Tesis Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica Clínica y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés corresponde a una respuesta del organismo que se desencadena frente a una situación donde el individuo se siente amenazado, que promueve la adaptación y sobrevida del mismo. Esta respuesta es específica, pues involucra la activación de distintos circuitos neuronales y la liberación de mediadores humorales dependiendo del tipo de agente “estresante”. En el caso del estrés psicosocial se liberan principalmente glucocorticoides (hormonas esteroidales) y catecolaminas, provocando cambios en la expresión génica y en la transducción de señales tanto a nivel central como periférico. Las áreas que son blanco de las hormonas del estrés y en especial de los glucocorticoides incluye la formación hipocampal (Cuerno de Ammón, CA y giro dentado) que participa en la memoria declarativa, la amígdala que participa en la respuesta al miedo y la corteza frontal asociada a la memoria de trabajo. Estudios morfológicos y bioquímicos han demostrado que las variaciones en los niveles de glucocorticoides secretados durante el ciclo circadiano y durante el estrés promueve modificaciones neuroplásticas en estas estructuras, especialmente en el hipocampo, y que incluyen cambios morfológicos, modificación en la excitabilidad celular y en la eficacia sináptica. Se ha descrito que el alza en la secreción de glucocorticoides inducido por un estrés agudo (episodio único) puede actuar como un modulador positivo o negativo de los procesos de memoria y aprendizaje relacionados a la formación hipocampal. Sin embargo, se ha visto que una activación excesiva de la respuesta de estrés, así como la imposibilidad de apagarlo pueden ser altamente contraproducentes, al disminuir la capacidad plástica del tejido neural, afectando especialmente las estructuras del sistema límbico y en particular el hipocampo. Entre los múltiples efectos del estrés a nivel central, uno de los más importantes corresponde a los cambios neuroplásticos asociados a la morfología neuronal, atrofia neuronal, en especial de aquellas relacionadas a la neurotransmisión glutamatérgica. Es probable que los mediadores del estrés modifiquen la citoarquitectura neuronal a través de la modulación de cascadas de señalización involucradas en la dinámica de citoesqueleto. Entre éstas, destaca la CRMP2 (del inglés collapsin response mediator protein-2), proteína involucrada en la polimerización de microtúbulos, proceso que determina en etapas temprana del desarrollo la definición axonal. La regulación de esta proteína es diversa e involucra el procesamiento proteolítico dependiente de calcio mediado por calpaínas. La proteína procesada es transportada al núcleo y produce cambios en la sobrevida neuronal por mecanismos no precisados. Adicionalmente, estudios in vitro han demostrado que la CRMP2 pierde la capacidad de unirse a tubulina al ser fosforilada por la GSK3β (Thr-514) produciéndose el colapso del cono de crecimiento neuronal. Los antecedentes descritos sugieren que CRMP2 juega un rol importante en el control de la dinámica del citoesqueleto de microtúbulos, que puede contribuir a mecanismos de plasticidad, y que su acción podría verse afectada por estímulos de diversa naturaleza, como el estrés (agudo y crónico). Sin embargo no existen antecedentes que indiquen el rol ni la localización en neuronas de cerebro adulto y si se regula por fosforilación. En relación a esto último, la sobreactivación de la GSK3β (del inglés glycogen synthase kinase 3β), una serina-treonina quinasa, produce efectos deletéreos asociados a la hiperfosforilación de proteínas asociadas a microtúbulos y factores transcripcionales que regulan la expresión de genes de neuroprotección. La GSK3β se encuentra constitutivamente activa y es regulada en forma negativa por una fosforilación en su extremo N-terminal (Ser-9). Debido a los efectos que se le atribuyen a esta enzima, se sugiere que participaría en las alteraciones observadas en estrés crónico, sin embargo dicha relación no se ha comprobado experimentalmente. Más aún, in vivo no se ha determinado la asociación entre la actividad de la GSK3β y el estado de fosforilación de la CRMP2. En base a estos antecedentes se propuso la siguiente hipótesis: “El estrés agudo por restricción de movimiento produce cambios en el estado de fosforilación, procesamiento y localización de CRMP2 en hipocampo de rata adulta”. Se utilizaron ratas macho adultas y se sometieron a 2,5 horas de estrés de restricción de movimiento y fueron sacrificadas inmediatamente finalizado el estímulo o luego de 1,5; 24 y 48 horas post estrés. La efectividad del estrés se comprobó por el incremento en el número de heces e incremento en el nivel de corticosterona observado por la aplicación de la restricción. A su vez, mediante inmunowestern blot se determinaron en extractos hipocampales los niveles de la proteína Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein), la que se sintetiza localmente en las dendritas y cuya función es regular la densidad de receptores glutamatérgicos sinápticos. Se observó, luego de 1,5 horas de estrés, una reducción significativa la que se mantuvo luego de 24 horas post estrés; sugiriendo un aumento en la degradación de esta proteína. En contraste, en animales estresados crónicamente durante 14 días y sacrificados 24 horas post estrés, se observó que los niveles de Arc fueron similares al control, sugiriendo que esta respuesta se adapta ante el estrés crónico. Se determinó mediante inmunowestern blot que el estrés no produjo el procesamiento proteolítico de la CRMP2. Por otra parte, luego de 1,5 horas post estrés se observó una disminución significativa en los niveles de CRMP2-P (Thr-514) la cual se reestablece al valor control luego de 24 horas post estrés. Así mismo, los niveles de GSK3β–P (Ser-9) disminuyeron de manera significativa inmediatamente post estrés que se relaciona a un aumento de la actividad y posteriormente se recuperan al valor control. Estos resultados indican que no existe relación entre la actividad de la quinasa con el estado de fosforilación de la CRMP2 y probablemente los cambios promovidos por el estrés involucran otros actores no considerados en esta tesis como las fosfatasas. Por otra parte en muestras de animales crónicamente estresados y sacrificados 24 horas posterior al tratamiento no presentaron cambios respecto al control. Finalmente se evaluó la localización celular de CRMP2-P mediante inmunohistoquímica en distintas zonas y estratos hipocampales. Se determinó que la inmunoreactividad de CRMP2-P es coincidente con la de un marcador de dendritas maduras (MAP2A) y se observó que existe una acumulación nuclear de CRMP2-P a las 24 horas post estrés en el estrato piramidal CA1 y CA3. Esta tesis demuestra por primera vez que el estrés agudo de restricción de movimiento promueve cambios en el estado de fosforilación de la CRMP2 lo que no se correlaciona con la actividad de la GSK3β. Será muy informativo poder precisar cambios en el estado de fosforilación de estas proteínas durante el estrés con el fin de poder definir nuevos actores en estas respuestas. Como por ejemplo, se debe precisar la contribución de