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Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinasLlopis Torregrosa, Vicent 25 January 2016 (has links)
[EN] Any living cell needs to maintain adequate levels of nutrients and ions to ensure the continuity of its functions. The first step in the maintenance of both ion and nutrient homeostasis is their uptake from the extrenal environment, where plasma membrane transporter proteins play an important role. The regulation of both the activity and abundance of permeases in the plasma membrane is a pivotal aspect of the cellular response to different environmental conditions. Therefore, deciphering the pathways that regulate the function or the presence of these transport proteins is important for a better understanding of cell physiology and stress responses. Transcriptional regulation is a contributor to the control of the abundance of plasma membrane transporters, and more specifically in the yeast model Saccharomyces cerevisiae a strong transcriptional regulation of the hexose transporters has been demonstrated. However, there are other important levels for the control and maintenance of glucose homeostasis, such as post-translational regulation of glucose transporters, which are still being defined. Ubiquitination, as a signal for endocytosis of membrane proteins, mediated by the E3 ubiquitin ligase Rsp5 has been demonstrated for many transporters, including the HXT family. In recent years, several studies have shown the involvement of the ART protein family (Arrestin-Releated Trafficking proteins) in this process, acting as adapters for Rsp5 and providing specificity to the ubiquitination of permeases in response to changes in environmental conditions. In turn, the members of this family of adapter proteins are targets of post-translational modifications, such as phosphorylation or ubiquitination, affecting their activity and adding an additional level in the regulation of transporter interactions. Previous studies have demonstrated the existence of a genetic interaction between the high affinity glucose transporter Hxt6 and the Rsp5 adapter protein, Rod1 (Art4). In turn, the Snf1 kinase was shown to be involved in the phosphorylation of this adapter protein, suggesting a possible role in the regulation of its activity. With this background, and taking into consideration the interaction of 14-3-3 proteins with other adapter proteins, in this study the biochemical characterization of the Art4-Snf1-14-3-3 signaling pathway involved in the regulation of the endocytosis of the glucose transporter Hxt6 and the effect of Snf1 and 14-3-3 proteins (Bmh2) on intracellular traffic of the Hxt6-Art4 complex will be investigated. Similarly, the effect of Art4, and its paralogue Rog3 (Art7), on Hxt6 levels and the phenotypes of other glucose transporter mutants, such as hxt1 and hxt3 will be analyzed to determine whetherthese transporters display a common regulatory mechanism also involving Art4 and Art7. In short, this thesis aims to provide new data on the post-translational regulation of the HXT transporters through the Rsp5 adapter family of ART proteins, with emphasis on biochemical aspects, such as phosphorylation, and molecular and cellular aspects, such as intracellular trafficking and permease stability / [ES] Cualquier célula viva necesita mantener niveles adecuados de iones y nutrientes para asegurar la continuidad de sus funciones. El primer paso en la conservación de la homeostasis de iones como el potasio o nutrientes como la glucosa, es la toma de los mismos desde el medio externo, teniendo los transportadores de membrana un papel básico en este proceso. La regulación de estos transportadores tiene una función fundamental en la respuesta de las células a diferentes condiciones ambientales, siendo esenciales tanto la modulación de su actividad como la abundancia de permeasas en la membrana plasmática. Por esto, el estudio de las rutas que regulan la función o la presencia de dichos transportadores en la membrana plasmática es importante para un mejor conocimiento de la fisiología celular y la respuesta de las células al estrés. La regulación transcripcional supone un nivel importante en el control de la abundancia de transportadores en la membrana plasmática, y más concretamente en la levadura modelo Saccharomyces cerevisiae se ha demostrado que los transportadores de hexosas