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Structure and conformational rearrangements during splicing of the ribozyme component of group II intronsLi, Cheng-Fang 27 June 2011 (has links) (PDF)
Les introns de groupe II forment une classe d'ARN connus avant tout pour leur activité ribozymique, qui leur permet de catalyser leur propre réaction d'épissage. Sous certaines conditions, ces introns peuvent s'exciser des ARN précurseurs dont ils font partie et assurer la ligation des exons qui les bordent sans l'aide d'aucune protéine. Les introns de groupe II sont généralement excisés sous forme d'un lariat, semblable à celui formé par les introns des prémessagers nucléaires, dont l'épissage est assurée par le spliceosome. De telles similarités dans le mécanisme d'épissage suggèrent que les introns de groupe II et les introns des prémessagers nucléaires pourraient avoir un ancêtre évolutif commun.Malgré leurs séquences très diverses, les introns de groupe II peuvent être définis par une structure secondaire commune, hautement conservée. Celle-ci est formée de six domaines (domaine I à domaine VI ; D1-D6), émergeant d'une roue centrale. L'épissage des introns de groupe II comprend deux étapes, et autant de réactions de transestérification, qui produisent les exons liés et l'intron excisé sous forme lariat. Il est généralement admis que la structure du ribozyme subit des changements conformationnels entre les deux étapes de l'épissage et que le domaine VI est un acteur clé dans ce phénomène. Cependant, malgré l'identification d'un certain nombre d'interactions tertiaires entre domaines, ni la RMN, ni les études faisant appel à des modifications chimiques ne sont parvenues à déterminer l'environnement immédiat, au niveau du site actif du ribozyme, de l'adénosine qui sert de point de branchement de la structure en lariat, ainsi que des nucléotides qui entourent cette adénosine au sein du domaine VI. A l'aide d'analyses phylogénétiques et d'une modélisation moléculaire tridimensionnelle, nous avons identifié plusieurs sections du ribozyme susceptibles de constituer le site de fixation du domaine VI au cours de l'étape de branchement. Des mutations ont été introduites dans ces sites de fixation potentiels et la cinétique de réaction des ARN mutants résultants a été déterminée. Afin de démontrer formellement l'interaction du domaine VI avec le site récepteur le plus probable, une molécule de ribozyme dont la réaction de branchement est assurée par l'addition d'oligonucléotides ADN ou ARN qui positionnent correctement le domaine VI vis-à-vis de son partenaire a été construite. En combinant l'information apportée par différentes expériences de ce type, nous avons pu générer un modèle à résolution atomique du complexe formé par le domaine VI, son site de branchement et le reste de l'intron au moment où l'épissage est initié.
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Dialkynylimidazoles as irreversible MAPK inhibitors, kinase docking site probes, and anti-cancer agentsLi, Jing, Ph. D. 15 January 2013 (has links)
This dissertation research was aimed at investigating an interesting class of 1,2-dialkynylimidazoles as: 1. irreversible p38 MAP kinase α-isoform (p38α) inhibitors; 2. p38α docking site probes; 3. anti-cancer agents.
Based on the mild, thermal rearrangement of 1,2-dialkynylimidazoles to reactive carbene or diradical intermediates, a series of 1,2-dialkynylimidazoles was designed as potential irreversible p38α inhibitors. The synthesis of these dialkynylimidazoles and their kinase inhibition activity were reported. Interestingly, one of the 1-ethynyl-substituted dialkynylimidazoles is a potent (IC50 = 200 nM) and selective inhibitor of p38α. Additionally, this compound covalently modifies p38α as determined by ESI-MS after 12 h incubation at 37 °C. The unique kinase inhibition, covalent kinase adduct formation, and minimal CYP450 2D6 inhibition by this compound demonstrate that dialkynylimidazoles are a new, promising class of p38α inhibitors.
Blocking docking interactions between kinase network partners is a promising alternative approach for selectively inhibiting kinases. The second project involves the identification of a new class of small molecules, covalent p38α MAP kinase docking site probes. We proposed that the mechanism may involve the addition of a thiol to the N-ethynyl group. Moreover, we demonstrated that such probes can be used fluorescently to label p38α both in vitro and in cells via azide-alkyne “Click” chemistry. This serves as the basis of an assay that can be used to identify inhibitors that specifically target the substrate docking site of p38α.
