La insuficiència cardíaca congestiva és una epidèmia creixent a nivell mundial. Les causes principals de la insuficiència cardíaca estan relacionades amb el dany irreversible que resulta d'un infart de miocardi. El cor humà té una capacitat de regeneració limitada, i la pèrdua de múscul, juntament amb la contracció i la fibrosi de la cicatriu miocàrdica, posen en joc un conjunt d'esdeveniments anomenats remodelat ventricular, que finalment tendeixen cap a una insuficiència cardíaca congestiva. En l'actualitat no hi ha cap tractament o procediment clínic, amb excepció del trasplantament cardíac, que substitueixi la cicatriu de l'infart per teixit contràctil funcional. Recentment, la identificació de diferents tipus de cèl·lules mare capaces de contribuir a la regeneració dels teixits ha generat un notable interès en la possibilitat que la teràpia cel·lular pugui ser utilitzada per reparar el miocardi danyat (cardiomioplàstia cel·lular). No obstant això, es desconeix encara quin és el tipus cel·lular ideal per a la cardiomioplàstia cel·lular.Tradicionalment, es pensava que les cèl·lules mare pròpies d'un teixit adult només podien diferenciar-se cap a cèl·lules del teixit d'origen. Recentment, però, un conjunt d'estudis han demostrat que les cèl·lules mare adultes poden diferenciar-se cap a llinatges diferents als del seu teixit d'origen exhibint una plasticitat que ha estat anomenada transdiferenciació. Les cèl·lules mare mesenquimals són unes cèl·lules no hematopoètiques que típicament s'han aïllat del moll d'os però que més endavant s'ha demostrat que resideixen virtualment en tots els teixits. La seva accessibilitat, capacitat proliferativa, potencial de diferenciació i perfil immunològic fan que les cèl·lules mare mesenquimals adultes siguin un candidat principal per l'aplicació en teràpia regenerativa.En aquesta tesi hem aïllat i estudiat tres tipus de cèl·lules mare d'origen mesenquimal de tres teixits diferents, el moll d'os, el teixit adipós subcutani i el teixit adipós epicàrdic. Tots ells s'han caracteritzat in vitro i se n'ha estudiat la velocitat de creixement, la seva expressió de marcadors de superfície i la seva capacitat pluripotencial vers els llinatges adipogènic i osteogènic. La recerca en aquesta tesi però, s'ha centrat en el seu potencial per a la regeneració cardiovascular. Per aquest motiu es va estudiar el potencial cardiomiogènic mitjançant l'anàlisi de l'expressió basal de marcadors característicament cardíacs i la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcits. Dels resultats obtinguts en aquesta primera fase in vitro vam concloure que les cèl·lules progenitores derivades de greix epicàrdic (epiATPC), unes cèl·lules no descrites fins ara, eren el candidat cel·lular ideal per a l'estudi del seu potencial de regeneració del miocardi infartat in vivo. Per aquest motiu, es va estudiar l'efecte de les epiATPC trasplantades en dos models animals d'infart de miocardi en els quals es va observar una notable millora del miocardi infartat a nivell histològic i de funció. En conclusió, les epiATPC són una font cel·lular alternativa per a la cardiomioplàstia cel·lular, com ho demostra la seva capacitat de diferenciació cap a cardiòcit i cèl·lula endotelial, així com la millora de la funció cardíaca observada en els dos models d'infart agut de miocardi estudiats en aquest treball. / Congestive heart failure is a growing epidemic worldwide. The main causes of heart failure are related to the irreversible damage that results from a heart attack. The human heart has a limited capacity for regeneration, and loss of muscle, along with contraction and fibrosis of the myocardial scar, put into play a series of events known as ventricular remodelling, which ultimately tend to congestive heart failure.At present there is no treatment or clinical procedure, with the exception of heart transplant, to replace the scar tissue for a viable tissue with contractile function. Recently, the identification of different types of stem cells capable of contributing to the regeneration of tissues has generated a significant interest in the possibility that cell therapy can be used to repair the damaged myocardium (cellular cardiomyoplasty). However, it is not known yet which cell type is ideal for the cellular cardiomyoplasty.Traditionally, it was thought that stem cells of an adult tissue could only differentiate itself into cells types of the tissue of origin. Recently, however, a number of studies have shown that adult stem cells can differentiate itself into different lineages of their tissue of origin displaying a plasticity that has been called transdifferentiation. Adult mesenchymal stem cells are a non-haematopoietic cells that typically have been isolated from the bone marrow but was later shown to reside in virtually all tissues. Its accessibility, proliferative capacity, potential for differentiation and immunological profile makes adult mesenchymal stem cells a primary candidate for the application in regenerative therapy.In this thesis we isolated and studied