La pèrdua de 17p13 succeeix en més del 70% dels tumors colorectals, i sòl acompanyar-se de mutació al locus TP53 de l'al·lel concomitant. A banda, hi ha prou indicis per a recolzar la hipòtesi que p53 és un marcador de pronòstic d'aquest tipus de tumors.A manca de consens sobre la millor estratègia per a conèixer el seu estat -no hi ha estàndard d'or-, ens proposàrem com a objectiu trobar un protocol aplicable a l'estudi rutinari de la proteïna p53 en el càncer colorectal. Per això, seleccionarem una sèrie prospectiva de casos d'adenocarcinoma primari, obtinguts per resecció quirúrgica, i d'ells recollirem, a banda dels resultats de la immunohistoquímica (IHQ) de p53, un seguit de dades clinicopatològiques: edat, sexe, mida del tumor, grau histològic, infiltració, afectació ganglionar i estadi clínic. Característiques demogràfiques de la sèrie foren: 100 tumors pertanyent a 96 pacients (38 dones i 58 homes), amb edat de presentació entre 37-93 anys. Els paràmetres obtinguts es resumeixen en: mida mitja dels tumors 4'1 cm, el 51% amb afectació ganglionar, grau histològic predominant moderadament diferenciat o grau 2 (81%) i nivell d'infiltració majoritari pT3 (72%).De l'abordatge IHQ en resultà que el 56% dels tumors evidencià acumulació de p53 (llindar de sensibilitat: 10%), mentre que un 29% dels casos negatius presentà manca total d'immunopositivitat. L'estudi del genotip, mitjançant PCR-SSCP/seqüenciació (exons 4-8), posà de manifest la presència de mutacions en el 68% dels tumors, el 73% de les quals conservaren la pauta de lectura. En analitzar les discrepàncies entre les 2 aproximacions concloguérem que el 39% dels casos fenotípicament negatius contenia mutacions al gen TP53, el que representa un 17% del total. Per contra, el 5% resultà mancat de mutacions -al menys, en els exons estudiats- malgrat presentar acumulació nuclear de p53. La representació mitjançant corba ROC dels resultats d'IHQ permeté afirmar que la tècnica s'ajusta a la de referència (SSCP/seqüenciació) en el càncer colorectal, amb una àrea sota la corba -equivalent de la precisió- del 79%. La regressió logística situà el llindar de sensibilitat òptim per a la IHQ en el 15%, percentatge en el qual es compensen millor els errors falsos, positius i negatius.La detecció de LOH del microsatèl·lit intragènic p53CA posà de manifest que el 63% dels tumors tenia pèrdua del locus TP53. L'anàlisi estadística demostrà una presència superior de mutacions en els tumors que havien perdut l'al·lel normal concomitant, i que els tumors d'estadi superior -en presència d'afectació ganglionar- tendien a presentar pèrdues de 17p.Conclusions: 1) la IHQ és un mètode vàlid per a cribrar alteracions de p53 en el càncer colorectal, malgrat requereixi ésser complementat amb estudis de SSCP/seqüenciació en els tumors de fenotip negatiu (llindar de sensibilitat: 15%); 2) el protocol d'aproximació a l'estat de p53 ha d'incloure la detecció de LOH al locus TP53. / More than 70% of colorectal adenocarcinomas exhibit 17p13 allelic losses, which usually occur with mutation at the TP53 locus of the concomitant allele. There are also studies that suggest that p53 is a prognostic marker for this type of tumors.Since there is no consensus about which is the best approach to assess p53 status -no gold standard has been defined, yet-, we undertook our study to establish a protocol suitable for the routine assessment of this marker in colorectal cancer. With this purpose, we selected a prospective series of primary adenocarcinomas, obtained by surgical resection and from them we compiled, apart from their p53 immunohistochemical results, the following clinicopathological data: age, sex, tumor size, histological grade, degree of invasion, nodal involvement and staging. Demographics of our series were: 100 tumors belonging to 96 patients (38 women and 58 men), 37-93 years of age at tumor presentation. Other parameters can be synthesized as: mean size of tumors 4.1 cm, 51% with nodal involvement, a prevalence of moderately differentiated