poseen una fuerte regulación a nivel transcripcional. Sin embargo, existen otros niveles importantes para el control y el mantenimiento de la homeóstasis de hexosas, como la regulación postraduccional, y que en el caso de los transportadores de glucosa es menos conocida. La ubiquitinación como señal para la endocitosis de proteínas de membrana a través de la E3 ubiquitín ligasa Rsp5 ha sido demostrada para gran número de transportadores, incluidos los de la familia HXT. En los últimos años, varios estudios han demostrado la implicación de la familia de proteínas ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este proceso, actuando como adaptadores de Rsp5 y aportando especificidad a la ubiquitinación de transportadores en respuesta a cambios en las condiciones del medio. A su vez, esta familia de proteínas adaptadoras es diana de modificaciones postraduccionales, como la ubiquitinación o la fosforilación, que repercuten en su actividad y suman un nivel adicional en la regulación de los transportadores con los que interaccionan. Estudios anteriores demostraron la existencia de una interacción genética entre el transportador de glucosa de alta afinidad Hxt6 y la proteína adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). A su vez, la quinasa Snf1 fue implicada en la fosforilación de esta proteína adaptadora, sugiriendo una posible función en la regulación de su actividad. Con estos precedentes, y teniendo en consideración la interacción de las proteínas 14-3-3 con otras proteínas adaptadoras, en el presente estudio se llevará a cabo la caracterización bioquímica de la ruta de señalización Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulación por endocitosis del transportador de glucosa Hxt6 y se estudiará el efecto de Snf1 y las proteínas 14-3-3 (Bmh2) sobre el tráfico intracelular del complejo Hxt6-Art4. Del mismo modo, se analizará el efecto de Art4, y de su parálogo Rog3 (Art7), sobre los niveles de Hxt6 y se caracterizarán los fenotipos de mutantes para otros transportadores de glucosa, como Hxt1 y Hxt3, por la posibilidad de que presenten un mecanismo regulador común que implique también a Art4 y Art7. En definitiva, la presente tesis doctoral pretende aportar nuevos datos acerca de la regulación postraduccional de transportadores de la familia HXT a través de las proteínas ART, adaptadoras de Rsp5, haciendo hincapié en aspectos bioquímicos como la fosforilación y la ubiquitinación, y en aspectos moleculares y celulares, como el tráfico intracelular o la estabilidad de permeasas. / [CAT] Qualsevol cèl-lula viva necessita mantindre nivells adequats d'ions i nutrients per tal d'assegurar la continuïtat de les seues funcions. El primer pas en la conservació de l'homeòstasi d'ions com el potassi o nutrients com la glucosa, és la pressa dels mateixos des del medi extern, tot i tenint els transportadors de membrana un paper bàsic en este procés. De manera directa, la regulació d'aquests transportadors té una funció fonamental en la resposta de les cèl-lules a diferents condicions ambientals, tot i sent processos essencials tant la modulació de la seua activitat com l'abundància de permeases a la membrana plasmàtica. Per això, entendre les rutes que regulen la funció o la presència dels transportadors a la membrana és important per a un millor coneixement de la fisiologia cel-lular i la resposta a l'estrés. La regulació transcripcional suposa un nivell important en el control de l'abundància de transportadors a la membrana plasmàtica, i més concretament en el rent model Saccharomyces cerevisiae s'ha demostrat que les permeases d'hexoses tenen una forta regulació a nivell transcripcional. A banda d'aquest tipus de regulació, existeixen altres nivells importants per al control i el manteniment de l'homeòstasi de la glucosa, com la regulació postraduccional, i , que en el cas dels transportadors de glucosa, és menys coneguda. L'ubiquitinació com a senyal per a l'endocitosi de proteïnes de membrana a través de l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, ha sigut demostrada per a un gran nombre de transportadors, inclosos els de la família HXT. En els últims anys, diversos estudis han posat de manifest la implicació de la família de proteïnes ART (Arrestin Releated Trafficking proteins) en este procés, tot i actuant com adaptadores de Rsp5 i aportant especificitat a l'ubiquitinació de transportadors en resposta