otras quinasas y de fosfatasas en asociación a estos cambios. Por otro lado, se demostró en animal adulto que esta proteína tiene una localización dendrítica lo que hace postular un rol en neuronas adultas. Queda por determinar si efectivamente la CRMP2-P se transporta al núcleo en respuesta al estrés agudo. Así mismo se demostró que el estrés crónico produce una adaptabilidad de la fosforilación de CRMP2-P y GSK3β / Stress is a physiological response that allows adaptation and survival and it triggered when an individual feels threatened. This response is specific and involves the activation of numerous neural circuits and the secretion of different humoral mediators depending on the stressor. In the case of psychosocial stress, glucocorticoids and catecholamines are released into the blood stream, promoting changes on gene expression and signal transduction pathways at a central and peripheral level. The brain areas that are sensitive to stress hormones, especially to glucocorticoids, are the hippocampal formation (Ammon’s Horn, CA and dentate gyrus) involved in declarative memory; the amygdala related to fear response, and the frontal cortex associated to working memory. Morphological and biochemical studies have shown that fluctuation on glucocorticoids levels, due to stress or circadian rhythm, are required to promote changes in neuroplasticity in these brain structures, especially in the hippocampus. These neuroplastic changes include variations in morphology, modification on cellular excitability and synaptic efficiency. It has been reported that an increase on glucocorticoid secretion due to an acute stress (one episode) may act as a positive or a negative modulator of memory and learning processes involving the hippocampus. Nevertheless, an excessive activation of the stress response, as to the inability to terminate it properly, may be highly detrimental due to the negative effect of stress on neuroplasticity, specially the hippocampus. One of the most important effects at a central level associated with stress is the neuroplastic changes on neural morphology, mainly neural atrophy, especially those related with glutamatergic neurotransmission. It is possible that stress mediators promote modification of neural cytoarchitecture through the modulation of signal transduction pathways involved in cytoskeleton dynamics. Among these, we highlight CRMP2 (collapsin response mediator protein 2), whose involved on microtubule polymerization, an event that determinates axon specification at early embryonic stages. This protein is regulated by differents mechanisms involving calcium dependent proteolytic cleavage by calpains. The processed protein translocates to the nucleus and promotes changes in neural survival through mechanisms not full understood. In addition, in vitro studies have demonstrated that CRMP2 loses its tubulin binding ability when phosphorylated by GSK3β (Thr-514), provoking neural growth cone collapse. These evidences suggest that CRMP2 plays a pivotal role on cytoskeleton dynamics and can contribute to plasticity mechanisms. Additionally, its function could be affected by different types of stimuli, including acute and chronic stress. However there is no evidence about its function and location in adult brain neurons and neither if CRMP2 is regulated by phosphorylation. Regarding this event, it is known that the over activation of the serin-threonin kinase GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) results in deleterious effects associated with the hyperphosphorylation of microtubule associated proteins and transcription factors involved in gene expression regulation. GSK3β is constitutively active and regulated by an inhibiting phosphorylation in its N-terminal portion (Ser-9). It has been suggested that GSK3β would participate in the alterations observed on chronic stress, based mainly on their targets: Nonetheless, this relationship has not been proved experimentally. Even more, the association between the activity of GSK3β and phosphorylation state of CRMP2 has not been proved in vivo. Based on this evidence the following hypothesis was proposed “acute restraint stress causes changes on the phosphorylation, processing and cellular localization of CRMP2 in adult rat hippocampus” Adult male rat were subjected to a single 2.5 hours restriction stress session and then euthanized immediately after the stimuli or after 1,5; 24 and 48 hours after stress. The effectiveness of the stress model was proved by the increase in the number of feces and corticosterone levels produced by the restriction protocol. Also Arc (activity-regulated cytoskeleton-associated protein) protein levels where determined on hippocampal extract by inmunowestern blot. This protein is locally synthetized on dendrites and regulates the synaptic density of glutamatergic receptors. There was a significant reduction in Arc levels 1.5 hours post stress, which remained until 24 hours post stress, suggesting an increase in its degradation. In contrast, such a decrease was not observed on chronically stressed animals euthanized 24 post stress, suggesting that this response adapts in chronic stress. In addition we determined by inmunowestern blot that acute restraint stress does not promote CRMP2 cleavage. Also we proved by inmunowestern blot that acute restraint stress decreases the levels of CRMP2-P (Thr-514) at 1.5 hours post stress and the level is reestablished at 24 hours post stress. Likewise GSK3β–P (Ser-9) levels decreased immediately after stress which relates with an increase in its activity, and then return to control levels. These results indicate that there is no relation between the kinase activity and CRMP2 phosphorylation status. These results raise the possibility that changes induced by stress can involve other proteins that were not considered in this Thesis, like phosphatases. We also determined GSK3β–P levels on chronic stressed animals euthanized 24 hours after the last stress session and found no significant changes in comparison to control animals. Finally we determined by immunohistochemistry the location CRMP2-P in different hippocampal zones and stratum from animals euthanized at 0, 1.5; and 24 hours post stress. We determined that CRMP2-P immunoreactivity co-localized with a mature dendrite marker (MAP2A). We also observed that there is a nuclear accumulation of CRMP2-P on stratum pyramidale of CA1 and CA3 24 hours after stress. This thesis shows by the first time that acute restriction stress promote changes in the phosphorylation state of CRMP2 that does not correlates with GSK3β activity. It would be very informative to determine the changes in the phosphorylation state of these proteins during stress to elucidate the role of new actors on this response. For example, the contribution of other kinases and phosphatases to these changes must be elucidated. On other aspect, we show that CRMP2 has a dendritic localization in the adult brain, which denotes a function in adult neurons. It remains to be determined if acute stress effectively promotes CRMP2-P nuclear translocation. Also we demonstrated that chronic stress induces adaptability in the phosphorylation of CRMP2 and GSK3β.