tumors or grade 2 (81%), and the majority of tumors with pericolic fat invasion or pT3 (72%). The IHC approach allowed the detection of 56% of tumors with p53 protein accumulation (cutoff value: 10%), while up to 29% of the negative cases showed no immunopositivity at all. Genotype studies performed by PCR-SSCP/sequencing (exons 4-8) evidenced the presence of mutations in 68% of tumors, 73% of which preserved their gene reading frame. When discrepancies between the two approaches were analyzed, it was realized that 39% of the phenotypically negative cases were mutated at the TP53 gene, which represents 17% of total cases. On the contrary, 5% of tumors presenting nuclear accumulation of p53 protein resulted to be exempted of mutations, at least in the studied exons. The plot of IHC results by a ROC curve let us determine that this technique fitted to the reference one (SSCP/sequencing) for colorectal carcinoma, being the area under the curve -equivalent to accuracy- of 79%. Logistic regression established the optimal cutoff value at 15%, percentage at which false positive and negative errors are best balanced.Detection of LOH using the intragenic p53CA dinucleotide microsatellite revealed that 63% of tumors had allelic loss at the TP53 locus. Statistical analyses demonstrated a superior presence of mutations in tumors that had lost its wildtype concomitant allele, and also that tumors with higher staging, based on nodal involvement, tended to present 17p allelic loss.Conclusions: 1) IHC is a valid method to screen p53 alterations in colorectal cancer, although it is necessary that negative tumors (cutoff value: 15%) are also complemented by SSCP/sequencing. 2) A protocol to assess p53 status must include the detection of LOH at the TP53 locus.

No description available.

La tesi doctoral engloba l'estudi de les adaptacions funcionals i estructurals que es produeixen en el còlon distal deguts als canvis en la ingesta de sodi. En concret s'ha estudiat el paper de tres hormones, l'angiotensina II, l'aldosterona i la vasopressina, en el transport de Na+, en la permeabilitat de l'epiteli i en el desenvolupament miofibroblàstic de la zona pericriptal. Mitjançant un model animal d'activació del RAAS en rata, s'han reproduït les adaptacions funcionals i estructurals en la mucosa del còlon distal en l'adaptació d'una dieta amb alt contingut en sodi (HS) a una dieta amb baix contingut en sodi (LS). Després de tan sols 3 dies de dieta LS augmenta el transport electrogènic de sodi i disminueix la permeabilitat del teixit, fet que es confirma per un augment en la densitat de les unions estretes, concretament de l'expressió de claudina 4, i per un augment en la resistència transepitelial. S'ha confirmat que en tan sols tres dies de dieta LS, la capa de miofibroblasts presents en la zona pericriptal prolifera, ja que augmenta l'expressió d'alfa-actina de múscul llis i la síntesi de col·lagen IV, augmenta l'expressió de les unions adherents que uneixen aquests miofibroblasts, concretament d'E- i OB-caderina, i es produeix acumulació de sodi en aquesta zona pericriptal. El tractament amb captopril, inhibidor de l'ECA, losartan, inhibidor dels ATr1, o espironolactona, antagonista del receptor mineralcorticoide, reverteix aquests efectes, confirmant la implicació de l'angiotensina II i l'aldosterona. Per determinar el paper concret de l'angiotensina II i de l'aldosterona en aquests efectes s'ha posat a punt un model animal d'activació del RAAS minimitzant la síntesi d'aldosterona mitjançant una operació d'adrenalectomia i controlant la concentració plasmàtica d'ambdues hormones mitjançant la seva infusió exògena. L'aldosterona, sense la presència d'angiotensina II, aconsegueix reproduir els efectes de la dieta LS augmentant el transport electrogènic de sodi, disminuint la permeabilitat del teixit, incrementant la resistència transepitelial, afavorint el creixement miofibroblàstic i augmentant l'acumulació de sodi a la zona pericriptal. L'angiotensina II, en canvi, per si sola no reprodueix