a canvis en les condicions del medi. Al mateix temps, aquesta família de proteïnes és diana de modificacions postraduccionals, com l'ubiquitinació o la fosforilació, que tenen un efecte en la seua activitat i sumen un nivell addicional a la regulació dels transportadors amb els quals interaccionen. Estudis anteriors demostraren l'existència d'una interacció genètica entre el transportador de glucosa d'alta afinitat Hxt6 i la proteïna adaptadora de Rsp5, Rod1 (Art4). De la mateixa manera, la quinasa Snf1 va ser involucrada en la fosforilació d'aquesta proteïna adaptadora, tot i suggerint una possible funció en la regulació de la seua activitat. Amb estos precedents, i tenint en compte la interacció de les proteïnes 14-3-3 amb altres proteïnes adaptadores, en el present estudi es durà a terme la caracterització bioquímica de la ruta de senyalització Art4-Snf1-14-3-3 implicada en la regulació per endocitosi del transportador de glucosa Hxt6, i s'estudiarà l'efecte de Snf1 i les proteïnes 14-3-3 (Bmh2) sobre el tràfic intracel-lular del complex Hxt6-Art4. Per altra banda, s'analitzarà l'efecte de Art4, i del seu paràleg Rog3 (Art7), sobre els nivells de Hxt6 i es caracteritzaran els fenotips de mutants per a altres transportadors de glucosa, tals com Hxt1 i Hxt3, per la possibilitat que presenten un mecanisme regulador comú que també implique a Art4 i Art7. En definitiva, la present tesi doctoral pretén aportar noves dades al voltant de la regulació postraduccional dels transportadors de la família HXT a través de les proteïnes ART, adaptadores de Rsp5, tot i aprofundint en aspectes bioquímics com la fosforilació i l'ubiquitinació, i en aspectes moleculars i cel-lulars, com el tràfic intracel-lular o l'estabilitat de permeases / Llopis Torregrosa, V. (2016). Mecanismos de regulación de transportadores de iones y nutrientes a través de proteínas de tráfico relacionadas con las arrestinas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/60149 / TESIS
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Caracterização e utilização de genes envolvidos na tolerancia ao aluminio toxico em milho / Characterization and utilization of genes involved with aluminum tolerance in maizeCançado, Geraldo Magela de Almeida 23 February 2006 (has links)
Orientador: Marcelo Menossi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-06T00:11:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2006 / Resumo: Solos ácidos são encontrados em todas as regiões do planeta e em grandes proporções nas regiões tropicais e subtropicais. Como conseqüência da acidez do solo, o alumínio (Al), metal mais abundante da crosta terrestre, torna-se solúvel e atinge concentrações tóxicas para a maioria das espécies de plantas cultivadas. O primeiro dano provocado pelo Al iônico é a redução do desenvolvimento radicular, causando distúrbios fisiológicos que acarretam na redução da produção. Devido às limitações dos métodos convencionais de correção do pH do solo e a necessidade de longos períodos de tempo para o desenvolvimento de novas cultivares pelo melhoramento genético clássico, muita ênfase tem sido dada para a compreensão dos mecanismos de toxidez e de tolerância ao Al em plantas. Pois, com a aquisição destes conhecimentos, espera-se mais sucesso na obtenção de plantas tolerantes ao Al com o emprego da tecnologia de DNA recombinante e da seleção assistida por marcadores moleculares. Neste trabalho utilizamos duas linhagens de milho contrastantes para tolerância ao Al: Cat100-6 (tolerante ao Al) e S1587-17 (sensível ao Al), com o objetivo de estudar as alterações na expressão gênica promovidas pelo estresse de Al no ápice radicular. A presente tese esta dividida em três linhas de pesquisa: i) identificação, clonagem e caracterização de um gene codificando uma enzima glutationa S-transferase e avaliação dos efeitos do Al na sua expressão gênica; ii) avaliação das alterações na expressão gênica em ápices de raízes de duas linhagens de milho quando submetidos ao estresse de Al, utilizando um sistema de hibridização heterólogo com ESTs (expressed sequence tags) de cana-de-açúcar; e iii) clonagem e caracterização em milho do gene ALMT1, pertencente a uma nova classe de proteína transportadora de moléculas orgânicas especificamente ativada pelo Al. No trabalho com o gene GST27.2 observamos que este gene foi induzido pelo estresse provocado por Al e por Cd (cadmio) e que