three types of stem cells of mesenchymal origin from three different tissues, bone marrow, subcutaneous fat and epicardic adipose tissue. All of them have been characterized in vitro and has studied the rate of growth, their expression of surface markers and their capacity towards the adipogenic and osteogenic lineages. Research in this thesis however, has focused on the potential for cardiovascular regeneration. That is why we studied the cardiomyogenic potential by analyzing the expression of basal characteristically cardiac markers and their ability to differentiate into cardiomyocytes. Based on the results obtained in this first phase in vitro we conclude that epicardial fat progenitor cells (epiATPC), a stem cell type not reported until now, were the ideal cell type for the study of their potential to regenerate myocardial infarction in vivo. For this reason, we studied the effect of epiATPC transplanted in two animal models of myocardial infarction in which there was a remarkable improvement of the infracted myocardium at histological and functional levels.In conclusion, epiATPC are an alternative cell source to cellular cardiomyoplasty, as demonstrated by their ability to differentiate into cardiomyocytes and endothelial cells, as well as the improvement of cardiac function observed in the two models of acute myocardial infarction studied in this work.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigacions Biomèdiques de Barcelona (IIBB-CSIC IDIBAPS) / Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal. / Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

Pluripotent cells are unique due to their developmental potential and the possibility to study them is the key step to understand human development. These cells are characterized by their ability to originate all the cellular lineages within an adult organism. Within embryonic milieu, pluripotent cells represent a dynamic fraction of the total cell number. Moreover, their physiological existence is constrained to early stages of embryonic development. In vitro culture of the different types of mammalian pluripotent cells, and singularly embryonic stem cells (ESC), enables the characterization of the pluripotent state. In the four articles included in this thesis we have addressed two different aspects of the molecular characterization of mammalian pluripotent cells. First, we investigated the establishment of the trophectoderm and the inner cell mass in the embryo measuring transcript abundance and protein presence of the transcription factors known to play a role in the earliest cellular differentiation process. In addition we have evaluated of genomic stability of human ESC lines during long-term culture, observing the accumulation of sukaryotypic aberrations such as loss of heterozygosity that affect loci comprising genes involved in genomic stability maintenance. We also checked the genomic status of two human ESC lines derived from embryos that had been diagnosed as abnormal after genetic preimplantation diagnosis (PGD). The molecular analysis of these cells ruled out the hypothesized self-correction of the aneuploidies between the PGD and the establishment of the cell lines. / Les cèl·lules pluripotents són úniques atesa la seva plasticitat durant el desenvolupament i la possibilitat d'estudiar-les és un pas essencial per poder comprendre el desenvolupament embrionari. Aquestes cèl·lules es caracteritzen per la seva habilitat per donar lloc a tots els llinatges cel·lulars de l'organisme. Dins de l'embrió, les cèl·lules pluripotents representen una fracció dinàmica del nombre total de cèl·lules i la seva existència fisiològica està constreta a els estadis més primerencs del desenvolupament embrionari. El cultiu in vitro dels diferents tipus de cèl·lules pluripotents en mamífers, i en especial les cèl·lules mare embrionàries, permet la caracterització d'aquest estat cel·lular. En els quatre capítols inclosos en aquesta tesi, hem tractat dos aspectes diferents de la caracterització molecular de les cèl·lules pluripotents. Primer, hem investigat l'establiment del trofectoderm i de la massa cel·lular interna en l'embrió mesurant l'abundància dels trànscrits i la presència de proteina dels factors de transcripció implicats en el primer process de diferenciació cel·lular conegut. A més, hem avaluat l'estabilitat genòmica de dues línies de cèl·lules mare en cultiu durant més de 40 passis. Com a resultat, hem observat l'acumulació de aberracions genòmiques a nivell subcariotípic, en especial pèrdua d'heterozigositat que afecta a locus que contenen gens implicats en el manteniment de l'estabilitat genòmica. També hem comprovat l'estatus genòmic de dos linies de cèl·lules mare embrionàries humanes derivades a partir d'embrions trobats aneuploids per un diagnòstic genètic preimplantacional. L'anàlisi molecular d'aquestes cèl·lules va descartar la hipòtesi d'una autocorrecció de les aneuploidies detectades entre el diagnòstic preimplantacional i la derivació de les línies a partir d'aquests embrions.