aquests efectes. Els resultats obtinguts estan recollits en dues publicacions (Moretó et al., 2005; Cristià et al., 2005). També s'han estudiat els efectes del grau de deshidratació sobre les funcions del còlon distal, comprovant la implicació directa de la vasopressina i determinant els receptor implicats. Tant la deshidratació com concentracions elevades de vasopressina donen lloc a una disminució de la permeabilitat del teixit, un augment en l'acumulació de sodi a la zona pericriptal i un augment del creixement miofibroblàstic. Ambdós tipus de receptors, V1 i V2, hi estan implicats. Aquests resultats, tot i ser similars a les accions de l'aldosterona, no han demostrat un sinergisme entre ambdues hormones. A més, s'ha confirmat l'expressió d'aquaporina-2 (AQP-2) en la mucosa del còlon distal i l'augment de la seva expressió tant en estats de deshidratació com d'administració de vasopressina. L'expressió d'AQP-2 està mitjançada pel receptor V2, ja que tan sols el tractament amb Tolvaptan, un antagonista específic d'aquests receptors, l'inhibeix. Aquest estudi destaca l'aldosterona com l'hormona clau de les adaptacions del còlon distal al disminuir la ingesta de sodi de la dieta, descartant un paper directe de l'angiotensina II en aquests efectes. En condicions de deshidratació, la vasopressina també disminueix la permeabilitat de l'epiteli i indueix el desenvolupament de la beina pericriptal, a més de regular el moviment d'aigua a través d'aquaporines mitjançant els seus receptors V2 al còlon distal de rata. / Fluid and electrolyte absorption by colonic crypts depends on the transport properties of crypt cellular and paracellular routes and of the pericryptal sheath. During the transition from a high-Na+ (HS) to a low-Na+ (LS) diet there are changes in the colonic crypt wall and pericryptal sheath. The effect of angiotensin II, aldosterone and vasopressin in these changes was studied. The extracellular Na+ concentration in isolated rat distal colonic mucosa was determined by confocal microscopy using a low-affinity Na+-sensitive fluorescent dye (Sodium red, and Na+-insensitive BODIPY) bound to polystyrene beads. Crypt permeability to FITC-labelled dextran was monitored by its rate of escape from the crypt lumen into the pericryptal space. Mucosal ion permeability was estimated by transepithelial electrical resistance (TER) and amiloride-sensitive short-circuit current. Different epithelial, myofibroblasts and extracellular matrix proteins and membrane receptors were determined by immunolocalization. After only 3 days of a LS diet all colonic changes were reproduced, a decrease in crypt wall permeability, an increase in electrogenic sodium transport and a growth in the pericryptal space, that produced an increase in Na+ accumulation in the pericryptal space. The treatment with captopril, losartan and spironolactone reversed all these effects, showing the implication of angiotensin II and aldosterone. High plasma aldosterone concentrations, independently of the diet or angiotensin II, decreased crypt wall dextran permeability, increased TER, increased Na+ accumulation in the pericryptal sheath and ENaC expression, increased extracellular matrix, membrane receptors and myofibroblast proteins. Angiotensin II did not reproduced LS diet effects. High vasopressin plasma concentration raised alpha-SMA expression in the pericryptal sheath, increased the pericryptal Na+ accumulation in this space and caused a reduction of crypt wall permeability. All these effects were reversed by selective blocking of V1 and V2 receptors. Dehydration and vasopressin infusion increased AQP-2 expression in distal colonic mucosa, an effect mediated by the V2 receptor, as only the specific V2 receptor antagonist inhibited this effect. In conclusion, these findings show that aldosterone alone is responsible for the adaptative changes in the colonic crypts of distal colon due to the sodium content and that vasopressin has similar effects as aldosterone in permeability and growth development.