The last project was focused on evaluating a new class of 1,2-dialkynylimidazoles as anti-cancer agents. One 1,2-dialkynylimidazole analog was found to be cytotoxic against a range of human cancer lines and to induce apoptosis in the human non-small cell lung cancer cell line A549. In order to elucidate the relationship between the structural basis and role of the thermal generation of diradical or carbene intermediates, a series of dialkynylimidazoles and related N-alkynylimidazoles was prepared and their cytotoxicity was determined against A549 cell line. Although the experimentally determined activation energy is in excellent agreement with that predicated from the DFT calculation, there is no correlation between the rate of Bergman cyclization and cytotoxicity to A549 cells. An alternative mechanism was proposed involving the unexpected selective thiol addition to the N-ethynyl group of certain 1,2-dialkynylimidazoles. / text
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Regulation of the stability of the protein kinase DYRK1A: establishing connections with the Wnt signaling pathwayArató, Krisztina 20 December 2010 (has links)
DYRK1A is the most studied member of the DYRK family of protein kinases, because is one of the human chromosoma 21 proteins for which changes in gene dosage result in neuropathological alterations. DYRKs are activated by autophosphorylation on a tyrosine residue in the activation loop, a one-off event that takes place during translation. Accordingly, DYRK1A would be constitutively active once is synthesized. However, DYRK1A is extremely sensitive to gene dosage, and thus it is predictable that not only its activity but also its actual protein amounts have to be tightly regulated by mechanisms not yet characterized.
In the present study, the protein kinase NLK has been identified as a novel regulator of DYRK1A protein stability. DYRK1A interacts with NLK in physiological conditions. The interaction results in the phosphorylation of DYRK1A at multiple sites, which have been identified by mass spectrometry analysis. These phosphorylation events promote DYRK1A proteasome-dependent degradation. Moreover, DYRK1A degradation is induced by stimulating cells with Wnt1 or Wnt3a, or overexpressing elements of the Wnt signaling cascade such as the Frizzled-1 receptor or NLK activators such as HIPK2. In addition, DYRK1A interacts with and phosphorylates -catenin and TCF-4 and enhances -catenin-dependent transcriptional activity, at least by phosphorylation of -catenin. Thus, these results suggest that DYRK1A acts as a positive factor in the Wnt--catenin signaling pathway and NLK acts as a negative regulator by targeting both DYRK1A and TCF/LEF transcription factors for proteasome-mediated degradation. / DYRK1A es el miembro más estudiado de la familia de proteína quinasas DYRK, porque es una de las proteínas de la cromosoma humano 21 para la que cambios en la dosis génica dan lugar a alteraciones neuropatológicas. Las quinasas DYRK se activan por autofosforilación en un residuo tirosina localizado en el lazo de activación, un evento único que ocurre durante la traducción. Como consecuencia, DYRK1A sería constitutivamente activa una vez se ha sintetizado. Sin embargo, DYRK1A es extremadamente sensible a la dosis génica, y por tanto es predecible que no sólo su actividad, pero también los niveles de proteína han de estar estrictamente controlados por mecanismos reguladores que todavía no han sido caracterizados.
En este trabajo, la proteína quinasa NLK ha sido identificada como un nuevo regulador de la estabilidad de DYRK1A. DYRK1A interacciona con NLK en condiciones fisiológicas, y la interacción tiene como resultado la fosforilación de DYRK1A en residuos serina/treonina, varios de los cuales han sido identificados por espectrometría de masas. La interacción con NLK y la subsecuente fosforilación promueven la degradación de DYRK1A vía el proteasoma. Además, la degradación de DYRK1A es inducida por estimulación de la células con Wnt1 o Wnt3a, o por sobreexpresión de miembros de la cascada de señalización de Wnt, como el receptor Frizzled-1 o de un activador de NLK como HIPK2. Finalmente, se ha demostrado que DYRK1A se une y fosforila -catenina y TCF-4. La fosforilación de, al menos, -catenina es responsable del incremento de la actividad transcripcional dependiente de esta proteína en presencia de DYRK1A. Todos estos resultados sugieren que DYRK1A actúa como un factor positivo en la vía de señalización Wnt--catenina y NLK actúa como un regulador negativo al inducir la degradación vía proteasoma no sólo de los factores de transcripción TCF/LEF sino también del modulador positivo DYRK1A.
