único cujo ciclo de vida se passa integralmente nos cupinzeiros luminosos localizados no Brasil central claramente observados durante a estação das chuvas. A emissão de luz nos elaterídeos tem a função de atração de presas para a alimentação. A bioluminescência desses animais desaparece nos meses de seca juntamente com a nuvem de presas aladas. Assim, o metabolismo de trealose aqui estudado poderia prover informações sobre da capacidade da larva de sobreviver em ambientes edáficos. As concentrações de trealose e glicose são determinadas nos extratos de larvas com um sistema DIONEX® de cromatografia iônica. A trealase foi medida com 17 mM de trealose. O glicogênio foi estimado com uma amiloglicosidase. Paralelamente o estresse oxidativo associado com a restrição de água foi monitorado através da determinação do TBARS, juntamente com a catalase, glutationa peroxidase e glutationa redutase. Nas larvas submetidas ao ensaio na câmara climática (25% de umidade) a trealase (159,69±10,95 mU/animal) estava 80 vezes mais alta do que a do grupo controle (2,02±1,41mU/animal). As larvas sob estresse apresentaram distintos níveis de trealose e glicose (29,85±3,20 µmol/animal e 18,27±0,82 µmol/animal, respectivamente) quando comparadas com o grupo controle (64,61±1,54 µmol/animal e 2,16±0,11 µmol/animal, respectivamente). A elevação dos níveis das enzimas antioxidantes (4, 4,3 e 2,4 vezes respectivamente) com níveis invariáveis de TBARS apontam para a ação antioxidante contra a produção elevada de espécies reativas de oxigênio. Os insetos submetidos à restrição hídrica perderam aproximadamente 35% do peso. O aumento da atividade da trealase, com concomitante decréscimo dos níveis de trealose, sugerem que esse açúcar poderia ser usado como fonte hídrica. Entretanto, os níveis de glicose, 10 vezes mais elevados no grupo sob estresse poderia ser usado na via de biossíntese de trealose uma vez que os níveis de glicogênio estão diminuídos. As mudanças no metabolismo de trealose e o desbalanço no equilíbrio redox, poderiam fornecer importantes informações fisiológicas desses insetos sob estresse hídrico. / The life cycle of Pyrearinus termitilluminans (Coleoptera: Elateridae) takes place totally into the so-called luminous termite mounds located in Central Brazil, which are clearly observed during the rainy season. Light emission by the elaterid larvae acts like a trap attracting flying insects. The bioluminescence disappears in the dry months together with the food supply. The trehalose metabolism study described here could provide information about larva capacity to survive throughout hard climatic changes. Trehalose and glucose concentrations are determined in the larva extracts with a DIONEX® ion chromatography system. The trehalase activity was measured with 17 mM trehalose. The glycogen level was estimated with amyloglucosidase. In parallel oxidative stress associated to water deprivation was evaluated through determination of TBARS and the catalase, glutathione peroxidase and glutathione reductase activities. In larvae submitted to dryness in a growth chamber (25% humidity) we have found 80-fold higher trehalase activity (159.69±10.95 mU/animal) than in the control group raised under room conditions (2.02±1.41 mU/animal). Stressed larvae showed distinct trehalose and glucose contents (29.85±3.20 µmol/animal and 18.27±0.82 µmol/animal, respectively) when compared with the control group(64.61±1.54 µmol/animal and 2.16±0.11 µmol/animal, respectively), whereas the glycogen level was lower (11.53±2.01 mg/animal and 28.26±2.31 mg/animal, respectively). Elevation of the antioxidant enzyme levels (4-fold, 4.3-fold and 2.4-fold respectively) with maintenance of TBARS pointed to depletion to exacerbated production of reactive oxygen species. Insects submitted to water restriction lost about 35% wet weight. The observed increase of trehalase activity and concomitant decrease of trehalose level suggest that trehalose could be used as a metabolic water source. Moreover, the 10-fold higher glucose level in the stressed group could be used by the trehalose biosynthetic pathway as the glycogen level decreases in parallel. The trehalose metabolic and redox balance changes described here may shed light on the yet unknown physiological mechanisms of larval elaterid adaptation to water stress.