El càncer colorrectal és la tercera causa de mortalitat i morbiditat en els països occidentals. En el passat la informació relacionada amb aquesta alteració s'ha derivat en gran mesura de l'observació clínica. La dificultat de realitzar estudis prospectius dels factors etiopatogènics del càncer de còlon humà, fa necessari la inducció de neoplàsia colòniques experimentals en animals amb carcinogen químics.Aquests estudis han aportat mitjans addicionals per a investigar algunes de les característiques biològiques d'aquests tumors. La 1, 2-Dimetilhidracina és un carcinogen efectiu i selectiu de còlon en injecció subcutània en la rata. Els tumors colònicos induïts amb DMH en rosegadors mostren remarcable semblança histopatològica amb la neoplàsia humana.Diverses evidències experimentals suggereixen que la carcinogénesis inclou una sèrie de canvis seqüencials cel·lulars amb diferents propietats biològiques, bioquímiques i morfològiques respecte a les cèl·lules normals.Estudis bioquímics i histoquímics, han demostrat que la transformació neoplàsica de la mucosa colònica tractada amb DMH està associada amb importants canvis en la composició dels glicoconjugats i activitat de les glicosiltransferases. No obstant això, els mètodes histoquímics clàssics no permeten discriminar els diferents carbohidrats que componen els glicoconjugats ni els canvis associats a la transformació neoplàsica. L'aplicació de les lectines en seccions d'intestí gruixut permet observar diversos patrons de localització cel·lular i subcel·lular dels glicoconjugats del epiteli colònic.En la passada dècada la possibilitat de realitzar estudis citomètrics en mostres parafinades ha facilitat la realització d'estudis prospectius per a conèixer nous factors predictius de l'evolució de pacients amb càncer colorrectal. El coneixement de la cinètica cel·lular dels tumors colònics i de la mucosa exposada a la DMH en rosegadors mitjançant citometría de fluxe, i dels glicoconjugats mitjançant lectines poden proporcionar claus en la patogenia del càncer de còlon i ajudar a una prompta detecció de la transformació neoplàsica. / El cáncer colorrectal es la tercera causa de mortalidad y morbilidad en los países occidentales. En el pasado la información relacionada con esta alteración se ha derivado en gran medida de la observación clínica. La dificultad de realizar estudios prospectivos de los factores etiopatogénicos del cáncer de colon humano, hace necesario la inducción de neoplasias colónicas experimentales en animales con carcinógenos químicos.Estos estudios han aportado medios adicionales para investigar algunas de las características biológicas de estos tumores. La 1, 2-Dimetilhidracina es un carcinógeno efectivo y selectivo de colon en inyección subcutánea en la rata. Los tumores colónicos inducidos con DMH en roedores muestran remarcable semejanza histopatológica con la neoplasia humana.Diversas evidencias experimentales sugieren que la carcinogénesis incluye una serie de cambios secuenciales celulares con diferentes propiedades biológicas, bioquímicas y morfológicas respecto a las células normales.Estudios bioquímicos e histoquímicos, han demostrado que la transformación neoplásica de la mucosa colónica tratada con DMH está asociada con importantes cambios en la composición de los glicoconjugados y actividad de las glicosiltransferasas. Sin embargo, los métodos histoquímicos clásicos no permiten discriminar los diferentes carbohidratos que componen los glicoconjugados ni los cambios asociados a la transformación neoplásica. La aplicación de las lectinas en secciones de intestino grueso permite observar diversos patrones de localización celular y subcelular de los glicoconjugados del epitelio colónico.En la pasada década la posibilidad de realizar estudios citométricos en muestras parafinadas ha facilitado la realización de estudios prospectivos para conocer nuevos factores predictivos de la evolución de pacientes con cáncer colorrectal. El conocimiento de la cinética celular de los tumores colónicos y de la mucosa expuesta a la DMH en roedores mediante citometría de flujo, y de los glicoconjugados mediante lectinas pueden proporcionar claves en la patogenia del cáncer de colon y ayudar a una pronta detección de la transformación neoplásica.