Memoria para optar el título de Bioquímico / TonEBP es el factor transcripcional de eucariontes responsable de regular la transcripción de genes involucrados en la respuesta al estrés osmótico. Las proteínas codificadas por estos genes permiten la acumulación de osmolitos orgánicos compatibles, tales como sorbitol. Este se genera a partir de glucosa por la acción de aldosa reductasa (AR). Se desconoce si TonEBP está presente en el cardiomiocito neonato como en el adulto y si se regula por cambios en la osmolaridad externa como también por estrés oxidativo. Los resultados inmunocitoquímicos y de Western blot mostraron que basalmente TonEBP y AR están en el citosol y núcleo de manera homogénea en cardiomiocito de rata neonata, sin embargo en cardiomicitos adultos TonEBP y AR basalmente se encuentran sólo en la periferia celular. Cultivos primarios de cardiomiocitos expuestos a estrés hiperosmótico (Sorbitol 600 mOSm) por 8, 16 y 24 h, mostraron un aumento de TonEBP y de su translocación al núcleo. Los niveles de AR y su actividad también aumentaron significativamente a las 8, 16 y 24 h postestímulo. En cambio, los cultivos expuestos a estrés hiposmótico (30% de dilución del medio de cultivo, 202 mOsm), la cantidad de proteína de TonEBP y AR disminuyeron respecto al control y no se detectó actividad de AR. Dado que nuestro laboratorio previamente demostró que el estrés hiperosmótico inducido por sorbitol genera ROS y aumenta los niveles intracelulares de Ca2+, también se estudió sus efectos en la regulación de TonEBP. Los resultados mostraron que la translocación de TonEBP al núcleo es independiente del calcio y que las ROS son necesarias pero no suficiente para su completa activación. Bajo estas últimas condiciones, TonEBP migró al núcleo pero no se activó dado que no aumentaron sus niveles de proteína ni los de su gen blanco AR. En su conjunto, estos resultados sugieren que TonEBP está presente en el cardiomiocito y tanto este factor transcripcional como AR modifican sus niveles y actividad en respuesta a cambios en la osmolaridad externa en forma independiente del calcio. El estrés oxidativo estimuló su translocación al núcleo pero no su activación / The transcription factor TonEBP has been implicated in regulation of gene transcription involved in the response to osmotic stress. These genes allow the accumulation of intracellular organic osmolytes and protect to the cell against hypertonicity, normalizing both cell volume and inorganic ion concentration. Sorbitol, one of these compatible organic osmolytes, is generated from glucose by action of Aldose Reductase (AR). It remains unknown whether TonEBP is present in the neonate and adult cardiac myocytes and if it is regulated by changes in the external osmolality and also by oxidative stress. Both immunofluorescence and Western blot results showed that in basal conditions, TonEBP and AR were localized in the cytosol and nucleus in equal amount of cultured neonatal cardiac myocytes. But in adult rats in basal conditions, TonEBP and AR were localizated only in the external membrane cellular. When these cells were exposed to hyperosmotic stress (Sorbitol 600 mOSm) by 8, 16 and 24 h, TonEBP levels increased and it is translocated to the nucleus. Levels of AR and their activity also increased significantly after 8, 16 and 24 h post-stimulus. However, cells exposed to hyposmotic stress (30% dilution in culture medium, 202 mOsm), the amounts of TonEBP and AR decreased respect to controls and AR activity was not detected. On the other hand, our laboratory has previously shown that hyperosmotic stress induced by Sorbitol generates ROS and induces increase in intracellular calcium levels. We tested whether these variables regulates TonEBP. The results showed that nuclear translocation of TonEBP was independent of calcium but ROS were necessary but not sufficient for a complete TonEBP activation. Under these conditions, TonEBP is translocated to the nucleus but that was not induced and neither increased AR levels. Collectivelly, these results suggest TonEBP is present in cultured cardiac myocytes and response to changes in the external osmolality independent of calcium. Nevertheless oxidative stress was not sufficient for a complete activation of TonEBP

Memoria para optar al título de Bioquímico / Las enfermedades cardiovasculares isquémicas son una de las principales causas de muerte en Chile. En estas patologías, los cardiomiocitos están expuestos a privación de nutrientes, hipoxia y estrés osmótico. Nuestro laboratorio ha estudiado el efecto del estrés hiperosmótico sobre el cardiomiocito. Sin embargo se desconocen las consecuencias del estrés hiposmótico ya que a diferencia de otros tipos celulares, las células cardíacas no están expuestas fisiológicamente a grandes fluctuaciones en la osmolaridad externa. Durante los procesos de isquemia y reperfusión, los cardiomiocitos se exponen a estrés oxidativo, desbalance redox intracelular e hiposmolaridad, pudiendo ser las consecuencias de esta última muy severas para el corazón, debido a los cambios electrofisiológicos que acompañan al hinchamiento celular. Este aumento del volumen celular es especialmente marcado durante la reperfusión, evento indispensable para reestablecer la irrigación sanguínea y rescatar al miocardio. Esta memoria estudió el efecto de las especies reactivas de oxígeno en la regulación del volumen y muerte activada por estrés hiposmótico en cardiomiocitos. Nuestros resultados a través de calceína-AM y microscopia confocal, muestran que cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a estrés hiposmótico con soluciones 248 ó 202 mOsm (medio de cultivo diluido 15% y 30% con agua), aumentaron su volumen en un 40 y 60%, respectivamente. Estas células no presentaron disminución regulada de volumen (RVD) espontáneamente, ni en presencia de gramicidina (inductor de RVD). El estrés hiposmótico generó especies reactivas del oxígeno (ROS), evaluada por diclorofluoresceina, siendo el radical hidroxilo la principal especie radicalaria detectada por resonancia de espín electrónico (ESR), usando el atrapador 5,5-dimetilpirrolina 1-óxido. El origen de ROS se determinó observando el efecto de apocinina (inhibidor NADPH oxidasa), rotenona (inhibidor mitocondria), alopurinol (inhibidor xantino oxidasa) y N-acetil-cisteína sobre la oxidación de diclorofluoresceina (DCF-DA). Los resultados muestran que sólo apocinina inhibió la generación de ROS dependiente del estrés hiposmótico. Mediante ESR y células transducidas con AdCAT (catalasa), AdSOD1(superóxido dismutasa citosólica), AdSOD2 (superóxido dismutasa mitocondrial) y AdGPx (glutatión peroxidasa) se identificó a NADPH oxidasa como principal fuente de las ROS. Por otra parte, su generación también se asoció a una disminución en el nivel total de GSH desde los 60 min post-estímulo, siendo significativo a las 4 h, para 202 mOsm. El estrés hiposmótico disminuyó la viabilidad de los cardiomiocitos, determinada por azul de tripán, a las 6 h en un 45 y 40% según el nivel de hiposmolaridad, A diferencia del estrés hiperosmótico no se detectó activación de las caspasas 9 y 3, sugiriendo la existencia de una muerte independiente de caspasas. Dado que no se evaluaron otros parámetros de muerte, aún se desconoce la participación de necrosis o autofagia en la muerte de los cardiomiocitos activada por estrés hiposmótico. La viabilidad celular se recuperó en células transducidas con AdCAT y expuestas a estrés hiposmótico. Además en estas células hubo un RVD parcial. En conclusión, los resultados indican que el estrés hiposmótico aumenta el volumen del cardiomiocito, siendo NADPH oxidasa una de las principales fuentes en la generación de ROS. Estos últimos inhiben el mecanismo de RVD y median la muerte celular estimulada por el estrés hiposmótico.