As leveduras são de relevante importância dentro da agroindústria sucroalcooleira devido sua participação no processo fermentativo de produção de álcool. Deste modo, faz-se necessário o conhecimento deste agente fermentativo com destaque para Saccharomyces cerevisiae, principal gênero. O objetivo deste trabalho foi estudar a linhagem de levedura S. cerevisiae Y904, exposta a condições não proliferantes, após fermentação em meio que sofreu adição de óleo vegetal e sua possível correlação com manutenção da viabilidade celular. Foram realizadas análises para contagem de unidades formadoras de colônias, viabilidade celular, concentração celular, nitrogênio total na levedura e no meio, carboidratos totais, trealose e glicogênio. As leveduras submetidas a condições não proliferantes apresentaram menores teores de carboidratos totais, com destaque para trealose e glicogênio, em relação às leveduras comerciais. Saccharomyces cerevisiae sofreu queda de viabilidade acentuada após 24 h em solução fisiológica, em condições não proliferantes, sob agitação de 90 rpm e temperatura de 30 ± 1°C, seguida de uma acentuada autólise a partir de 120 h (5°dia), provavelmente, devido ao teor de carboidratos de reserva da célula que se encontravam em valores extremamente baixos, da ordem de 0,15 mg de trealose em 100 mg da matéria seca e 4 mg de glicogênio em 100 mg da matéria seca. A partir desse ponto entraram em total desorganização celular. / Yeast is highly important in sugar and alcohol agroindustry due to its role in the fermentative process of alcohol production. Thus, it is necessary to know this microorganism, most specially the Saccharomyces cerevisiae, the main species. The objective of this work was to study the strain Y904 of the yeast Saccharomyces cerevisiae under non-proliferating conditions after fermentation in a medium in which it was added vegetable oil and verify its possible correlation with the maintenance of the cellular viability. Analyses were performed in order to determine colony forming units, cellular viability, cellular concentration, total nitrogen in yeast and in medium, total carbohydrates and trehalose and glycogen contents. The yeast submitted to non-proliferating conditions presented a lower content of total carbohydrates, specially trehalose and glycogen, when compared to commercial yeasts. The viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae Y904 markedly decreased after 24 hours in physiological solution under non-proliferating conditions in a shaker for 90 rpm at 30 ± 1°C. It was observed an accentuated autolysis from the 120 th hour (5 th day) on. This was probably because of the very low content of the carbohydrates of reserve in the cells, 0.15 mg of trehalose and 4.0 mg of glycogen in 100 mg of dry weight. From this point the cells began a total cellular disorganization.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 243475 bytes, checksum: 08375cc332ea6491435cc3b67f4a34e9 (MD5) Previous issue date: 2010-03-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Programs of control and management of the quality in laboratories, the necessity of standardization of the analysis methods and repeatability of the experimental data have stimulated the increase of the use of Reference Material (RM) in the microbiological analyses. Considering that the stages of preparation and storage of the MR are stress processes that causes to injuries to the microorganism test the preparation of the cells becomes necessary to tolerate the variation of temperature and humidity the one that is submitted during the frezze- drying and storage. It was objectified, in this work, to get resistant cells of Salmonella enterica the frezze-drying for the RM preparation and to evaluate the stability of these cells throughout the stockage. The growth of enteric Salmonella sorotipo Enteritidis PT4 578 was folloied in broth brain heart infusion (BHI) and mineral salts medium (MMS) increased of 0,5 M sodium chloride (NaCl), 3 mM of trehalose e, or 0,05 mM of glucose. The survival after the frezze-drying was determined by the counting of the number of form units of colonies (UFC.g-1). The effect of the thermal shock in the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 was evaluated the 50 °C in the increase of the resistance to the frezze- drying. Also the influence of substrata of dehydration in the resistance of cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 and the stability of the RM was evaluated during 90 days of stockage in the 4 °C the - 20 °C. The way of culture that guaranteed the biggest survival