La línea celular HT-29 M6 es una línea tumoral humana derivada de adenocarcinoma de colon, con capacidad de diferenciación in vitro hacia un fenotipo mucosecretor, obtenida por selección con 10-7 M y 10-6 M de metotrexato, en tratamientos sucesivos, de la línea parental indiferenciada HT-29 (Lesuffleur T, et al, 1990). Nosotros utilizamos esta línea celular como modelo para estudiar el proceso de diferenciación in vitro que ocurre de manera espontánea durante el crecimiento hacia confluencia. Los resultados que presentamos en este trabajo aportan evidencias sólidas acerca del papel del calcio extracelular como modulador no sólo de la epitelialización, sino también del ciclo celular y de la expresión génica durante la diferenciación in vitro. Aunque puede existir más de un mecanismo por el que el calcio extracelular sea responsable de los efectos observados, los resultados obtenidos son consistentes con el requerimiento de contactos de adhesión para la diferenciación epitelial. Además, los resultados sugieren que reguladores del ciclo celular, concretamente ciclina D1 y p27, desempeñan un papel determinante en el control del programa de expresión génica durante la diferenciación. Este resultado es muy relevante ya que: (1) su función parece tener lugar de manera general sobre el programa de expresión génica, y (2) al estar estas proteínas implicadas en la progresión tumoral, su mecanismo de acción emerge como una diana para manipular el fenotipo de diferenciación celular y con ello la tumorigenicidad. Por otro lado, hemos descubierto que parte del proceso de diferenciación in vitro es independiente de la formación de contactos de adhesión y de la epitelialización, concretamente niveles basales de expresión génica asociada a diferenciación y la producción de vesículas de moco. Asimismo, en condiciones de no adherencia celular, las células no adquieren capacidad invasiva, lo cual nos está indicando que la desdiferenciación celular observada en tumores y la adquisición de capacidad invasiva podría tener lugar por vías separadas. Finalmente, hemos obtenido evidencias preliminares acerca de la existencia de una vía de regulación de APC sobre p21CIP1 cuya inactivación podría estar relacionada con la reversibilidad del programa de diferenciación in vitro y con su incapacidad para llevar a término un programa de diferenciación terminal.

Els dos principals objectius d'aquesta tesis són: (1) la realització d'un estudi global, (2) anàlisi i caracterització d'alteracions recurrents, en els canvis de metilació genòmica associats al càncer de còlon. Amb la finalitat d'assolir aquests objectius, vàrem desenvolupar una nova tècnica d'anàlisi dels canvis de metilació. Amplification of InterMethylated Sites (AIMS). A partir de la descripció d'aquesta tècnica, la tesis consta de dos grups de resultats, obtinguts a partir de la mateixa tècnica AIMS, i clarament diferenciats. Un primer bloc de resultats on realitzem dos estudis globals (objectiu número 1), i un segon bloc format per dos estudis específics (objectiu número 2) . En el primer treball global es va analitzar la contribució dels guanys i les pèrdues de la metilació genòmica en el procés tumoral. La principal conclusió d'aquest treball va ser el paper independent que juguen els dos tipus de canvi, tant a nivell de característiques tumorals (fisiològiques i genètiques), com de valor pronòstic i contribució al llarg de la progressió tumoral. En el segon estudi global, ens vàrem centrar més amb les pèrdues de metilació genòmica. En aquest, mostrem l'estreta associació entre aquestes pèrdues amb el grau de dany genòmic i mal pronòstic. El segon bloc de resultats ve constituït per els estudis específics. En un primer treball, descrivim el silenciament epigenètic del gen sintasa de prostaciclines (PTGIS). Aquest silenciament, es dona en una freqüència elevada de tumors i presenta una associació estadísticament significativa amb el grau d'aneuploidia del tumor. Finalment, un segon treball específic on mostrem el silenciament epigenètic de tota una banda citogenètica, concretament 2q14.2. En aquest silenciament no tant sols s'hi troba implicada la metilació genòmica, sinó que també descrivim un efecte general de silenciament a través de la modificació post-transcripcional de les histones. / The main focus of this thesis is to better understand the role of genomic methylation changes in colorectal cancer. We approached it at two different levels: (1) global assessment and (2) analysis of specific recurrent changes. A new technique called Amplification of InterMethylated Sites (AIMS) was developed to obtain information at both levels. At global level we report the relative contribution of losses and gains of DNA methylation on the tumour progression. DNA methylation signatures associate with different tumour features, including physiological, genetic and clinical characteristics. Furthermore, we demonstrate that global genomic demethylation correlates with cumulated genomic damage and poor prognosis. At specific level we show the epigenetic silencing of the prostacyclin synthase gene (PTGIS) in 43% of colorectal cancers. PTGIS inactivation is associated with the aneuploid status of the tumour, suggesting a possible role of this gene in the maintenance of the genomic integrity. Finally, we have detected a new type of epigenetic alteration affecting a large proportion of colorectal cancers. It consists in a long range epigenetic silencing due DNA methylation and Histone modification changes and affects an entire cytogenetic band (2q14.2). All the genes and transcripts present in this region showed downregulation independently of the promoter methylation status suggesting that the regional condition prevails over the local status.