Tesis para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización Toxicología y Diagnóstico Molecular, y Memoria para optar al Título de Bioquímico / El estrés en el retículo endoplásmico (RE) genera señales hacia el núcleo y citoplasma, reorganizando la homeostasis proteica e interviniendo en la decisión de vida o muerte celular. A pesar de ser ampliamente estudiada, aún se desconocen los mecanismos adaptativos iniciados en la mitocondria ante esta condición. En este trabajo se evaluó si el estrés de RE modula el acoplamiento entre la red mitocondrial y el RE, y si el cambio en esta interacción tiene repercusiones sobre el estado metabólico energético celular. Para inducir estrés de RE, células HeLa se trataron con tunicamicina (inhibidor de la glicosilación en el RE) por 1, 4 y 20 h. El contenido de ATP intracelular, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno se midieron para determinar el estado metabólico celular. La red mitocondrial y el RE se marcaron fluorescentemente y a las imágenes de microscopía confocal se les analizó la colocalización mediante los coeficientes de Manders. Para analizar la participación del citoesqueleto se utilizaron los agentes despolimerizadores nocodazol (microtúbulos) y citocalasina B (microfilamentos de actina). Tras 4 h, el estrés de RE aumentó los niveles intracelulares de ATP, el poder reductor, el potencial mitocondrial y el consumo de oxígeno en las células HeLa. Esta estimulación metabólica resultó transitoria, dado que el ATP, poder reductor y potencial mitocondrial disminuyeron después de 20 h de estrés. A las 4 h se observó también una redistribución mitocondrial y reticular hacia la región perinuclear, que llevó a un aumento en el acoplamiento entre ambos organelos. Esta mayor cercanía, así como la estimulación metabólica no se previnieron por citocalasina, pero sí por nocodazol. Se puede concluir entonces que el estrés de RE, en sus etapas tempranas indujo una mayor capacidad funcional de la mitocondria, asociada a su mayor cercanía con el RE. Estos cambios se llevan a cabo a través del movimiento de los organelos a lo largo de la red de microtúbulos / Endoplasmic reticulum (ER) stress triggers signals to the nucleus and cytoplasm, reorganizing protein homeostasis and intervening in the decision of life or death. Despite being highly studied nowadays, the adaptative mechanisms initiated by mitochondria upon this condition remain unknown. This work studies whether ER stress modulates the spatial coupling between the mitochondrial network and the ER, and the consequences of this interaction on the energetic cell state. To induce ER stress in HeLa cells, they were treated with tunicamycin (inhibitor of protein glycosylation at the ER) for 1, 4 and 20 h. Intracellular ATP content, intracellular reducing level, mitochondrial potential and oxygen consumption were measured to determine the metabolic cell state. The mitochondrial network and the ER were stained with fluorescent markers. Images were taken with a confocal microscope, and colocalization was analyzed with Manders’ coefficients. To determine cytoskeleton participation, two depolymerizing agents were used: nocodazole (for microtubules) and cytochalasin B (for actin microfilaments). Upon 4 h of ER stress, ATP, reducing power, mitochondrial potential and oxygen consumption increased in HeLa cells. This metabolic stimulation was transient due to ATP, reducing power and mitochondrial potential diminished upon 20 h of stress. At 4 h there was a mitochondrial and reticular redistribution towards the perinuclear region, which lead to an increase in organelle coupling. Both enhanced interaction and metabolic stimulation were prevented by nocodazole, but not by cytochalasin. In conclusion, mitochondrial function is enhanced in early states of ER stress, which is associated with enhanced spatial coupling with the ER. These changes take place by the movement of organelles along the microtubule network

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La exposición al frío, activa los nervios simpáticos periféricos y aumenta la tasa de recambio de noradrenalina en órganos con inervación simpática. Este aumento de las concentraciones de noradrenalina en una madre gestante sometida a estrés por frío de 4ºC por 3 horas diarias durante el periodo gestacional, causarían: a.- vasoconstricción a nivel placentario acompañado de una hipoxia fetal, y/o b.- proliferación de la vasculatura placentaría. Tales mecanismos adaptativos debido a la hipoxia fetal, podrían involucrar una entrega mayor de nutrientes y hormonas y gatillar mecanismos adaptativos del feto para sobrevivir a estas nuevas condiciones, especialmente en la función cardiaca. Inicialmente esta adaptación presentará un beneficio en términos de supervivencia, pero posteriormente podría gatillar hipertrofia cardiaca. Así, este estudio evaluó el efecto sobre la morfología cardiaca producida por exposición fetal a estrés por frío crónico (4°C, 3h/día, 21 días), en la descendencia de machos y la respuesta a la estimulación β-adrenérgica (Isoproterenol) en ratas adultas. Para ello, se uso ratas machos Sprague-Dawley en distintas etapas de crecimiento (neonatal, prepúberal y adultas) utilizando ratas de la misma edad- no estresadascomo control. Utilizando parámetros morfométricos (Masa cardiaca total (MCT)/ masa corporal (MC) y masa ventricular (MV)/ masa corporal), medición de área y perímetro en cardiomiocitos y marcadores bioquímicos tales como cadena pesada de β- Miosina (β-MHC) y colágeno tipo I, no se encontraron cambios en todos los grupos de estudio: neonatos, prepúberes y adultos, indicando que no hay hipertrofia ni fibrosis cardiaca. Por último, para evaluar el efecto de la estimulación β-adrenérgica in vivo de los animales, administramos por vía SC, el agonista adrenérgico Isoproterenol (1 mg/Kg peso/día/ 10 días en ratas adultas), para inducir hipertrofia y fibrosis. Las crías prenatalmente expuestas a estrés presentan una mayor respuesta al medicamento expresado como mayor respuesta hipertrófica, pero no así fibrótica en comparación a las ratas del grupo control. Además, presentaron una alta tasa de mortalidad en respuesta al tratamiento sugiriendo fuertemente una mayor sensibilidad a la droga. El conjunto de estos resultados nos sugieren que la sobreactivación simpática durante el embarazo debido al estrés, afecta la función cardíaca de la progenie de una forma que apoya fuertemente una programación de la función cardiaca y con ello, una mayor sensibilidad a una nueva estimulación adrenérgica cuando adultos

