Les malalties cerebrovasculars constitueixen la patologia neurològica més freqüent i representen la tercera causa de mort en els països desenvolupats. Entre elles la patologia vascular isquèmica constitueix el grup més important ja que representa les 3/4 parts del total de pacients. L'objectiu central d'aquesta tesi ha estat l'estudi de determinats aspectes de la patologia vascular cerebral isquèmica mitjançant l'ús d'un model experimental, el jerbu, el qual per les seves caracteristiques anatòmiques permet reproduïr la mateixa lesió en els diferents animals estudiats.A la gènesi de la mort cel·lular secundària a la isquèmia s'han implicat múltiples factors, entre ells l'augment de les concentracions intracel·lulars de calci. En aquest sentit, la presència de determinades substàncies tamponadores, com les proteïnes fixadores de calci, poden proporcionar una major resistència a les cèl·lules en front a situacions adverses com la isquèmia.Per altra part, les cèl·lules de l'hipocamp presenten, després d'una isquèmia cerebral transitòria, una mort retardada per maduració. Aquest fenomen de mort pot estar relacionat amb la síntesi de determinades proteïnes que condicionen la mort cel·lular d'una forma activa de manera similar al que succeeix a l'apoptosi.Els primers canvis morfològics en els jerbus adults van ser visibles per microscopia òptica a partir de les 24-48 hores postisquèmia. Aquestes alteracions eren molt més evidents a partir del 3r-4t dia de supervivència, sobretot a la regió CAl de l'hipocamp. Les alteracions morfològiques de les neurones de la regió CAl de l' hipocamp al cap de 4 dies de supervivència es caracteritzaven per una condensació puntejada de la cromatina nuclear i un encongiment citoplasmàtic. Així mateix, un petit grup de neurones disperses per la regió CAl, mostraven un nucli uniformement condensat i de coloració molt fosca. En cap cas es va observar fragmentació del nucli, la qual cosa és característica de l'apoptosi.En estudiar la immunoreactivitat per a parvalbúmina a l'hipocamp del jerbu adult després d'isquèmia cerebral transitòria es va observar, a totes les regions de l'hipocamp, una disminució d'immunoreactivitat, amb un màxim al cap de 6 hores de supervivència postisquèmia. Posteriorment, a partir de les 24 hores postisquèmia, s'observà una progressiva recuperació de la immunoreactivitat, que es iniciar a la regió CA3 i fascia dentada afectant finalment també a la regió CAL. Aquest augment condiciona que al cap de 7 dies de supervivència postisquèmia, el número de neurones amb immunoreactivitat per a parvalbúmina era superior a l'observat en el grup control. Aquests resultats suggereixen que les neurones de la regió CAl de l'hipocamp del jerbu adult que contenen pnrvalbúmina presenten una major supervivència en relació a la isquèmia que les neurones de projecció.Per tal d'estudiar la implicació de la síntesi de proteïnes en la gènesi de la MCR, així com analitzar les similituds i diferències entre MCR i apoptosi, es va administrar un inhibidor de la síntesi de proteïnes, la cicloheximida, a diferents dosis i pautes després de la isquèmia. Els resultats ens mostraren que la cicloheximida administrada a dosis altes produïa un augment significatiu del número de cèl·lules mortes. No obstant, si s'administrava a dosis baixes disminuïa de forma molt discreta el número total de cèl·lules mortes a la regió CAl.En comparar els mecanismes implicats en la MCR i en la mort induïda per radiacions durant el desenvolupament, el qual és un model d'apoptosi, varem observar que la MCR induïda per isquèmia presenta característiques morfològiques diferents de l'apoptosi.Per altra part, s'han utilitzat diferents dosis i vies d'administració (intraperitoneal i intratecal) de la Fructosa-1,6-bisfosfat en el jerbu després d'isquèmia cerebral transitòria per tal d'avaluar els seus efectes sobre la MCR. No es van observar diferències significatives entre el grup control i els grups que havien rebut FBP en quant al número de cèl·lules mortes a la regió CAl de l' hipocamp, el que suggereix que la FBP no ofereix cap efecte beneficiós sobre la NCR en el jerbu després d'isquèmia global transitòria.Considerant el patró de vulnerabilitat en front a isquèmia transitòria durant el desenvolupament de l'hipocamp del jerbu, no es pot correlacionar el contingut intracel.lular de parvalbúmina amb la mort induïda per isquèmia. Així mateix, tampoc no hi ha relació entre el contingut de calbindina i la vulnerabilitat a