of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to the frezze-drying was the MMS, added of the evaluated solutos indicating it nutricional stress confers resistance crossed to the frezze-drying. The thermal shock diminishes the cellular viability, after the frezze-drying. The addition of 100 mM of trealose e, or sacarose to skimmed milk reconstituted (LDR) the 10%, increased the stability of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 in the storaged MR the 4 °C and - 20 °C. The temperature of stockage of 4 °C resulted in loss of the cellular viability in about 2 logarithmic cycles after 90 days stockage while the -20 °C the loss in the cellular viability was ten times lesser. The results detach that, for the attainment of MR with bigger stability, it has the necessity of the preparation of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to present greater resistance the frezze-drying, considering conditions of nutricional stress and osmotic during the culture and the inclusion of osmoprotectant in the dehydration substratum. / Programas de controle e gestão da qualidade em laboratórios, a necessidade de padronização dos métodos de análise e repetibilidade dos dados experimentais têm impulsionado o aumento da utilização de Material de Referência (MR) nas análises microbiológicas. Considerando que as etapas de preparo e armazenamento do MR são processos estressantes que ocasionam injúrias ao micro-organismo teste faz-se necessário a preparação das células para tolerar a variação de temperatura e umidade a que são submetidas durante a liofilização e o armazenamento. Objetivouse, neste trabalho, obter células de Salmonella enterica resistentes a liofilização para o preparo de MR e avaliar a estabilidade destas células ao longo da estocagem. O crescimento de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis PT4 578 foi acompanhado em caldo infusão cérebro coração (BHI) e meio mínimo de sais (MMS) acrescido dos solutos 0,5 M de cloreto de sódio (NaCl), 3 mM de trealose e, ou 0,05 mM de glicose. A sobrevivência após a liofilização foi determinada pela contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC.g-1). Avaliou-se o efeito do choque térmico nas células de Salmonella Enteritidis PT4 578 a 50 °C por 30 min no aumento da resistência à liofilização. Foi também avaliada a influência dos substratos de desidratação na resistência de células de Salmonella Enteritidis PT4 578 e a estabilidade do MR preparado durante 90 dias de estocagem a -20 °C e 4 °C. O meio de cultivo que garantiu a maior sobrevivência das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 à liofilização foi o MMS, adicionado de NaCl, trealose e sacarose indicando que o estresse nutricional confere resistência cruzada à liofilização. O choque térmico diminui a viabilidade celular, após a liofilização. A adição de 100 mM de trealose e, ou sacarose ao leite desnatado reconstituído (LDR 10 %) como substrato de desidratação, aumentou a estabilidade das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 no MR estocado a 4 °C e - 20 °C. A temperatura de estocagem de 4 °C resultou em perda da viabilidade celular em cerca de 2 ciclos logarítmicos após 90 dias de estocagem enquanto a -20 °C não houve perda na viabilidade celular significativa. Os resultados indicam que, para a obtenção de MR com maior estabilidade, há a necessidade do preparo da células de Salmonella Enteritidis PT4 578 para apresentar maior resistência a liofilização, submetendo estas células a condições de estresses nutricional e osmótico durante o cultivo e a inclusão de osmoprotetores (trealose ou sacarose) no substrato de desidratação.

A humanidade tem aumentado drasticamente o uso de antibióticos, antifúngicos, inseticidas, herbicidas e agentes quimioterápicos para tratar infecções, câncer e obter ganho econômico com a produção agrícola e industrial. O repetido uso destas substâncias leva freqüentemente à sua ineficiência devido à seleção de organismos resistentes ou tolerantes, com graves conseqüências econômicas e sociais. Os mecanismos envolvidos no processo de resistência à antifúngicos são pouco conhecidos. A compreensão destes mecanismos auxiliará no desenvolvimento de estratégias para a identificação de isolados clínicos resistentes, no tratamento de infecções fúngicas, na prevenção do surgimento de isolados resistentes, na definição de novas estratégias de utilização de antifúngicos, na revelação de novos alvos terapêuticos e portanto, no controle dos patógenos. Para o entendimento das bases moleculares da resistência à acriflavina e outros agentes inibidores em fungos