mutações que provocavam alterações na composição de aminoácidos da proteína poderiam promover alterações vi na atividade e na especificidade desta enzima. Além disso, o gene GST27.2 parece ser um novo alelo do gene GST27 estando presente como cópia única no genoma das linhagens de milho estudadas. Já no trabalho de avaliação da expressão gênica em larga escala, foram identificados 85 genes nos ápices radiculares das duas linhagens de milho cuja expressão foi diferencialmente alterada pela presença do Al. Embora alguns dos genes já tivessem sido descritos como responsivos ao Al, para a maior parte dos genes identificados neste trabalho, este foi o primeiro relato descrevendo seu envolvimento com o estresse de Al. A clonagem em milho do gene homológo ao gene ALMT1, demonstrou que o milho também deve ter uma proteína de membrana presente em células do ápice radicular que pode estar envolvida com transporte de moléculas orgânicas. Embora a proteína não esteja envolvida com o transporte de malato, a mesma teve sua atividade melhorada pela presença do Al. Entretanto, o gene que codifica esta proteína é reprimido no tecido do ápice radicular das linhagens de milho tolerante e sensível ao Al, o que pode indicar a existência de regulação pós-transcricional. Os resultados obtidos a partir destas três abordagens contribuíram para a compreensão dos mecanismos de tolerância e toxidez ao Al em raízes de milho. Futuramente, essas informações auxiliarão na escolha de genes mais apropriados para a criação de plantas geneticamente alteradas mais adaptadas a presença do Al no solo / Abstract: Acid soils are found worldwide but most of them are located in tropical and subtropical regions. Aluminum (Al), the most abundant metal on the earth surface, becomes soluble in the soil solution as consequence of low pH in acid soils and achieves phytotoxic levels for most of the cultivated plant species. The first symptom of Al toxicity is the inhibition of the root growth that promote physiological disturbs reducing crop yield. Because of limitations of correcting soil pH by liming and the time-consuming process of traditional plant breeding, the elucidation of the mechanisms involved with plant Al-tolerance and Al-toxicity has received more attention, since the production of genetically altered plants has emerged as an effective and fast strategy to the production of improved cultivars. Two maize lines, Cat100-6 (Al-tolerant) and S1587-17 (Al-sensitive), were used in this study with the aim of understanding at the transcriptional level the alterations promoted by Al on the roots. The research was divided in three main sections: i) detection, cloning and characterization of a gene encoding a Glutathione S-transferase in maize and evaluation of Al effects on its expression; ii) Large-scale evaluation of gene expression in root tips of maize under Al stress using a heterologous system with Expressed Sequence Tags (ESTs) of sugarcane; and iii) cloning and characterization of the ALMT1 gene in maize and evaluation of Al-effects on its activity. In the first section was observed that Al and Cd-stress induced the GST27.2 gene. Two mutations present on the nucleotide chain of this gene promoted alteration on the amino acid compositions. These alterations might be responsible by alterations on the specificity and activity of the GST enzyme. Besides that, the GST27.2 is a single copy gene in maize and seem to be a new allele of GST27. In the section of large-scale gene expression evaluation were identified 85 genes in root tips of two Al-tolerant contrasting maize lines whose expression was altered by Al stress. Although several of the genes identified here were previously described as Al responsive in other works, to most of them this study is the first report about the involvement of these genes with Al stress. The cloning of the ALMT1 homologue in tissue from the root apex of maize shown that maize has a gene encoding a membrane protein that might be involved with organic molecules transport. Although the protein encoded by the maize homologue gene was not associated with malate transport the activity of this protein was stimulated by the presence of Al. Interestingly, the gene expression of the this gene was repressed by Al in the Al-tolerant and Al-sensitive genotype. This result might be an indicative of existence of posttranscriptional regulation. The results accomplished with the experiments described here launched new light into the understanding of the Al-tolerance and Al-toxicity mechanisms in maize roots. Furthermore, the information presented here will contribute to a more accurate selection of genes that will be used to produce transgenic plants better adapted to soils with high Al concentration / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