Tesis por compendio / [ES] La lesión medular (LM) es un trastorno neurológico devastador y debilitante que se caracteriza por un grado variable de disfunción motora, sensorial y/o autonómica permanente. El trasplante de células madre neurales (NSC) ofrece una herramienta terapéutica prometedora para el tratamiento de la LM al proporcionar neuroprotección y neuroregeneración. Sin embargo, el entorno generado tras la lesión limita el potencial terapéutico de las terapias celulares al dar lugar a una escasa supervivencia y engraftment de las células y a una diferenciación inadecuada. Además, las terapias celulares han mostrado hasta la fecha una recuperación funcional limitada en los ensayos clínicos. Por lo tanto, se ha postulado el uso de terapias combinatorias para superar estas limitaciones y potenciar los beneficios terapéuticos de las terapias celulares. En esta tesis doctoral, se han estudiado distintas estrategias de combinación con el trasplante de NSC, como el uso de fármacos y biomateriales, con el objetivo de mejorar y potenciar el efecto de la terapia celular en el rescate de la actividad neuronal, en la modulación del proceso inflamatorio, en la supervivencia del trasplante, así como en su integración y diferenciación en el tejido medular. Así, En el capítulo 1 evaluamos la terapia combinada de células madre neurales humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPSC-NSCs), células madre mesenquimales (MSCs) y un nanoconjugado de curcumina (PA-C) en un modelo de LM subagudo, proporcionando un mayor grado de neuroprotección en comparación con los tratamientos individuales. En el capítulo 2 desarrollamos una estrategia mínimamente invasiva mediante el uso de un scaffold de ácido hialurónico en forma de semi-luna para el transplante de iPSC-NSCs combinado con PA-C. Así, los análisis histológicos demostraron que el tratamiento combinado de iPSC-NSCs y la PA-C presentaban una mayor preservación de fibras neuronales en la zona de la lesión y una reducción de la extensión de la cicatriz fibrótica. Por último, en el capítulo 3 se describe una estrategia terapéutica que se aproxima más a la traslación clínica mediante el trasplante de progenitores neurales fetales humanos (hfNPCs) condicionados previamente con una forma conjugada del inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS). Así, la combinación de las hfNPCs con el PGA-SS-FAS favoreció la migración del transplante en el tejido medular, la preservación de las interneuronas somatosensoriales Lbx1 inhibitorias y las Tlx3 excitatorias, así como la activación neuronal alrededor del epicentro de la lesión. Así pues, en la presente tesis doctoral se estudia y describe el beneficio aportado por tres estrategias combinatorias, que incrementan los efectos neuroprotectores proporcionados por la terapia celular en el tratamiento de lesiones medulares agudas y sub-agudas. / [CA] La lesió medul·lar (LM) és un trastorn neurològic devastador i debilitant que es caracteritza per un grau variable de disfunció motora, sensorial i/o autonòmica permanent. El trasplantament de cèl·lules mare neurals (NSC) ofereix una eina terapèutica prometedora per al tractament de la LM proporcionant neuroprotecció i neuroregeneració. Tot i això, l'entorn generat després de la lesió limita el potencial terapèutic de les teràpies cel·lulars donant lloc a una escassa supervivència i engraftment de les cèl·lules i a una diferenciació inadequada. A més, les teràpies cel·lulars han mostrat fins ara una recuperació funcional limitada als assajos clínics. Per tant, s'ha postulat l'ús de teràpies combinatòries per superar aquestes limitacions i potenciar els beneficis terapèutics de les teràpies cel·lulars. En aquesta tesi doctoral, s'han estudiat diferents estratègies de combinació amb el trasplantament de NSC, com ara l'ús de fàrmacs i biomaterials, amb l'objectiu de millorar i potenciar l'efecte de la teràpia cel·lular en el rescat de l'activitat neuronal, en la modulació del procés inflamatori, en la supervivència del trasplantament, així com en la seva integració i diferenciació al teixit medul·lar. Així, Al capítol 1 avaluem la teràpia combinada de cèl·llules mare neurals humanes derivades de cèl·lules mare pluripotents induïdes (iPSC-NSCs), cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i un nanoconjugat de curcumina (PA-C) en un model de LM subagut, proporcionant un major grau de neuroprotecció en comparació dels tractaments individuals. Al capítol 2 desenvolupem una estratègia mínimament invasiva mitjançant l'ús d'un scaffold d'àcid hialurònic en forma de semilluna per al trasplantament d'iPSC-NSC combinat