Memoria para optar al título de Bioquímico / El correcto funcionamiento celular requiere condiciones físicas específicas, como pH, temperatura y fuerza iónica. Cualquier alteración de estos parámetros puede producir consecuencias graves para las células. La mantención del volumen celular es otro de los parámetros importantes para la célula ya que regula la fuerza iónica y las concentraciones de osmolitos y segundos mensajeros intracelulares. En patologías como la diabetes o isquémicas como el infarto agudo al miocardio, ocurren alteraciones del volumen celular. Durante la isquemia disminuye el aporte de nutrientes y oxígeno a las células por lo que aumenta el catabolismo de nutrientes para obtener energía. Como consecuencia, aumenta la osmolaridad intracelular y con ello, la entrada de agua a la célula produciéndose un aumento de su volumen. Pero las células han desarrollado mecanismos para regular su volumen y volver a la normalidad frente a cambios en la osmolaridad del medio. En el caso del estrés hiposmótico, la estrategia consiste en sacar iones de la célula, lo que disminuye su contenido de agua. Se ha descrito que los cardiomiocitos no regulan espontáneamente su volumen en condiciones de estrés hiposmótico, lo que se ha asociado a muerte. Este hecho es importante si consideramos que el corazón es uno de los órganos más afectados por enfermedades que incluyen episodios isquémicos. Las conexinas son proteínas de transmembrana que forman hexámeros (hemicanal) y se insertan en la membrana plasmática de las células. Si dos hemicanales de células adyacentes se unen forman un canal de una unión en hendidura, y permiten la comunicación de los citoplasmas de las células vecinas. Se ha propuesto que los hemicanales formados por la conexina 43 (Hcs-Cx43) podrían participar en la regulación de volumen de las células, ya que forman verdaderos poros en la superficie celular que permite el paso de agua e iones por difusión simple. El objetivo de esta tesis consistió en determinar si los hemicanales formados por conexinas participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico. Para este fin cultivos primarios de cardiomiocitos de ratas neonatas se expusieron a estrés hiposmótico y se estudió: • Si el estrés hiposmótico modifica el estado funcional de los Hcs-Cx43 a través de la técnica de captación de etidio • Si los cambios en el estado funcional de los Hcs-Cx obedecen a modificaciones en la cantidad de los Hcs-Cx43 expuestos en la membrana o cambios en su estado de fosforilación, mediante la técnica de biotinilación de proteínas de superficie • Si los Hcs-Cx43 participan en la regulación de volumen del cardiomiocito expuesto a estrés hiposmótico, mediante el uso de calceina-AM y microscopía confocal como indicador de los cambios de volumen de la célula e interviniendo el sistema con el inhibidor específico de Hcs-Cx43, Gap26. Los resultados muestran que los Hcs-Cx aumentan su estado funcional al exponer las células a estrés hiposmótico, lo que impide la regulación de volumen del cardiomiocito, ya que al inhibirlos con Gap26 recuperan su volumen. Además se sugiere que el aumento funcional de los Hcs-Cx no se podría explicar por cambios en el estado de fosforilación o alteraciones de la cantidad de Hcs-Cx expuestos en la membrana celular. De estos resultados se concluye que los hemicanales formados por conexinas participan en el control del volumen del cardiomiocito / The cell homeostasis requires specific physical conditions such as pH, temperature and ionic strength. Any alteration in these parameters may produce serious consequences to the cell. The maintenance of cell volume is key parameter because is involved in the regulation of ionic strength, and concentration of osmolyte and intracellular second messengers. Alterations in cell volume have been described in pathologies such as diabetes, stroke and acute myocardial infarction. During ischemia the nutrients and oxygen availability to the cells diminishes, resulting in an increased catabolism in order to obtain energy. As a consequence, intracellular osmolarity increases leading to water influx into the cell and an increase in cell volume. Cells have developed different compensatory mechanisms to restore their volume when they are exposed to changes in external osmolarity. In the case of hyposmotic stress, ions are pumped out the cell to diminish water content. It has been shown that cardiac myocytes are unable to spontaneously regulate their volume when exposed to osmotic stress, and this event has been associated with increased cell death susceptibility. This is important if we consider that cardiac tissue is one of the most affected organs by ischemic diseases. Connexins are transmembrane proteins forming hexamers (hemichannels) at the cell membrane. When two hemichannels from adjacent cells reach each other, they form a gap junction channel, which allow communication of both cytoplasms. It has been proposed that hemichannels formed by connexin 43 (Hcs-Cx43) may participate in cell volume regulation because they form pores in the cell surface allowing the passage of water and ions by simple diffusion. The aim of this work was to evaluate whether Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocytes exposed to hyposmotic stress. To this end, cultured neonatal rat cardiac myocytes were exposed to hyposmotic stress and we study whether: • Hyposmotic stress modifies the functional state of Hcs-Cx43 assessing the ethidium uptake by the cells • Changes in Hcs-Cx functional state are explained by the number of Hcs-Cx43 present in the cell membrane or by changes in their phosphorylation status. • Hcs-Cx43 participates in the volume regulation of cardiac myocyte exposed to hyposmotic stress. This was evaluated using calcein-AM and confocal microscopy to measure changes in cell volume and Gap26 to inhibit Hcs-Cx43. The results showed that the functional state of Hcs-Cx is enhanced in cells exposed to hyposmotic stress. Such increase in the functional state of Hcs-Cx could not be explained by changes in the phosphorylation state or alterations in the amount of Hcs- Cx exposed in the cell surface. The increase in cardiac myocyte volume induced by hyposmostic stress was inhibited by Gap26. These results collectively show that connexin hemichannels participates in the regulation of cardiac myocyte volume

Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica Área de Especialización: Proteínas y Biotecnología y Memoria para Optar al Título de Bioquímica / Para mantener la integridad, la célula debe controlar la cantidad y calidad de las proteínas. El Retículo Endoplásmico (RE) es el organelo en donde se sintetizan todas las proteínas transmembrana y la mayoría de las proteínas secretadas. Cuando se altera la homeostasis del Retículo Endoplásmico se produce una acumulación de proteínas mal plegadas en su lumen. Como respuesta a este estrés se activa una vía de señalización RE-núcleo, en la que se bloquea la expresión general, aumenta la expresión de chaperonas y se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. Un método para producir Estrés en el Retículo Endoplásmico (ERE) es la eliminación del calcio reticular, necesario para el correcto plegamiento proteico. La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un sistema proteolítico que requiere la acción de chaperonas citosólicas para seleccionar, desplegar y dirigir proteínas mal plegadas al interior del lisosoma. Sus actores principales son el receptor lisosomal Lamp2A y la chaperona Hsc70. Se ha descrito la activación de AMC durante la privación prolongada de suero y durante el estrés oxidativo, pero no existen antecedentes de la activación durante el ERE, lo cual constituye el objetivo de esta tesis. Se usó como modelo de estudio células NIH3T3. En estas células se indujo ERE con Tapsigargina (TG), eliminando el calcio en el RE. Mediante western blot se comprobó la aparición de Chop, un factor transcripcional usado clásicamente como marcador de ERE. TG no aumentó la muerte celular, pero produjo un bloqueo en la división celular, deteniendo el ciclo en la etapa G1. Lo anterior se observó mediante citometría de flujo, usando yoduro de propidio como trazador. Mediante inmunocitoquímica y western blot se observó un aumento en los niveles totales de Lamp2A. Esto se relaciona al aumento de Lamp2A en la fracción lisosomal. Además la chaperona Hsc70 se relocaliza hacia la fracción lisosomal en respuesta al estímulo con TG. Estos eventos, el aumento del receptor Lamp2A y relocalización de la chaperona Hcs 70, se han relacionado anteriormente con aumento en la actividad de AMC. Células que expresan constitutivamente un iRNA contra Lamp2A, lo que las hace deficientes en AMC, aumentan la macroautofagia basal. La compensación de macroautofagia es mayor durante un evento de ERE. La mayor actividad de la macroautofagia se refleja en una menor expresión de Chop, que pudiese estar siendo degradado por macroautofagia. Células carentes de ATG5, que no activan macroautofagia, aumentan los niveles totales de Lamp2A. Este es un mecanismo compensatorio, que activa la AMC cuando la macroautofagia no está presente. Sin embargo, la TG disminuyó los niveles totales de Lamp2A. Este inesperado comportamiento puede estar ligado a la activación del proteasoma. En síntesis, esta tesis muestra el primer indicio de la activación de AMC durante un evento de ERE. Esta activación esta dada principalmente por un aumento en los niveles de Lamp2A, que solo se ha visto durante estrés oxidativo. Además muestra que las vías degradativas se comunican para eliminar las proteínas mal plegadas durante el ERE / To maintain the integrity, cells must control the quantity and quality of the proteins. Endoplasmic Reticulum (ER) is the organelle where all transmembrane protein and the most secretory protein are synthesized. Disturbances in the ER homeostasis lead to the accumulation of disfolding proteins in its lumen. In response to this stress a reticulum-nucleus signaling pathway is activated, inducing the selective expression of some genes (i.e. those related to chaperones) and the stimulation of proteolytic systems, including proteasome and macroautophagy. The removal of the calcium reticulum, necessary for the correct protein folding, produces ER stress. Chaperone-mediated autophagy (CMA) is another proteolytic system that requires the action of cytosolic chaperones to select, unfold and pull the unfolded substrate into the lysosomes. Its principal actors are the lysosomal receptor Lamp2A and the chaperone Hsc70. CMA is activated by long serum deprivation and oxidative stress. However it remains unknown whether CMA is stimulated during the ER stress, which it is the main aim of this thesis. The NIH3T3 cells were the study model used. In these cells, Thapsigargin (TG) induces ER stress through the removal ER calcium. Western blot showed an increase in the Chop level, a classic ER stress transcriptional factor. TG didn’t stimulate cell death but arrested cell cycle at G1 stage. This was showed through FACS, using propidium iodide dye. Immunocytochemistry and western blot studies showed that TG increases the Lamp2A total levels. Another observation is the increase of Lamp2A level in the lysosomal fraction. Also, we have seen increases in the hsc70 localization in to the lysosomal fraction. These events, the rise in Lamp2A levels and Hsc70 lysosomal localization, previously have being related with an increase in the CMA activity. Constitutive Lamp2A-siRNA cells, CMA deficient cells, increased basal macroautophagy. Also this macroautophagy compensation is most important during ER stress. The higher macroautophagy activity was associated with low expression of Chop, showing a probable degradation the Chop by macroautophagy. ATG5 knock out cells, macroautophagy deficient cells, showed an increase in the Lamp2A total levels. This cells revealing a compensatory effect of the CMA when the macroautophagy is inactive. However, TG produces a decrease of the levels of Lamp2A.This unexpected behavior is probably related to the proteasome activation. In synthesis, this tesis show by the first time the CMA activation during ER stress. This activation is related to the total Lamp2A increase, only before seen in oxidative stress. Also we show the connection between the proteolytic pathways in the unfolding protein degradation, during ER stress

Memoria para optar el título de Bioquímico / El estrés reconocido como un desequilibrio provocado por un estímulo, tiene múltiples efectos sobre los organismos vivos y además en órganos específicos. Nuestro laboratorio ha encontrado que el estrés por frío activa la inervación simpática que llega al ovario, junto con producir cambios importantes en el desarrollo folicular y la función reproductiva. Sumado a esto, se conoce que la descendencia es sensible a varios estímulos estresantes que son experimentados por la madre; así en esta Memoria, probamos el efecto del estrés frío aplicado a la rata madre durante la preñez sobre las ratas hijas de la descendencia. Usamos un procedimiento previamente descrito de estrés frío crónico (3h/día a 4ºC) aplicado a ratas Sprague-Dawley durante los 21 días de preñez (E1-21). Después del procedimiento de estrés, las crías fueron estudiadas durante el desarrollo (número y sexo de crías sobrevivientes), durante la pubertad (edad de la apertura vaginal) y cuando ratas adultas, su actividad cíclica estral, la actividad secretora de esteroides ováricos, el desarrollo folicular y la concentración de neurotransmisores. En paralelo, el contenido hipotalámico de monoaminas (dopamina y serotonina) y sus respectivos metabolitos fueron determinados. Las ratas adultas fueron eutanasiadas durante etapas estro y diestro para estudiar la respuesta antes y después de la ovulación. El estrés aplicado en la madre provocó un incremento en el número de nacimientos de machos comparado al de las hembras, el