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Análise da mobilidade mitocondrial em células vivas do hipocampo, substância negra e locus coeruleus anterior à agregação proteica envolvida em neurodegeneração / Analisys of mitochondrial mobility in living hippocampal, substantita nigra and locus coeruleos cells before protein aggregation involved in neurodegenerationMartins, Stephanie Alves 29 November 2013 (has links)
A alteração do tráfego mitocondrial em neurônios leva ao aumento do estresse oxidativo, privação de energia, deficiência da comunicação intercelular e neurodegeneração. Há evidências de que essas alterações de tráfego antecedem a morte neuronal associada à agregação proteica. Portanto, conhecer a relação entre a mobilidade mitocondrial e a formação de agregados proteicos pode ser um passo importante para o melhor entendimento dos mecanismos da neurodegeneração. Com isso, o objetivo do presente estudo é analisar a mobilidade das mitocôndrias em culturas de células do hipocampo, substância negra e locus coeruleus expostas a rotenona e MPTP, como agentes neurodegenerativos, e à rapamicina como ativador da autofagia. Um outro objetivo do estudo é avaliar o papel do cálcio (através do emprego de EGTA e ionomicina) no modelo experimental. Os resultados mostraram aumento da mobilidade mitocondrial no hipocampo e diminuição na substância negra, já no locus coeruleus houve aumento seguido de diminuição da mobilidade mitocondrial dependendo da concentração de rotenona. O emprego do EGTA e ionomicina mostra que a ação da rotenona sobre o tráfego mitocondrial envolve o cálcio, mas não se relaciona com uma possível alteração da integridade mitocondrial, já que não foi observada alteração no potencial de membrana mitocondrial. Foram também realizados experimentos a fim de avaliar a mobilidade mitocondrial em modelo utilizando rapamicina para ativar a autofagia e MPTP como indutor da neurodegeneração em culturas de células, onde foi observado aumento da mobilidade no hipocampo e no locus coeruleus quando exposto a rapamicina e aumento da mobilidade mitocondrial em cultura de células do hipocampo exposto a MPTP já no locus coeruleus houve uma diminuição significativa da mobilidade mitocondrial. Os resultados permitem concluir que o tráfego mitocondrial está alterado antes da agregação proteica podendo contribuir com a neurodegeneração / Altered mitochondrial traffic in neurons can lead to increased oxidative stress, energy deprivation, impaired intercellular communication and neurodegeneration. There are evidences mitochondria disturbing precedes neuronal death associated with protein aggregation. Therefore, the study of mitochondrial traffic and protein aggregation can be an important step towards a better understanding of the mechanisms of neurodegeneration. Thus, the aim of this study is to analyze mitochondria mobility in cultured cells of the hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus exposed to rotenone and MPTP, as neurodegeneration-promoting agents, and rapamycin to activate autophagy. The other objective of the study was to analyze the role of calcium (through EGTA and ionomycin) in the experimental model. The results showed increased and decreased mobility mitochondrial in cells from hippocampus and substantia nigra, respectively, while the locus coeruleus cell culture has increased followed by decreased mitochondrial mobility depending upon rotenone concentration. The use of EGTA and ionomycin showed that alteration of mitochondrial traffic is associated with calcium, however it is not related with changes in mitochondrial membrane potential. Additional experiments were also conducted to assess mitochondrial mobility in a model using rapamycin to activate autophagy and MPTP to induce neurodegeneration in cell cultures. The results of these experiments showed increased mitochondrial mobility in the hippocampus and locus coeruleus when exposed to rapamycin; while MPTP also increased mitochondria mobility in hippocampal cell cultures, but decreased it in locus coeruleus. Results suggest that mitochondrial traffic is altered before protein aggregation, which may contribute to neurodegeneration