la isquèmia de l'hipocamp durant el desenvolupament postnatal del jerbu.Finalment, la producció d' APP després de la isquèmia està associada amb l'hiperplàsia dels astròcits però no amb hipertrofia astroglial. / Parvalbumin immunoreactivity is examined in the hippocampus of the Mongolian gerbíl ("Meriones unguiculatus") in controls and in animals subjected to 20 minutes of forebrain ischaemia produced by bilateral clipping of the carotids.Parvalbumin immunoreactivity is rapidly and ephemerally increased in the hippocampus 15 minutes after reperfusion. Later on, there is a transitory decrease of parvalbumin immunoreactivity which is followed by an increase six hours later in the "stratum granulare", "hilus" and CA3 area, and not until the first and second day in the CAl area. On the other hand, GABA-immunoreactive neurons in CAl are preserved during the first week after reperfusion, although an increase in the number of these cells occurs at the end of this period. Delayed neuronal death occurs in the CAl area 48 h after ischaemia, and marked reduction in the number of CAl neurons is found by the end of the first week. These findings indicate that GABAergic neurons in CAl are preserved after forebrain ischaemia, and that parvalbumin in Cal neurons is associated with survival.The effects of the protein synthesis inhibitor cycloheximide on delayed neuronal death following 20 minutes of bilateral forebrain ischemia were examined in the gerbil hippocampus at the fourth day of reperfusion. The results indicate that the effects of cycloheximide are dose dependent, low doses reduce, high doses increase cell death. These findings also indirectly suggest that protein synthesis may play a role in the extent of delayed neuronal death.Vulnerability following transient forebrain ischemia and the maturation of parvalbumin or calbindin D-28K immunoreactivity, was examined in the hippocampus of gerbils during postnatal development. The findings show that the pattern of selective vulnerability following transient ischemia is different in young and adult gerbils, and suggest that no correlation exist between resistance to ischemic damage and calcium-binding protein content.Sprague-Dawley rats aged from 1 to 15 days were irradiated with a single dose of 200 cGy X-rays and killed at different intervals. X-ray-induced cell death in the hippocampal complex of the developing rat is subjected to determinate temporal and regional patterns of vulnerability; it is an active process mediated by protein synthesis.

La apoptosis es una forma de muerte controlada por unas proteasas llamadas caspasas. La activación de las caspasas lleva a la desintegración controlada de la célula y a su fagocitación por parte de macrófagos. La necrosis es una forma de muerte que no depende de caspasas, pero que sí que puede tener un control y ser homeostático. Buena parte de los tumores presentan la característica de tener un metabolismo glicolítico superior al de la mayoría de los tejidos. Además, esta gran dependencia en la glucosa hace a las células bastante sensibles tanto a su ausencia como a la inhibición del metabolismo glicolítico. Esta característica es usada tanto en diagnóstico como en tratamientos en pruebas: la 2-deoxiglucosa se está utilizando en ensayos clínicos. Otra característica de las células tumorales es la de ser resistentes a muchos inductores de muerte, tanto de apoptosis como de necrosis mediante la inducción de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 o la inhibición de las proapoptóticas BH3. Además, muchos tumores sólidos pueden sufrir ambientes con escasez de nutrientes. Se da la coincidencia de que muchos oncogenes están a su vez relacionados con el metabolismo. Todos estos datos hacen interesante el estudio del efecto de la privación de glucosa sobre varios tipos celulares. Por un lado, caracterizar los efectos de la privación de glucosa en células que tienen bloqueada la vía mitocondrial de la apoptosis al ser deficientes en las proteínas Bax y Bak (DKO). Por otro, estudiar los efectos de la privación de glucosa en células tumorales humanas. Dentro de esta caracterización, es importante averiguar si se mueren por apoptosis o necrosis. Qué elementos reguladores están implicados, protectores o sensibilizadores. Si es apoptosis, y la muerte depende de caspasas, averiguar qué caspasas son las iniciadoras y cómo se están activando. Y cuál es el papel del metabolismo en general y de la autofagia en particular en esta