Reproducimos a nivel experimental, utilizando cerdos como animal de experimentación, un trasplante con donante a corazón parado. Se extraen los riñones del donante a corazón parado, se conservan durante 6h-8h en isquemia fría y se practica el implante. El animal se mantiene vivo durante 5 días, al término del cual se procede a la necropsia del animal para analizar el estado del injerto. El animal se mantiene inmunodeprimido durante todo el periodo.Hemos realizado 40 trasplantes renales divididos en grupos de 10 trasplantes:Grupo 0: grupo control. Corazón latiente.Grupo 1: riñones sometidos a 40 minutos de isquemia calienteGrupo 2: riñones sometidos a 40 minutos de isquemia caliente y recirculación extracorpórea durante 30 minutos.Grupo 3: riñones sometidos a 90 minutos de isquemia caliente y recirculación extracorpórea durante 30 minutos.Se han realizado 5 biopsias renales a lo largo del experimento en cada animal determinando el nivel tisular de antioxidantes (superóxido dismutasa, glutation reductasa y glutation peroxidasa)mediante técnica de espectrofotometría Oxis® adaptados al autoanalizador de Cobas Mira (Roche®)y la carga energética, según la fórmula de Atkinson, mediante HPLC.La viabilidad del injerto se ha determinado por una biopsia renal al 5º día (ausencia de necrosis cortical)Por primera vez en la literatura médica se realiza un estudio sobre el nivel tisular de antioxidantes en un trasplante renal de forma evolutiva, añadiendo el efecto de la recirculación y con tiempos diferentes de isquemia caliente prolongados. Conclusiones:1-Viabilidad: 100% en el grupo 0 y en el 2, 66% en el grupo 1,60% en el grupo 32-Patrón de actuación de los antioxidantes en las diferentes fases del trasplante: la SOD disminuye la concentración en las fases de isquemia caliente y fría y aumenta con la recirculación y con la reperfusión. La glutation reductasa aumenta con la isquemia caliente y reperfusión y disminuye con la recirculación y la isquemia fría. La glutation peroxidasa disminuye con la isquemia caliente y recirculación para aumentar con la isquemia fría y con la reperfusión del injerto.3-Utilidad de los antioxidantes y de la carga energética en predecir la viabilidad del injerto. La carga energética puede predecir la viabilidad y los tres antioxidantes también dependiendo de los diferentes momentos del experimento y del grupo.4- Efecto de la recirculación extracorpórea normotérmica durante 30 minutos sobre el nivel de antioxidantes: mejora la concentración de SOD de forma significativa dejando al riñón con mayor concentración de dicha sustancia al momento del implante.5- Efecto del tiempo de isquemia (40 ó 90 minutos) sobre el nivel tisular de antioxidantes: determinar la glutation reductasa durante la fase de recirculación permite observar mayor concentración de este antioxidante en el grupo de 40 minutos de isquemia caliente y muy baja concentración en el grupo de 90 minutos (p<0,05).

L'objectiu general d'aquesta tesi ha sigut caracteritzar el paper de determinades molècules en relació a l'apoptosi durant la preservació d'òrgans, per poder modificar-la farmacològicament i predir-la. La isquèmia provoca una sèrie d'alteracions que poden conduir a la mort cel·lular, que pot ser tant per necrosi com per apoptosi. Recentment, l'apoptosi està prenent importància en el trasplantament d'òrgans, ja que la presència d'aquesta s'ha relacionat amb la integritat i la viabilitat de l'empelt i, per tant, amb el futur del pacient. Durant la isquèmia (tant freda com calenta) ocorren diversos fenòmens que provoquen alteracions de molècules i substàncies, que poden modular el desenvolupament de l'apoptosi. Un dels primers esdeveniments conseqüència de la isquèmia és la degradació de l'ATP. Aquest fet, indueix l'acumulació dels seus productes, substàncies que varien en funció del temps d'isquèmia, com poden ser l'adenosina i la xantina. L'adenosina pot induir l'alliberació d'òxid nítric i la xantina, actuant com a substrat de la xantina oxidasa, pot generar superòxid posteriorment. Tant l'òxid nítric com les espècies reactives d'oxigen s'han relacionat com a molècules senyalitzadores d'apoptosi. Per altra banda, una altra de les conseqüències principals de la isquèmia és l'alteració del citoesquelet. S'ha observat molt recentment que aquestes alteracions poden induir el desenvolupament d'apoptosi en determinats tipus cel·lulars. Així doncs, la hipòtesi de treball d'aquesta tesi va ser que, determinades substàncies i molècules que s'alteren o varien en funció del temps d'isquèmia, poden ser moduladores del desenvolupament de l'apoptosi. Per tant, l'acció farmacològica sobre aquestes substàncies, podria prevenir o disminuir el desenvolupament del suïcidi cel·lular. A més a més, la predicció d'aquests fenòmens durant la preservació podria ser una eina molt útil alhora de determinar la viabilitat dels òrgans. Concretament adenosina i xantina (productes de la degradació d'ATP) i les alteracions del citoesquelet d'actina han sigut l'objecte dels nostres estudis.Els estudis realitzats en la present tesi ens han portat a descriure la implicació de l'adenosina i la xantina en la modulació del desenvolupament d'apoptosi durant la isquèmia i reperfusió i, que en el cas de l'adenosina, aquesta inducció esta mediada per l'òxid nítric. Aquest augment en la mort cel·lular per apoptosi es pot minimitzar a través de l'addició de fructosa-1, 6-difosfat i teofil·lina a la solució de preservació, fet que no només disminueix de forma molt marcada l'apoptosi sinó que també evita la translocació bacteriana al posterior trasplantament. Per altra banda, el desenvolupament de l'apoptosi a la reperfusió depèn de les modificacions en el citoesquelet d'actina durant la preservació renal. Finalment, i en relació amb l'estudi de marcadors de predicció de viabilitat, hem demostrat que la monitorització de la bioimpedància elèctrica