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Structure and conformational rearrangements during splicing of the ribozyme component of group II introns / Structure et réarrangements conformationnels au cours de l’épissage du composant ribozyme d’un intron de groupe IILi, Cheng-Fang 27 June 2011 (has links)
Les introns de groupe II forment une classe d’ARN connus avant tout pour leur activité ribozymique, qui leur permet de catalyser leur propre réaction d’épissage. Sous certaines conditions, ces introns peuvent s’exciser des ARN précurseurs dont ils font partie et assurer la ligation des exons qui les bordent sans l’aide d’aucune protéine. Les introns de groupe II sont généralement excisés sous forme d’un lariat, semblable à celui formé par les introns des prémessagers nucléaires, dont l’épissage est assurée par le spliceosome. De telles similarités dans le mécanisme d’épissage suggèrent que les introns de groupe II et les introns des prémessagers nucléaires pourraient avoir un ancêtre évolutif commun.Malgré leurs séquences très diverses, les introns de groupe II peuvent être définis par une structure secondaire commune, hautement conservée. Celle-ci est formée de six domaines (domaine I à domaine VI ; D1-D6), émergeant d’une roue centrale. L’épissage des introns de groupe II comprend deux étapes, et autant de réactions de transestérification, qui produisent les exons liés et l’intron excisé sous forme lariat. Il est généralement admis que la structure du ribozyme subit des changements conformationnels entre les deux étapes de l’épissage et que le domaine VI est un acteur clé dans ce phénomène. Cependant, malgré l’identification d’un certain nombre d’interactions tertiaires entre domaines, ni la RMN, ni les études faisant appel à des modifications chimiques ne sont parvenues à déterminer l’environnement immédiat, au niveau du site actif du ribozyme, de l’adénosine qui sert de point de branchement de la structure en lariat, ainsi que des nucléotides qui entourent cette adénosine au sein du domaine VI. A l’aide d’analyses phylogénétiques et d’une modélisation moléculaire tridimensionnelle, nous avons identifié plusieurs sections du ribozyme susceptibles de constituer le site de fixation du domaine VI au cours de l’étape de branchement. Des mutations ont été introduites dans ces sites de fixation potentiels et la cinétique de réaction des ARN mutants résultants a été déterminée. Afin de démontrer formellement l’interaction du domaine VI avec le site récepteur le plus probable, une molécule de ribozyme dont la réaction de branchement est assurée par l’addition d’oligonucléotides ADN ou ARN qui positionnent correctement le domaine VI vis-à-vis de son partenaire a été construite. En combinant l’information apportée par différentes expériences de ce type, nous avons pu générer un modèle à résolution atomique du complexe formé par le domaine VI, son site de branchement et le reste de l’intron au moment où l’épissage est initié. / Group II introns are a class of RNAs best known for their ribozyme-catalyzed, self-splicing reaction. Under certain conditions, the introns can excise themselves from precursor mRNAs and ligate together their flanking exons, without the aid of proteins. Group II introns generally excise from pre-mRNA as a lariat, like the one formed by spliceosomal introns, similarities in the splicing mechanism suggest that group II introns and nuclear spliceosomal introns may share a common evolutionary ancestor.Despite their very diverse primary sequences, group II introns are defined by a highly conserved secondary structure. This generally consists of six domains (Domain I-Domain VI; D1-D6) radiating from a central wheel. Each of the six intronic domains has a specific role in folding, conformational rearrangements or catalysis. The native conformation of a group II intron is sustained by intra- and interdomain long-range tertiary interactions, which are critical either for folding of the intron to the native state or for its catalytic activity. In brief, Domain V interacts with Domain I to form the minimal catalytic core; Domain VI contains a highly conserved bulged adenosine serving as the branch-point nucleotide. DII and Domain III contribute to RNA folding and catalytic efficiency. Domain IV, which encodes the intron ORF, is dispensable for ribozyme activity.Group II intron splicing proceeds through two step transesterification reactions which yield ligated exons and an excised intron lariat. It is initiated by the 2’-hydroxyl group of the bulged adenosine within Domain 6, which serves as a branch point and attacks the phosphate at the 5’-end of the intron, thus releasing the 5’-exon while forming a lariat structure in the first step. The released 5’-exon, which is bound to the intron through base pairing interactions, is then positioned correctly to attack the 3’-splice site with its free 3’-OH in the second step of splicing. It is generally believed that the structure of a group II ribozyme undergoes conformational rearrangements between first step and second step and domain VI must play a central role in the process. However, despite the identification of several interdomain tertiary interactions, neither NMR nor chemical probing studies have been successful in determining the local surroundings of the branch-point adenosine and neighboring domain VI nucleotides in the ribozyme active site. By using phylogenetic analysis and molecular modelling, we have identified several areas of the molecule which have the potential to constitute the docking site of domain VI. Mutations were introduced in putative binding sites and the resulting, mutant RNAs have been kinetically characterized. This has allowed us to identify a site within the ribozyme that appears to be specifically involved in the branching reaction. In order to further investigate the interaction between that site and domain VI, we set up a system in which the docking of domain VI into its presumed binding site is ensured by the addition of DNA/RNA oligos that position the two RNA elements in an appropriate orientation. By combining the information from such experiments, we have built an atomic-resolution model of the complex formed by domain VI, the branch site and the rest of the intron at the time at which splicing is initiated.
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