muerte. En esta tesis se muestra cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes en Bax y Bak. Y que esta actividad caspasa es dependiente de la caspasa iniciadora 8, no sólo en fibroblastos DKO, sino también en células HeLa. Aquí enseñamos que la apoptosis inducida por la privación de glucosa en células DKO induce actividad caspasa, degradación del ADN, condensación atípica de la cromatina, externalización de la fosfatidilserina y demás rasgos típicos de apoptosis como el corte de sustratos específicos de caspasas. Todo esto, excepto la condensación de la cromatina es inhibido por inhibidores de caspasas. Nosotros hemos demostrado que la privación de glucosa induce apoptosis independientemente de la interacción de ligandos y receptores de muerte. Así mismo, hemos demostrado que la activación de caspasa-8 no se inhibe por FLIP, y probablemente FADD no es la molécula adaptadora o reclutadora de caspasa-8. Hemos intentado ver si otros mecanismos de activación de la caspasa-8 que han sido publicados en los últimos años podrían ser la causa. FLIP no está implicados en la muerte inducida por privación de glucosa. Un posible reclutamiento de la caspasa-8 al complejo formado por RIPK1 no es el responsable, ni tampoco la actividad kinasa de RIPK1 ya que la necrostatina no protege de la muerte. El estudio del papel de la autofagia da resultados contradictorios. Por un lado, la autofagia sería un proceso que sensibilizaría a las células a la privación de glucosa, ya que la 3-metil-adenina protege, y las células deficientes en Atg7 están también protegidas. Pero por otro lado, la autofagia no tendría un papel importante, porque la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. La privación de glucosa induce una acumulación de p62, que no parece ser la causa de la activación de la caspasa-8 ya que su silenciamiento no protege. / Apoptosis induced by most stimuli proceeds through the mitochondrial pathway. One such stimulus is nutrient deprivation. In this study we studied death induced by glucose deprivation in cells deficient in Bax and Bak. These cells cannot undergo mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP) during apoptosis, but they undergo necrosis when treated with MOMP-dependent apoptotic stimuli. We find in these cells that glucose deprivation, rather than inducing necrosis, triggered apoptosis. Cell death required caspase activation as inhibition of caspases with peptidic inhibitors prevented death. Glucose deprivation-induced death displayed many hallmarks of apoptosis, such as caspase cleavage and activity, phosphatidyl-serine exposure and cleavage of caspase substrates. Neither overexpression of Bcl-xL nor knockdown of caspase-9 prevented death. However, transient or stable knockdown of caspase-8 or overexpression of CrmA inhibited apoptosis. Cell death was not inhibited by preventing death receptor-ligand interactions, by overexpression of c-FLIP or by knockdown of RIPK1. Glucose deprivation induced apoptosis in the human tumor cell line HeLa, which was prevented by knockdown of caspase-8. Thus, we have found that glucose deprivation can induce a death receptor-independent, caspase-8-driven apoptosis, which is engaged to kill cells that cannot undergo MOMP.

L'objectiu d'aquesta tesi ha estat buscar nous agents inductors de diferenciació, aturada del cicle cel·lular o mort cel·lular, per a les cèl·lules de neuroblastoma humà, més eficaços i més selectius que els fàrmacs utilitzats en la teràpia actual. Amb aquesta finalitat, hem estudiat l'efecte ex vivo en diferents línies cel·lulars de neuroblastoma humà de dos compostos, el pigment bacterià prodigiosina, i l'inhibidor general d'histona desacetilases de classe I/II tricostatina A. La PG ha mostrat tenir un efecte citotòxic i citostàtic en les línies de neuroblastoma. Indueix mort cel·lular per mecanismes apoptòtics dependents de caspases, i especialment en les cèl·lules de neuroblastoma tipus N, les fenotípicament més agressives. No obstant la inhibició de l'activació de les caspases no reverteix complertament la mort cel·lular, indicant la implicació d'altres mecanismes de mort cel·lular en el procés desencadenat per PG. L'aturada de la proliferació cel·lular és en canvi molt més acusada en les cèl·lules tipus S, tot i que és un fenomen observat en totes les cèl·lules estudiades. A més a més, en el present treball hem descrit com la PG, després de la seva entrada per difusió en la cèl·lula, s'acumula especialment en els