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Análise da mobilidade mitocondrial em células vivas do hipocampo, substância negra e locus coeruleus anterior à agregação proteica envolvida em neurodegeneração / Analisys of mitochondrial mobility in living hippocampal, substantita nigra and locus coeruleos cells before protein aggregation involved in neurodegenerationStephanie Alves Martins 29 November 2013 (has links)
A alteração do tráfego mitocondrial em neurônios leva ao aumento do estresse oxidativo, privação de energia, deficiência da comunicação intercelular e neurodegeneração. Há evidências de que essas alterações de tráfego antecedem a morte neuronal associada à agregação proteica. Portanto, conhecer a relação entre a mobilidade mitocondrial e a formação de agregados proteicos pode ser um passo importante para o melhor entendimento dos mecanismos da neurodegeneração. Com isso, o objetivo do presente estudo é analisar a mobilidade das mitocôndrias em culturas de células do hipocampo, substância negra e locus coeruleus expostas a rotenona e MPTP, como agentes neurodegenerativos, e à rapamicina como ativador da autofagia. Um outro objetivo do estudo é avaliar o papel do cálcio (através do emprego de EGTA e ionomicina) no modelo experimental. Os resultados mostraram aumento da mobilidade mitocondrial no hipocampo e diminuição na substância negra, já no locus coeruleus houve aumento seguido de diminuição da mobilidade mitocondrial dependendo da concentração de rotenona. O emprego do EGTA e ionomicina mostra que a ação da rotenona sobre o tráfego mitocondrial envolve o cálcio, mas não se relaciona com uma possível alteração da integridade mitocondrial, já que não foi observada alteração no potencial de membrana mitocondrial. Foram também realizados experimentos a fim de avaliar a mobilidade mitocondrial em modelo utilizando rapamicina para ativar a autofagia e MPTP como indutor da neurodegeneração em culturas de células, onde foi observado aumento da mobilidade no hipocampo e no locus coeruleus quando exposto a rapamicina e aumento da mobilidade mitocondrial em cultura de células do hipocampo exposto a MPTP já no locus coeruleus houve uma diminuição significativa da mobilidade mitocondrial. Os resultados permitem concluir que o tráfego mitocondrial está alterado antes da agregação proteica podendo contribuir com a neurodegeneração / Altered mitochondrial traffic in neurons can lead to increased oxidative stress, energy deprivation, impaired intercellular communication and neurodegeneration. There are evidences mitochondria disturbing precedes neuronal death associated with protein aggregation. Therefore, the study of mitochondrial traffic and protein aggregation can be an important step towards a better understanding of the mechanisms of neurodegeneration. Thus, the aim of this study is to analyze mitochondria mobility in cultured cells of the hippocampus, substantia nigra and locus coeruleus exposed to rotenone and MPTP, as neurodegeneration-promoting agents, and rapamycin to activate autophagy. The other objective of the study was to analyze the role of calcium (through EGTA and ionomycin) in the experimental model. The results showed increased and decreased mobility mitochondrial in cells from hippocampus and substantia nigra, respectively, while the locus coeruleus cell culture has increased followed by decreased mitochondrial mobility depending upon rotenone concentration. The use of EGTA and ionomycin showed that alteration of mitochondrial traffic is associated with calcium, however it is not related with changes in mitochondrial membrane potential. Additional experiments were also conducted to assess mitochondrial mobility in a model using rapamycin to activate autophagy and MPTP to induce neurodegeneration in cell cultures. The results of these experiments showed increased mitochondrial mobility in the hippocampus and locus coeruleus when exposed to rapamycin; while MPTP also increased mitochondria mobility in hippocampal cell cultures, but decreased it in locus coeruleus. Results suggest that mitochondrial traffic is altered before protein aggregation, which may contribute to neurodegeneration
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