peso corporal de las ratas hijas hembras, la apertura vaginal y la actividad cíclica estral no fue afectada. Cuando las ratas adultas, los hipotálamos mostraron una disminución en la actividad serotoninérgica y dopaminérgica en etapa estro. El contenido de noradrenalina (NA) en el ganglio celiaco (donde se proyectan las neuronas noradrenérgicas al origen del ovario) respondió con un descenso de NA en ratas eutanasiadas en estro y una tendencia a incrementarse cuando las ratas fueron sacrificadas en diestro. Las catecolaminas adrenales decrecieron en ambas etapas del periodo estral en el grupo estresado. En el ovario, analizamos la relación entre el contenido de catecolaminas (NA) y la secreción espontánea de esteroides. Durante estro encontramos una directa correlación entre un descenso del contenido de NA y la reducida secreción de androstenediona (Δ4) y de estradiol (E2). Encontramos una incrementada función luteal del ovario, situación que fue verificada por un alto número de cuerpos lúteos. En conclusión el estrés por frío, como un ejemplo de estrés físico, durante la gestación, produjo importantes cambios a nivel hipotalámico, de la actividad nerviosa periférica y en el eje adrenal, lo cual se traduce en cambios permanentes en la función ovárica del animal durante su vida adulta / Stress as a disequilibrium provoked by a stimulus has multiples effects on living organisms and specifics organs. Our laboratory has found that cold stress activates the sympathetic innervation reaching the ovary and produced important changes in the ovarian follicular development and reproductive function. In addition, it is known that offspring are sensitive to various stressful stimuli being experienced by the mother, thus in this Memory we wanted to test the effect produced on the offspring when adults mothers were under cold stress during pregnancy. We used a previously described chronic cold stress procedure (3h/day at 4ºC) applied to Sprague-Dawley rats during the whole 21 days of pregnancy (E1-21). After the stress procedure, pups were studied during development (number and sex of pups surviving), during puberty (age of vaginal opening) and when adults, their estrous cycling activity, ovarian steroids secretory activity, follicular development and concentration of neurotransmitter. In parallel, the hypothalamic content of monoamines (dopamine and serotonine) and its metabolites were determined. The adults rats were euthanized during diestrus and estrous to study the response before and after ovulation. After stress there was an increased number of male pups compared to females, the body weight of female offspring, vaginal opening and estrous cycling activity were not affected. In the adult rat hypothalamus the turnover of serotonine and dopamine decreased in estrous. Noradrenaline (NA) content at coeliac ganglion (where noradrenergic neurons projecting to the ovary originates), the E1-21 group respond with a decrease in NA in rats euthanized in estrous and a tendency to increase when rats where sacrificed in diestrus. The adrenal catecholamines decreased in both stages of estrous cycles in the groups stressed. In the ovary we analyze the relationship between catecholamines (NA) content and the spontaneous secretion of steroids. During estrus we found a direct correlation between a decreased content of NA and reduced secretion of androstenedione (Δ4) and estradiol (E2) secretion in the group E1-21. We also found an enhanced luteal function of the ovary, situation that was verify by an increased number of corpus luteum. In conclusion, cold stress, as an example of physical stress, during gestation, may produce major changes in hypothalamic level, in the activity of peripheral nerves and in the adrenal axis, which result in permanent changes in ovarian function of the animal during its adult life

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctora en Farmacología / El estrés está definido como cualquier estímulo capaz de alterar la homeostasis del organismo, es una reacción fisiológica necesaria para la supervivencia y es la forma que posee el organismo para afrontar una situación agobiante y/o amenazadora. Frente a una situación de estrés, el organismo reacciona generando una respuesta simpaticomimética conocida como “respuesta de pelea o huida”, produciendo un aumento en la liberación de noradrenalina. Todos los organismos vivos son moldeables durante el embarazo y sus primeros momentos de vida. Esto les permite adaptarse al medio ambiente que los rodea sin regirse exclusivamente por su carga genética. El periodo de gestación es una etapa particularmente sensible a situaciones de estrés, pudiéndose generar modificaciones en el ambiente fetal lo que a su vez puede producir una adaptación permanente en el desarrollo postnatal, proceso conocido como programación fetal. Se han encontrado estrechas relaciones entre diversas enfermedades y el ambiente fetal, entre ellas encontramos relaciones entre bajo peso al nacer con un aumento en las muertes por enfermedades coronarias, intolerancia a la insulina y aumento en la presión arterial en la adultez. Nuestro objetivo fue determinar el efecto producido por tratamientos de estrés por frío crónico (4°C/3h/día) aplicado durante todo el periodo de gestación en ratas Sprague-Dawley sobre los transportadores de noradrenalina placentarios, los receptores β-adrenérgicos cardíacos y los cambios sobre la función cardiovascular y metabólica en la descendencia hembra. Se observó que el tratamiento de estrés por frío crónico generó un aumento en las concentraciones de noradrenalina y corticosterona en el plasma de las ratas gestantes junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. No se observaron cambios en el peso de las ratas gestantes, sin embargo se encontró un aumento en el peso de las crías estresadas durante la etapa prenatal. Además, se observó que en crías hembras de 20 días se generó un aumento en la razón de los receptores β1/β2-adrenérgicos cardíacos y que a los 60 días se registra una disminución en la afinidad de estos receptores y un aumento en las áreas y perímetros de los cardiomiocitos junto con un aumento en el peso de sus corazones. Con el objetivo de determinar si el aumento en área y perímetro de los cardiomiocitos afecta la funcionalidad del corazón se sometió a las crías hembras adultas a una sobrecarga adrenérgica crónica (administración de isoproterenol subcutáneo, 125 μg/kg de peso/10 días), encontrándose un aumento en la presencia de extrasístoles lo que generó un 40% de mortalidad en las crías hembras. Finalmente, para determinar los posibles efectos metabólicos del estrés prenatal se realizó un test de tolerancia a la glucosa (administración oral de 2 g de glucosa/kg de peso de una solución al 40%) encontrando resistencia a la insulina en las crías hembras adultas. Tomando