mitocondris, induint un efecte desacoblant entre la cadena respiratòria i l'activitat de l'ATPasa-F0-F1 mitocondrial de les cèl·lules de neuroblastoma. Com a resultat, la producció d'ATP es veu disminuïda notablement però la taxa de consum d'oxigen no s'altera. Nosaltres suggerim que l'explicació a aquest fet podria trobar-se en l'habilitat que té la PG per a atrapar protons a pH fisiològic, modificant així els gradients de pH intracel·lulars, no tant sols els vesiculars i els lisosomals, si no també molt possiblement els intramitocondrials. Al capítol dos es descriuen els resultats de l'estudi del tractament de les cèl·lules de neuroblastoma amb TSA. El TSA indueix una aturada del cicle cel·lular en G2/M i apoptosi, però també autofàgia, procés fins al moment no descrit en aquestes cèl·lules com a resposta a l'exposició a HDIs, no havent-se observat diferències en aquests efectes entre les cèl·lules neuroblàstiques tipus N, S i I. En concordança amb estudis previs, la disminució de la proliferació i l'aturada en G2/M ha resultat ser conseqüència d'un procés independent de les caspases. Probablement associat a l'augment d'expressió de l'inhibidor de CDKs p21WAF/Cip1 i a l'activació de la via supressora de tumors del RB, tal i com suggereix la disminució de l'expressió de N-Myc, E2F-1 i Survivina, tots ells implicats en aquesta via, i a més a més marcadors de mal pronòstic en el neuroblastoma. Podent ser la disminució de la Survivina responsable per si sola del desencadenament de l'apoptosi. No obstant, l'efecte del TSA no ha estat el mateix en totes les línies cel·lulars de neuroblastoma estudiades, sent les cèl·lules SK-N-AS les més resistents. En aquestes cèl·lules, tot i activar-se els mateixos mecanismes que en la resta de cèl·lules estudiades, la disminució de la viabilitat és molt reduïda i, a les dosis utilitzades, sembla prevaldre un efecte citostàtic. És més, mentre en les cèl·lules LA1-55N, SK-N-JD i LA1-5S, apoptosi i autofàgia semblen estar induint-se simultàniament i col·laborar en la mort cel·lular induïda pel TSA, en les SK-N-AS els resultats suggereixen que aquests dos mecanismes tenen finalitats antagòniques, de manera que l'autofàgia promou la supervivència cel·lular. Així doncs, els resultats obtinguts indiquen que els dos compostos són capaços d'induir una disminució de la viabilitat cel·lular deguda a una aturada de la proliferació i/o a la mort cel·lular. A més a més, els resultats de l'exposició de les cèl·lules als dos compostos són prou diferents als produïts pels anticancerígens convencionals, com per considerar-se el seu assaig en diferents combinacions amb altres quimioteràpics. / "Characterization of cell death in human neuroblastoma cell lines."TEXT:The objective of this thesis was to look for new agents capable to induce differentiation, cell cycle arrest or cell death in neuroblastoma human cells, more efficient and selective than the ones use in actual therapy. With this purpose, we have studied the ex vivo effect of two compounds in different human neuroblastoma cell lines, the red pigment prodigiosin, and trichostatin A, a general inhibitor of histone deacetylases of class I/II. Prodigiosin showed a cytotoxic and cytostatic effect in neuroblastoma cells. It induced cell death through caspase-dependent apoptotic mechanisms, especially in N-type neuroblastoma cells, the more aggressive ones. We suggest this effect could be explained by prodigiosin ability to capture protons at physiologic pH, modifying the intracellular pH gradients.At the second chapter we described the effect of trichostatin A in this cell model. Trichostatin-A induces a G2/M-cycle arrest, apoptosis and authopagy in the three types of neuroblastoma cells, N-, I- and S-type. However, not all the cells exhibited the same sensibility, being the SK-N-AS cells the more resistant to this compound. Moreover, while in LA1-55N, SK-N-JD and LA1-5S cells apoptosis and autophagy seem to be induced simultaneously and to collaborate in TSA-induced cell death, in SK-N-AS cells these two mechanisms seem to have antagonic purposes, leading autophagy to cell survival.In conclusion, the results indicate that these two agents are able to induce a decrease in cell viability because of cell-cycle arrest and/or cell death. Furthermore, the consequences of the exposition of the cells to these compounds are different enough to the obtained by conventional therapy, to consider its assay with different combinations of other chemotherapy agents.