nós clonamos, por transformação, um gene que confere esta resistência em Aspergillus nidulans e o caracterizamos molecularmente. Construímos uma biblioteca a partir de uma linhagem duplo-resistente e isolamos um clone que se mostrou capaz de transformar uma linhagem receptora sensível em resistente à acriflavina. A seqüência deste clone proveniente do mutante resistente, e de seu alelo selvagem revelou um gene de aproximadamente 2276 nucleotídeos traduzido em 697 aminoácidos, com alta similaridade com a trealose sintase/fosforilase (glicosiltransferase) de vários organismos. Esta seqüência foi depositada no “GenBanK" (AY102266). As enzimas trealose sintase e fosforilase participam da síntese da trealose que, além de ser fonte de carbono, está relacionada com a proteção das proteínas de membrana e das enzimas, e contra o estresse térmico e oxidativo em fungos filamentosos. As seqüências nucleotídicas dos alelos selvagem e mutante não apresentaram diferenças nas regiões estruturais ou promotoras. No entanto, a seqüência do cDNA da linhagem selvagem apresenta um íntron extra quando comparada com o cDNA da linhagem mutante. Portanto, o mRNA do gene da linhagem mutante não estaria sendo adequadamente processado, provavelmente por uma alteração no mecanismo envolvido neste processamento, inviabilizando a funcionalidade da trealose sintase / fosforilase produzida. O nocaute deste gene e a análise do fenótipo dos mutantes nulos na presença de acriflavina ou brometo de etídio confirmaram que ele não é essencial para o fungo. Através de genética clássica verificou-se que não há interação gênica ou sinergismo entre as mutações acrA1, que confere resistência à acriflavina e a outros inibidores, e tebA1, que confere resistência ao antimicótico terbinafina no fungo A. nidulans. / Mankind has drastically increased the use of antibiotics, antifungals, insecticides, herbicides and chemotherapeutic agents to treat infections and cancer and to obtain economic gains with agricultural and industrial production. The continuous use of these substances frequently leads to their inefficiency due to the selection of resistant or tolerant organisms, with serious economic and social consequences. The mechanisms involved in the process of antifungal resistance are little known. Understanding these mechanisms will help in the development of strategies for the identification of resistant clinical isolates, the treatment of fungal infections, the prevention of the occurrence of resistant isolates, the definition of new strategies for the use of antifungal agents, and the discovery of new therapeutic targets, and therefore the control of pathogens. To better understand the molecular basis of resistance to acriflavine and other inhibitory agents among fungi we cloned by transformation a gene that confers this resistance to Aspergillus nidulans and characterized it molecularly. We constructed a library from a double-resistant strain and isolated a clone that proved to be able to transform a receptor strain sensitive into an acriflavine-resistant strain. The sequence of this clone obtained from the resistant mutant and of its wild allele revealed a gene of approximately 2276 nucleotides translated into 697 amino acids, with high similarity to the trehalose synthase/phosphorylase (glycosyltransferase) of various organisms. This sequence was deposited in GenBanK (AY102266). The enzymes trehalose synthase and trehalose phosphorylase are related to the synthesis of trehalose, which in addition to being a carbon source is related to protection of the membrane proteins and of the enzymes against thermal and oxidative stress in filamentous fungi. The nucleotide sequences of the wild and mutant alleles did not show differences in the structural or promoter regions. However, the cDNA sequence of the wild strain presents an extra intron compared to the cDNA of the mutant strain. Thus, the mRNA of the gene of the mutant strain may not be adequately processed, probably due to an alteration in the mechanism involved in this processing, leading to inviability of the functionality of the trehalose synthase/phosphorylase produced. Knock out of this gene and analysis of the null mutant phenotypes in the presence of acriflavine or ethidium bromide confirmed that this gene is not essential for the fungus. Using classical Genetics, no gene interaction or synergism was observed between the acrA1 mutation, which confers resistance to acriflavine and to other inhibitors, and the tebA1 mutation, which confers resistance to the antimycotic agent terbinafine in the fungus A. nidulans.