amb PA-C. Així, els anàlisis histològics mostraren que el tractament combinat d'iPSC-NSCs i la PA-C incrementaba la preservació de fibres neuronals a la zona de la lesió i reduïa l'extensió de la cicatriu fibròtica. Finalment, al capítol 3 es descriu una estratègia terapèutica que s'aproxima més a la translació clínica mitjançant el trasplantament de progenitors neurals fetals humans (hfNPCs) condicionats prèviament amb una forma conjugada de l'inhibidor de Rho/Rock fasudil (PGA-SS-FAS. Així, la combinació de les hfNPCs amb el PGA-SS-FAS va afavorir la migració del trasplantament al teixit medul·lar, la preservació de les interneurones somatosensorials Lbx1 inhibitòries i les Tlx3 excitatòries, així com l'activació neuronal al voltant de l'epicentre de la lesió. Així doncs, en aquesta tesi doctoral s'estudia i descriu el benefici aportat per tres estratègies combinatòries, que incrementen els efectes neuroprotectors proporcionats per la teràpia cel·lular en el tractament de lesions medul·lars agudes i sub-agudes. / [EN] Spinal cord injury (SCI) is a devastating and debilitating neurological disorder characterized by a variable degree of permanent motor, sensory and/or autonomic dysfunction. Neural stem cell (NSC) transplantation offers a promising therapeutic tool for the treatment of SCI by providing neuroprotection and neuroregeneration. However, the environment generated after injury limits the therapeutic potential of cell therapies by resulting in poor cell survival and engraftment and inadequate differentiation. In addition, cell therapies have shown limited functional recovery in clinical trials to date. Therefore, the use of combinatorial therapies has been postulated to overcome these limitations and enhance the therapeutic benefits of cell therapies. In this doctoral thesis, we have studied different combination strategies with NSC transplantation, such as the use of drugs and biomaterials, with the aim of improving and enhancing the effect of cell therapy in the rescue of neuronal activity, in the modulation of the inflammatory process, in the survival of the transplant, as well as in its integration and differentiation in the medullary tissue. Thus, In Chapter 1 we evaluated the combined therapy of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem cells (iPSC-NSCs), mesenchymal stem cells (MSCs) and a curcumin nanoconjugate (PA-C) in a subacute LM model, providing a higher degree of neuroprotection compared to single treatments. In Chapter 2, we developed a minimally invasive strategy by using a demilune hyaluronic acid scaffold for combined transplantation of iPSC-NSCs with PA-C. Thus, histological analyses demonstrated that the combined treatment of iPSC-NSCs and PA-C exhibited increased preservation of neuronal fibers in the lesion area and a reduction in the extension of the fibrotic scar. Finally, Chapter 3 describes a therapeutic strategy that more closely approximates clinical translation by transplanting human fetal neural progenitors (hfNPCs) preconditioned with a conjugated form of the Rho/Rock inhibitor fasudil (PGA-SS-FAS). Thus, the combination of hfNPCs with PGA-SS-FAS favored transplant migration within the spinal parenchyma, preservation of endogenous inhibitory Lbx1 and excitatory Tlx3 somatosensory interneurons, as well as endogenous neuronal activation around the lesion epicenter. Thus, this PhD thesis studies and describes the benefit provided by three combinatorial strategies, which increase the neuroprotective effects provided by cell therapy in the treatment of acute and sub-acute spinal cord injury. / This research was funded by Fundació Marató TV3 2017/refs.20172230, 20172231 and 20172110; FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación–Agencia Estatal de Investigación “RTI2018- 095872-B-C21/ERDF”, Agencia Valenciana de Innovación (AVI) INNVAL10/19/047 and TERCEL (RD12/0019/0011) funds from the Instituto de Salud Carlos III of Spain; Science by Women program, Women for Africa Foundation to HE and the grants FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-B-C21 and –C22/ERDF]; RISEUP project FetOpen in H2020 Program: H2020-FETOPEN-2018-2019-2020-01 and by Grants RTI2018-095872-B- C21 and PDI2021-1243590B-I00/ERDF funded by MCIN/AEI//10.13039/501100011033 and by ERDF A way of making Europe). This project was also funded by Project 964562 (RISEUP), H2020 FetOpen program / Bonilla Villamil, P. (2022). Study of Combinatorial Cell Therapy and Neuroprotective Agents for the Treatment of Spinal Cord Injury in Experimental Models [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/191500 / Compendio