L'objectiu general d'aquesta tesi ha sigut caracteritzar el paper de determinades molècules en relació a l'apoptosi durant la preservació d'òrgans, per poder modificar-la farmacològicament i predir-la. La isquèmia provoca una sèrie d'alteracions que poden conduir a la mort cel·lular, que pot ser tant per necrosi com per apoptosi. Recentment, l'apoptosi està prenent importància en el trasplantament d'òrgans, ja que la presència d'aquesta s'ha relacionat amb la integritat i la viabilitat de l'empelt i, per tant, amb el futur del pacient. Durant la isquèmia (tant freda com calenta) ocorren diversos fenòmens que provoquen alteracions de molècules i substàncies, que poden modular el desenvolupament de l'apoptosi. Un dels primers esdeveniments conseqüència de la isquèmia és la degradació de l'ATP. Aquest fet, indueix l'acumulació dels seus productes, substàncies que varien en funció del temps d'isquèmia, com poden ser l'adenosina i la xantina. L'adenosina pot induir l'alliberació d'òxid nítric i la xantina, actuant com a substrat de la xantina oxidasa, pot generar superòxid posteriorment. Tant l'òxid nítric com les espècies reactives d'oxigen s'han relacionat com a molècules senyalitzadores d'apoptosi. Per altra banda, una altra de les conseqüències principals de la isquèmia és l'alteració del citoesquelet. S'ha observat molt recentment que aquestes alteracions poden induir el desenvolupament d'apoptosi en determinats tipus cel·lulars. Així doncs, la hipòtesi de treball d'aquesta tesi va ser que, determinades substàncies i molècules que s'alteren o varien en funció del temps d'isquèmia, poden ser moduladores del desenvolupament de l'apoptosi. Per tant, l'acció farmacològica sobre aquestes substàncies, podria prevenir o disminuir el desenvolupament del suïcidi cel·lular. A més a més, la predicció d'aquests fenòmens durant la preservació podria ser una eina molt útil alhora de determinar la viabilitat dels òrgans. Concretament adenosina i xantina (productes de la degradació d'ATP) i les alteracions del citoesquelet d'actina han sigut l'objecte dels nostres estudis.Els estudis realitzats en la present tesi ens han portat a descriure la implicació de l'adenosina i la xantina en la modulació del desenvolupament d'apoptosi durant la isquèmia i reperfusió i, que en el cas de l'adenosina, aquesta inducció esta mediada per l'òxid nítric. Aquest augment en la mort cel·lular per apoptosi es pot minimitzar a través de l'addició de fructosa-1, 6-difosfat i teofil·lina a la solució de preservació, fet que no només disminueix de forma molt marcada l'apoptosi sinó que també evita la translocació bacteriana al posterior trasplantament. Per altra banda, el desenvolupament de l'apoptosi a la reperfusió depèn de les modificacions en el citoesquelet d'actina durant la preservació renal. Finalment, i en relació amb l'estudi de marcadors de predicció de viabilitat, hem demostrat que la monitorització de la bioimpedància elèctrica dels òrgans pot ser una eina molt útil en aquest sentit, ja que permet discriminar durant la preservació entre els ronyons que han patit isquèmia calenta prèvia i els que no. A més a més, un dels paràmetres derivats d'aquestes mesures (paràmetre "alfa") està relacionat amb les alteracions del citoesquelet d'actina produïdes de forma prèvia al trasplantament. / In the present work, we have studied the mechanism that induces apoptosis activation during the ischemia/reperfusion syndrome. Some of the biochemical events that take place during ischemia may contribute to apoptosis development. One of the first events that takes place is ATP degradation, which induces the accumulation of its catabolic products, substances that are modified according to the ischemic time, such as adenosine and xanthine. These molecules may induce apoptosis through nitric oxide and superoxide respectively. On the other hand, another of the main consequences of ischemia are cytoskeleton alterations. Recently, it has been described that these alterations may induce apoptosis development in some models. Therefore, the aim of this work was to characterize the role of certain molecules in apoptosis development during organ preservation, to be able to modify this type of cell death pharmacologically and to predict it.Our results have shown that apoptosis development during ischemia and reperfusion are modulated by adenosine and xanthine and, that in adenosine's case, this induction is mediated through nitric oxide. Apoptosis cell death might be minimized by theophylline and fructose-1,6-diphosphate addition to the preservation solution, which not only prevents apoptosis development but also avoids bacterial translocation after transplantation. On the other hand, apoptosis development at reperfusion depends on actin cytoskeleton modifications during preservation. Finally, and related to the studies of organ viability markers, we have shown that electrical bioimpedance monitoring could be a very useful tool in this sense, since it's able to identify during preservation if organs have suffered previous warm ischemia. In addition, one parameter derived from these measurements ("alpha" parameter) is related to cytoskeleton alterations produced before transplantation.