O gene AGT1 do locus mal1g, do sistema de transporte de maltose de S. cerevisiae, codifica uma proteína de 67 kDa, que tem 75% de similaridade e 58% de identidade com o transportador de maltose do locus MAL1. Sua expressão é ativada por genes reguladores constitutivos do sistema MAL, e é reprimida pela glicose. A cepa AP68-7A carrega o gene AGT1, e possivelmente o gene transportador MAL31, e transporta trealose ao final da primeira fase de crescimento anaeróbico. SDS-PAGE comparando proteínas de membranas de células reprimidas pela glicose (taxa de transporte <0,5 U/mg), com aquelas de células induzidas por α-metilglicosídeo (taxa de transporte de ~35 U/mg), verificou-se 2 bandas (PMs 57 e 66 kDa) exclusivas em membranas de células induzidas. As 2 bandas foram isoladas por três métodos diferentes (cromatografia de troca iônica, lavagens da membrana com tampão de alta força iônica e cromatografia de afinidade) e testadas para ligação de 14C-trealose. A ligação foi enriquecida ~3 X após a cromatografia de troca iônica. O transporte de trealose na cepa AP77-4C (que não tem nenhum dos genes transportadores dos loci MAL) foi recuperado após sua transformação com plasmídeo YEp366-AGT1. De membranas plasmáticas destas células (transporte de trealose ~25 U/mg) foram isoladas por cromatografia de afinidade, 2 bandas cujos PMs em SDS-PAGE são idênticos aos das proteínas isoladas das membranas da cepa AP68-7A. Estes resultados permitem concluir que o transportador de trealose de leveduras é codificado pelo gene AGT1. / The AGT1 gene presente in the mal1g locus from S. cerevisiae maltose transport system encodes a 67 kDa protein which shares 75% similarity and 58% identity with the maltose transporter protein encoded in MAL6 locus. The expression of this gene is regulatory genes from MAL system and is repressed by glucose. The strain AP68-7A which harbors the AGT1 gene and probably the MAL31 transporter gene, expresses trehalose transport activity at the end of first anaerobic growth. The comparison from the SDS-PAGE of membrane proteins from glucose repressed cells (trehalose transport activity of <0.5 U/mg), and α-methylglucoside induced cells (trehalose transport activity of ~35 U/mg), revealed 2 bands (Mr 57 and 66 kDa) present only in the induced cells membranes. Those bands were isolated by 3 different methods (ionic exchange chromatography, high strength ionic washes and affinity chromatography, and tested for 14C-trehalose binding. Both bands bind trehalose and this activity was enriched about 3 times after the ionic exchange chromatography. The trehalose transport activity was recovered by strain AP77-4C, (which does not harbor any MAL transporter gene) after its transformation with a plasmid containing the AGT1 gene. From the membranes of these cells (trehalose transport activity of ~25 U/mg) 2 bands were isolated by affinity chromatography with similar Mrs to those isolated from AP68-7A strain. The results permit to conclude that the AGT1 gene encodes the yeast trehalose transporter.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-14Bitstream added on 2014-06-13T19:07:07Z : No. of bitstreams: 1 queiroz_rjb_me_jabo.pdf: 279148 bytes, checksum: f2c7d7d0a4340fa883e5d22a2352282b (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / No presente estudo, verificou-se o acúmulo da trealose e da prolina livre e o crescimento inicial de duas cultivares de cana-de-açúcar, IAC91-2195 e IAC91-5155, sensível e tolerante ao estresse hídrico, respectivamente. Inicialmente, as mudas foram cultivadas sem qualquer restrição hídrica. Após 40 dias, foram transferidas para vasos com três níveis de disponibilidade hídrica do solo (DHS): 55% (sem estresse), 40% (estresse moderado) e 25% (estresse severo), mantidos pelo método das pesagens durante 30 e 60 dias. O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, com quatro repetições, em arranjo fatorial 2x3x2 (cultivares x deficiência hídrica x épocas de crescimento). O experimento foi conduzido em casa de vegetação climatizada (29ºC e 75% UR). A cultivar IAC91-5155 apresentou maior acúmulo de trealose e de prolina livre nos menores níveis de disponibilidade hídrica do solo, indicando tolerância às condições de estresse hídrico. Aos 30 dias, sob estresse hídrico, houve maior acúmulo de prolina livre apenas na cv. IAC91-5155. Os osmoprotetores, trealose e prolina livre, podem ser indicados como marcadores bioquímico-fisiológicos de tolerância ao estresse hídrico somente para a cv. IAC91-5155. A cv. IAC91-5155 pode ser considerada mais tolerante ao estresse hídrico que a cv. IAC91-2195. / In this work, the accumulation of trehalose and free proline and the initial growth were measured in two sugarcane cultivars, IAC91-2591 and IAC91-5155, sensitive and stress tolerant, respectively. Buds, after 40 days old cultivated in soil with no water restriction when were transferred to pots and submitted to three soil water levels: 55% (no stress), 40% (moderate stress) and 25% (severe stress). The experiment was carried out in greenhouse (29ºC and 75% RH). The Weighing Method was used to control the soil water levels for 30 and 60 days. The experimental design was randomized blocks with four replicates in 2x3x2 factorial arrangement (cultivars, water deficit and periods of growth). The cultivar IAC91-5155 showed higher accumulation of the trehalose and free proline under water deficiency. The accumulation of the proline was higher in IAC91-5155 cultivar at 30 days under soil water levels. Trehalose and free proline could only be considered as biochemical-physiological markers to soil water deficits in cultivar IAC91-5155. The cultivar IAC91-5155 may be more tolerant to water stress than IAC91-2195.