dels òrgans pot ser una eina molt útil en aquest sentit, ja que permet discriminar durant la preservació entre els ronyons que han patit isquèmia calenta prèvia i els que no. A més a més, un dels paràmetres derivats d'aquestes mesures (paràmetre "alfa") està relacionat amb les alteracions del citoesquelet d'actina produïdes de forma prèvia al trasplantament. / In the present work, we have studied the mechanism that induces apoptosis activation during the ischemia/reperfusion syndrome. Some of the biochemical events that take place during ischemia may contribute to apoptosis development. One of the first events that takes place is ATP degradation, which induces the accumulation of its catabolic products, substances that are modified according to the ischemic time, such as adenosine and xanthine. These molecules may induce apoptosis through nitric oxide and superoxide respectively. On the other hand, another of the main consequences of ischemia are cytoskeleton alterations. Recently, it has been described that these alterations may induce apoptosis development in some models. Therefore, the aim of this work was to characterize the role of certain molecules in apoptosis development during organ preservation, to be able to modify this type of cell death pharmacologically and to predict it.Our results have shown that apoptosis development during ischemia and reperfusion are modulated by adenosine and xanthine and, that in adenosine's case, this induction is mediated through nitric oxide. Apoptosis cell death might be minimized by theophylline and fructose-1,6-diphosphate addition to the preservation solution, which not only prevents apoptosis development but also avoids bacterial translocation after transplantation. On the other hand, apoptosis development at reperfusion depends on actin cytoskeleton modifications during preservation. Finally, and related to the studies of organ viability markers, we have shown that electrical bioimpedance monitoring could be a very useful tool in this sense, since it's able to identify during preservation if organs have suffered previous warm ischemia. In addition, one parameter derived from these measurements ("alpha" parameter) is related to cytoskeleton alterations produced before transplantation.

La CsA és un potent immunosupressor àmpliament utilitzat en el trasplantament d'òrgans sòlids que com a principal efecte secundari mostra una elevada toxicitat renal que pot conduir a la pèrdua de la funció renal (Borel J.F. et al., 1976; Bennet W.M. et al., 1983). Els mecanismes moleculars pels quals la CsA exerceix els seu efecte immunosupressor han estat ben estudiats (Schreiber S.L., 1991; Liu J. et al., 1992), no obstant poc es coneix dels mecanismes d'acció a nivell molecular implicats en el dany renal. El tractament de cèl·lules PCT3 i HK-2 amb dosis creixents de CsA (desde 0 fins a 20 µM) demostra que la concentració de 10 µM és una dosi crítica a partir de la qual es posen de manifest varis esdeveniments cel·lulars tals com la disminució de la viabilitat cel·lular de manera dosi i temps dependent, la mort cel·lular per apoptosi, la disminució de la respiració mitocondrial i del percentatge de cèl·lules en fase S. Mitjançant un estudi proteòmic diferencial entre cèl·lules control i cèl·lules tractades amb la dosi 10 µM de CsA s'identifiquen putatius marcadors que ens permeten distingir la toxicitat renal creada per la CsA de la resta de símptomes de la nefropatia crònica i determinar l'evolució del dany renal causat per la CsA per tal de poder ajustar el tractament amb dosis de CsA que no siguin tòxiques. Les ciclofilines són una família de proteïnes expressades de forma ubiqua que posseeixen activitat peptidil-prolil cis/trans isomerasa i que s'uneixen selectivament al fàrmac immunosupressor CsA. La disminució de l'expressió de les ciclofilines mitjançant RNA d'interferència demostra una davallada de la sensibilitat cel·lular al tractament amb CsA. L'anàlisi proteòmic realitzat entre cèl·lules amb una de les dues ciclofilines silenciades gènicament i cèl·lules sense interferir ens ha de permetre esbrinar la participació de la CsA, les ciclofilines A i B o be l'activitat PPIasa d'aquestes en la toxicitat renal. / The use of CsA as a potent immunosuppressant has been limited by its severe nephrotoxic effects. The mechanisms involved are hemodynamic but also related with direct toxic effects of CsA on proximal tubule epithelial cells.CsA-induced toxicity analyses revealed that 10 µM CsA for 24h was the threshold condition to induce significant changes in cell viability and proteomic profile. At this concentration also appears apoptosis, decrease the percentage of cells in S phase and oxygen consumption.By means of high-throughput differential proteomic analyses and mass spectrometry techniques, we identified 38 differentially-expressed proteins on CsA-treated mouse PCT3 and human HK-2 cells, related to protein metabolism, response to damage, cell organization and cytoskeleton, energy metabolism, cell cycle and nucleobase/nucleoside/nucleotidic metabolism. Proteins identified in this work might be useful markers to eventually distinguish CsA toxicity from chronic allograft nephropathy in protocol biopsies of transplanted patients, facilitating the adjustment of CsA doses to non-toxic ranges, as well as, to study the impact of potential therapeutic interventions in an animal model. Cyclophilins are a family of proteins that posses peptidil prolil cis-trans isomerase activity and bind selectively at the immunosuppressant drug CsA. When we decrease the expression of the cyclophilin A or B by RNA interference techniques we observe that the cells are less sensible to CsA citotoxicity. Proteomic analysis between cells with cyclophilin A or B interfered and wild type cells will reveal the role of CsA, cyclophilins and the PPIase activity in the nephrotoxicity.