El nostre grup ha participat en l'anàlisi dels mecanismes d'acció de la Mitramicina SK (MSK). Hem comparat els efectes de la MSK amb els de la Mitramicina A en les línees cel·lulars de càncer de còlon humà HCT116 silvestre, HCT116 p53-/- i HCT116 p21-/-. Hem demostrat que la MSK és un agent antiproliferatiu més eficaç que la MTA en les tres línees tumorals analitzades, ja que inhibeix el creixement cel·lular a dosis més reduïdes.En aquest treball s'han analitzat els mecanismes de mort cel·lular a través dels quals la MSK exerceix el seu efecte antiproliferatiu. Hem demostrat que aquesta molècula pot induir diferents mecanismes de mort cel·lular depenent del fons genètic: apoptosi, necrosi i/o catàstrofe mitòtica. En les cèl·lules HCT116 p53+/+, la MSK indueix una aturada en la fase G1 del cicle cel·lular, la qual és depenent de p53 i p21(WAF1). La reentrada en el cicle afavoreix l'augment de cèl·lules poliploides, les quals finalmente moren per catàstrofe mitòtica que es produeix amb un fenotip necròtic, tot i la presència d'activitat caspasa 3. En les cèl·lules HCT116 p53-/-, la MSK provoca una aturada en la fase G2 del cicle cel·lular, la qual és depenent de p21(WAF1), i una posterior inducción d'apoptosi. L'apoptosi es produeix per una via independent de la mitocòndria en absència d'activitat caspasa 3, però amb activitat caspasa 2. En les cèl·lules HCT116 p21-/-, la MSK provoca una aturada en la fase G2 del cicle cel·lular, la qual és depenent de p53, i una posterior inducció d'apoptosi per la via de caspasa 2 depenent de la mitocòndria. Un petit percentatge de la població cel·lular escapa de l'aturada del cicle i entra en mitosis en absència de citocinesis, donant com a resultat cèl·lules poliploides. Es suggereix que la caspasa 2 és responsable de la mort cel·lular en cèl·lules deficients en p53. Els canvis en l'activitat de la caspasa 2 podrien esdevenir una diana a explotar en el tractament de tumors que presenten alteracions en el gen p53. La MSK altera la transcripció de gens involucrats en el cicle cel·lular i la mort cel·lular.La inhibició de la transcripció sembla produir-se principalment, però no exclusivament, en gens amb seqüències d'unió de Sp1, les quals poden ser reconegudes directament pel fàrmac. La inhibició de la transcripció correlaciona, en general, amb els canvis en els nivells d'expressió de les proteïnes per les que codifiquen. Els canvis en els nivells de certes proteïnes en cèl·lules HCT116 tractades amb MSK permeten explicar els mecanismes de mort cel·lular (apoptosi, necrosi i/o catàstrofe mitòtica). / We have compared the effects of Mithramycin SK (MSK) with those of the Mithramycin A in human colon carcinoma cell lines HCT116 wild-type, HCT116 p53-/- and HCT116 p21-/. We have demonstrated that MSK is an antiproliferative agent more effective than MTA on the three analyzed cell lines, since it inhibits the cellular growth at more reduced doses.In HCT116 p53+/+ cells, MSK arrests cells in the G1 phase of the cell cycle, which depends on p53 and p21(WAF1). The re-entry in the cycle favors the increase of polyploidy cells, which finally die by mitotic catastrophe that is produced with a necrotic phenotype, in spite of the presence of caspase 3 activity. In HCT116 p53-/-cells, MSK arrests cells in the G2 phase of the cell cycle, which depends on p21(WAF1), and a posterior induction of apoptosis. Apoptosis is activated by a mitochondriaindependent way in absence of caspase 3 activity, but with caspase 2 activity. In HCT116 p21-/- cells, MSK arrests cells in the G2 phase of the cell cycle, which depends on p53, followed by the induction of apoptosis via caspase 2 depending on the mitochondria. A small percentage of the cellular population may escape from cell arrest of the cycle and enters in mitosis in absence of cytokineses, giving polyploid cells as a result. We suggest that caspase 2 is responsible for the cell death in p53 deficient cells.The changes in the activity of the caspase 2 could be a target to exploit in the treatment of tumors that present alterations in the gene p53. MSK alters the transcription of genes involved in both cell cycle and cell death. The inhibition of the transcription seems to take place mainly, but not exclusively, on genes bearing Sp1-binding sequences, which can be recognized directly by the drug. The inhibition of the transcription correlates, in general, with the changes of the levels of protein expression. Changes of certain proteins levels in HCT116 cells treated with MSK would explain the mechanisms of cell death (apoptosis, necrosis and/or mitotic catastrophe).

Nuestro grupo ha participado en el análisis de los mecanismos de acción de la Bisantraciclina WP631. Hemos comparado los efectos de la WP631 con los de la Daunorubicina en la línea Jurkat T (leucemia de linfocitos T), y con los de la Doxorubicina en las líneas MDA-MB-231 y MCF-7/VP (líneas de carcinoma mamario). Hemos demostrado que la WP631 es un agente antiproliferativo mucho más eficaz que la Daunorubicina y la Doxorubicina en las tres líneas tumorales analizadas, ya que inhibe el crecimiento celular a dosis muy reducidas (en el rango de nanomolar). En este trabajo se han analizado los mecanismos de muerte celular a través de los cuales las Antraciclinas ejercen su efecto antiproliferativo. Hemos demostrado que estas moléculas pueden inducir mecanismos distintos a la apoptosis dependiente de p53: senescencia y catástrofe mitótica, procesos que no dependen necesariamente de la funcionalidad del gen p53. Los efectos antiproliferativos de la Daunorubicina sobre las células leucémicas Jurkat T dependen de la dosis utilizada: apoptosis a dosis altas (IC75) y senescencia a dosis bajas / moderadas (IC50). La WP631 no induce apoptosis en la línea Jurkat T, sino catástrofe mitótica. El efecto antiproliferativo de la Doxorubicina y la WP631 en las líneas de carcinoma mamario MDA-MB-231 y MCF-7/VP, resistentes a la apoptosis, tiene lugar a través de la inducción de catástrofe mitótica. Nuestros resultados demuestran que la catástrofe mitótica se produce cuando las células tumorales resistentes a la apoptosis se tratan con genotóxicos, y puede ser un proceso tanto dependiente como independiente de la activación de la caspasa-2 y la caspasa-3. Mediante el uso de Macroarrays, hemos demostrado que existe una clara correlación entre las variaciones en los perfiles de transcripción génica y los efectos celulares observados en células Jurkat T tratadas con Daunorubicina o WP631. Confirmamos alguno de los cambios observados mediante RT-PCR semicuantitativa y Western blot. Comprobamos que la WP631 reduce la expresión de p53 en células Jurkat T, resultado que explica que la Bisantraciclina indujera catástrofe mitótica y no apoptosis en esta línea celular. Hemos confirmado que la WP631 compite con los factores de transcripción Sp1 y Sp3, e inhibe la transcripción dependiente de Sp1 in vivo (cultivos celulares), a las mismas concentraciones capaces de inducir la catástrofe mitótica en las células Jurkat T. Hemos demostrado que la dosis IC75 para la WP631 reduce la transcripción del gen mrp-1 en la línea celular MCF-7/VP, lo que se traduce en la reducción de la actividad de la proteína MRP-1. Este efecto podría estar mediado, también, por la interferencia de la WP631 con el factor de transcripción Sp1, que regula positivamente la expresión del gen. Dado que la sobreexpresión del gen mrp-1 está asociada a la resistencia múltiple a antitumorales, la WP631 es una molécula con interés clínico potencial en el tratamiento de tumores con fenotipo MDR (Multidrug Resistance). En definitiva, en este trabajo hemos demostrado las ventajas potenciales de la WP631 sobre la Daunorubicina y la Doxorubicina. Estas ventajas radican en sus propiedades de unión al DNA y en su capacidad de desplazar al factor de transcripción Sp1. El análisis de las frecuencias de las dianas potenciales de unión para la WP631 en diferentes promotores humanos, nos indica que es factible diseñar racionalmente moléculas de bajo peso molecular con constantes de unión al DNA del mismo orden de magnitud que la de los factores de transcripción, pudiéndose obtener fármacos cada vez más eficaces. Por otro lado, consideramos que el análisis en profundidad de los mecanismos moleculares que regulan los procesos de senescencia y catástrofe mitótica ha de constituir una herramienta muy útil para poder incrementar la eficacia en determinados tratamientos antitumorales, ya que el gen p53 se encuentra frecuentemente inactivado en tumores de origen no hematológico. ENGLISH / WP631 is a DNA-binding drug that bisintercalates into DNA. We have established that WP631 is more cytotoxic than daunorubicin and doxorubicin against Jurkat T lymphocytes and the breast carcinoma MDA-MB-231 and MCF-7/VP cell lines. Exposure of Jurkat T lymphocytes to high concentrations of daunorubicin (its IC75) resulted in immediate apoptosis, while low/moderate concentrations of daunorubicin (its