The hypothesis of this doctoral thesis is two-fold: 1. Excessive portal vein flow is present immediately after portal reperfusion in the recipient and is the instigating factors in a series of events that ultimately lead to the development of “small-for-size” syndrome (SFSS). 2. A calibrated portocaval shunt prevents postreperfusion portal hyperperfusion and, thereby, the development of SFSS in partial liver grafts. The objectives of this doctoral thesis are as follows: 1. To produce a porcine model of acute SFS injury that does not use venovenous bypass, in order to study the presentation of SFSS and characterize the cellular lesion in relation to altered hepatic hemodynamics. 2. To study the effects of modifying portal vein flow through the creation of portocaval shunts of different sizes, each calibrated to achieve a distinct decrease in the amount of flow ultimately reaching the SFS liver graft. 3. To determine the optimal decrease in the amount of portal vein flow that is capable of preventing the deleterious consequences of portal hyperperfusion and improving postoperative graft function and survival in SFS liver grafts. / El trasplante hepático es el único tratamiento para pacientes que presentan enfermedad hepática en estado terminal pero la demanda de injertos hepáticos para trasplante excede enormemente el número de órganos disponibles. Debido a que un hígado sano posee una importante reserva funcional y capacidad regenerativa, el uso de injertos parciales representa una alternativa al trasplante con injertos de hígado completo. Sin embargo, el trasplante de injertos parciales requiere un estudio preoperatorio extenso para asegurar la obtención de un injerto adecuado funcionalmente para el receptor, así como una adecuada masa hepática remanente para el donante, y de este modo evitar el desarrollo del síndrome de “small-for-size” (SFS). Dicho síndrome se diagnostica clínicamente cuando aparece colestasis prolongada, coagulopatía, encefalopatía, ascitis intratable, hemorragia gastrointestinal y/o fallo renal en un paciente con una masa hepática <0.8% del peso del receptor o <30-40% del volumen hepático estándar, una vez se han excluido otras causas. Cuando el síndrome SFS aparece, provoca el fracaso del injerto hasta en el 50% de los receptores. La patogénesis del síndrome SFS es multifactorial y se ha asociado no sólo al hecho de trasplantar una masa hepática reducida, también a la presencia de un excesivo flujo portal, a una dificultad en el drenaje venoso a través de las venas hepáticas, a las condiciones físicas y metabólicas del receptor, a la esteatosis hepática y a una funcionalidad insuficiente del propio injerto en general. El flujo portal en particular es considerado como un factor esencial involucrado en la aparición de la disfunción y el fallo de un injerto hepático parcial. Aparte de una cuidadosa evaluación preoperatoria para evitar el trasplante de un injerto pequeño, se han utilizado varias estrategias adicionales en el ámbito clínico para evitar la aparición del síndrome SFS. La mayoría de dichas estrategias son quirúrgicas y consisten en procedimientos para favorecer el flujo de salida del injerto mediante la reconstrucción de las venas tributarias de la vena hepática media y/o la realización de venoplastias en las venas hepáticas, o en la reducción del flujo de entrada portal al injerto a través de la ligadura de la arteria esplénica, la realización de una esplenectomía y/o la creación de un shunt portocaval parcial. Las estrategias farmacológicas para la prevención de síndrome SFS han sido extensamente aplicadas en el contexto experimental, pero la experiencia clínica es muy limitada. El estudio del síndrome SFS en humanos es complicado ya que su aparición no es frecuente y cuando se sospecha se utilizan todos los mecanismos para intentar evitarlo. Por tanto, para obtener un mejor conocimiento de la patogénesis del síndrome de SFS en el contexto del trasplante hepático parcial, es importante desarrollar un modelo animal apropiado. Para conseguir este objetivo, varios grupos de investigadores han establecido diferentes modelos animales; algunos con animales pequeños como rata y ratón. Sin embargo, los modelos con animales grandes presentan características anatómicas y de tamaño que son directamente aplicables al ámbito clínico.