IC50) caused cell senescence-like arrest and cell death. In contrast, WP631 induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells, a different mode of death than apoptosis, which does not require functional p53. After treatment with doxorubicin or WP631, MDA-MB-231 and MCF-7/VP cells were committed to die through mitotic catastrophe. Our results indicate that cells dying through mitotic catastrophe can use both caspase-dependent and independent pathways. We used cDNA Macroarrays to asses gene expression profiles in Jurkat T cells treated with daunorubicin or WP631. Gene expression profiles and time-dependent response of Jurkat T lymphocytes to cell death were correlated clearly. Treating cells with WP631 inhibited the transcription of the p53 gene, resulting in a decrease of the protein levels. Our findings suggest that suppression of the p53 expression produced limited apoptosis and induced mitotic catastrophe in Jurkat T cells treated with WP631. Our results show that WP631, used at the same concentration that induces mitotic catastrophe in Jurkat T cells, specifically inhibits Sp1-dependent transcription in vivo (cell culture). Overexpression of the MRP-1 protein confers resistance to several chemotherapeutic agents. The mrp-1 promoter contains a Sp1 binding site, which is involved in the regulation of its gene transcription. We aimed to determine whether WP631 directly inhibits the expression of mrp-1 in MCF-7/VP cells. We have demonstrated that when MCF-7/VP cells were incubated with the IC75 for WP631, the expression of the mrp-1 gene decreased, resulting in the circumvention of the drug pump efflux, and cell death. We have also studied the frequencies with which potential WP631-binding sites are found in human gene promoters. Our results indicate that sequences of 6-8 pb in length occur only once in some promoters, and may be specific therapeutic targets.

L´apoptosi, o mort cel.lular programada, és un procés actiu que mobilitza els recursos cel.lulars amb l´objectiu de mantenir l´homeostasi de l´organisme a expenses del suïcidi de cèl.lules individuals. Diferents estudis han mostrat un increment de l´activiat d´algunes cdk, especialment Cdk1 i Cdk2, en correlació amb la progressió dels primers estadis apoptòtics. En el nostre laboratori l´estudi de l´apoptosi en timòcits, els quals no tenen una activitat cdk significativa degut a l´aturada del cicle cel.lular en G1, demostren que la inducció de l´activitat de Cdk2 després del tractament amb radiació gamma o amb glucocorticoides és necessària per l´inici de l´apoptosi. Mentre cap de les ciclines conegudes sembla ser la proteïna activadora de Cdk2 en apoptosi, en el nostre laboratori hem identificat un nou membre de la família de les ciclines, denominada Ciclina O, capaç d´activar aquesta kinasa in vivo en línies cel.lulars. L´expressió d´aquesta nova ciclina en el timus, i altres teixits, s´indueix ràpidament després del tractament amb radiació gamma i coincideix amb l´aparició de l´apoptosi. Aquests resultats posicionen la Ciclina O com a millor candidat a ser l´activador de Cdk2 necessari per induïr la mort cel.lular programada en el timus, i probablement també en altres òrgans. / The apoptosis, also called programmed cell death, is an active process able to use the cellular mechanisms to kill individual cells in order to keep the functional homeostasis of the whole organism. Different studies had shown a correlation between the first apoptotic events and the induction of some cdk proteins, particularly Cdk1 and Cdk2. The studies of thymocytes in our laboratory, wich lacks the most amount of cdk activity related to the cell cycle because of its arrest in G1, had shown that the induction of Cdk2 activity after the treatment with gamma radiation or glucocorticoids is a necessary step for the apoptosis induction. While any of the cyclins described at the moment seems to be the Cdk2 activator for apoptosis a new member of the cyclin family able to activate the kinase Cdk2 in vivo in cell lines has been identified in our laboratory. The expresion of this cyclin, known as Cyclin O, is quickly induced in the thymus after the treatment with gamma radiation and correlates with the induction of apoptosis. These results position Cyclin O as the best candidate to activate Cdk2 and inuce the programmed cell death in the thymus, and probably other tissues.