en cuenta todo lo anteriormente mencionado, concluimos que la exposición a una situación crónica de estrés por frío durante el periodo de gestación produjo un aumento en las concentraciones de noradrenalina plasmática materna junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. Esto programaría a estos nuevos sujetos, causando una mayor sensibilidad frente a una sobrecarga adrenérgica crónica (40% muerte) junto con presencia de resistencia a la insulina en las crías hembras adultas / Stress is defined as any stimulus capable of altering the homeostasis of the organism, it is a physiological reaction necessary for survival and is the way that has the organism to face a threatening and/or overwhelming situation. Faced with a stressful situation, the organism reacts by generating a sympathomimetic response known as the “fight or flight response”, resulting in an increase in norepinephrine release. All living organisms are moldable during pregnancy and their first moments of life. This allows them to adapt to the environment around them not bound exclusively to their genetic charge. The gestation period is particularly sensitive to a stress situation capable of modifying the fetal environment, which can cause a permanent adaptation on the postnatal development; this is known as fetal programming. Close relationships between various diseases and fetal environment has been found. Among them there are relations between low birth weight with an increase in deaths from coronary diseases, insulin intolerance and increase in blood pressure in adulthood. Our objective was to determine the effect produced by chronic cold stress treatments (4°C/3h/day) applied during the entire period of pregnancy in Sprague-Dawley rats on placental norepinephrine transporters, cardiac β-adrenergic receptors and changes on cardiovascular and metabolic function in the female offspring. An increase in norepinephrine and corticosterone concentrations on plasma of stressed pregnant rats with a decrease in the functionality of placental norepinephrine transporters was observed. No changes were observed in the weight of pregnant rats, however an increase in the weight of pups was found prenatally. In addition, females of 20 days old of the stressed progeny, presented an increase in the ratio of the cardiac β1/β2-adrenergic receptors, and at 60 days old, a decrease in the affinity of these receptors was apparent. An increase in the cardiac cells areas and perimeters along with an increase in the weight of their hearts was also found at 60 days old. To determine what was happening with the functionality of these hearts, we exposed the adult females to a chronic adrenergic overload (administration of a daily subcutaneous isoproterenol injection with 125 μg/kg of weight/10 days). The chronic overload of adrenergic stimulation provoked an increase in the presence of premature beats causing death to 40% of the females pups. To determine possible programming of metabolic effects of prenatal stress, a tolerance glucose test (oral administration of 2g of glucose/kg of weight of a 40% solution) was performed. Results demonstrated that gestational stress programmed a metabolic disturbance that was expressed in the adult progeny, founding insulin resistance in adult females. Therefore, the increase in maternal plasma norepinephrine concentration provoked by the exposure to chronic cold stress during all gestation period caused a decrease in the functionality of the placental norepinephrine transporters. This would be the cause to program the fetus for an increased sensitivity to a chronic adrenergic overload (40% of death) together with the presence of insulin resistance in adult females / Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Diversas condiciones pueden producir estrés en el retículo endoplásmico, tales como la acción de compuestos, como la tapsigargina (TG) y la tunicamicina (TU) o distintas situaciones patológicas como la hipoxia, daño oxidativo o reductor, infecciones virales e hipoglicemia. Todas ellas generan una acumulación de proteínas mal plegadas en el retículo endoplásmico (RE), que conduce a la activación de una respuesta celular al estrés altamente conservada, evolutivamente conocida como respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), la cual puede ser adaptativa, de alarma o muerte dependiendo de la intensidad y cronicidad del estímulo. La respuesta adaptativa está diseñada especialmente para restablecer la homeostasis de RE y su normal funcionamiento por medio de la inducción de genes que codifican a chaperonas, a la vía de degradación de proteínas asociada al RE (ERAD) y la degradación proteoasomal de proteínas, así como también a proteínas que aumentan la capacidad plegadora del RE. Si estas respuestas adaptativas no logran recobrar el equilibrio en el RE, se activa el programa de muerte celular de tipo apoptótico, necrótico o autofágico. Las respuestas adaptativas mencionadas operan principalmente por medio de tres vías transduccionales: IRE1, PERK y ATF6, siendo las vías IRE1 y ATF6 las involucradas en las etapas iniciales de la UPR, para restablecer la homeostasis del RE. Sin embargo al mantenerse el estímulo de estrés las tres vías se activan en conjunto para inducir genes de muerte celular como lo es GADD153/CHOP. La insulina participa en la regulación de diversos procesos celulares, entre los que se encuentran el metabolismo de la glucosa en el tejido muscular y adiposo, el de los ácidos grasos en el hígado y células grasas. Estas acciones están mediadas por medio de la activación de su receptor de membrana, el receptor de insulina (IR), el El modelo experimental utilizado fue cultivo primario de cardiomiocitos de ratas neonatas expuestos a dos tipos de estresores, TG y TU, por 24 hrs., e insulina por 15 minutos y 24 hrs. Los resultados obtenidos mostraron que, tanto TG como TU, indujeron estrés de RE en los cardiomiocitos y que activaron el programa de muerte celular de manera dosis-dependiente, esto determinado por la expresión de la proteína GADD153/CHOP. Sin embargo no se observaron cambios en los niveles de la chaperona Grp78/BIP. La inducción de estrés de RE afectó la viabilidad celular de manera dependiente de la concentración, esto determinado por los ensayos de exclusión de yoduro de propidio (IP) y azul de tripán. Además se observó que la muerte celular posee un componente importante de apoptosis. La insulina por sí sola no indujo estrés de RE en los cardiomiocitos, sin embargo disminuyó la expresión de GADD153/CHOP de los cardiomiocitos estimulados con TG y TU. Este efecto es parcial ya que la insulina no recuperó los niveles basales de GADD153/CHOP. La inducción del estrés de RE con TU o TG en los cardiomiocitos afectó la vía transduccional de la insulina, disminuyendo la activación del receptor de insulina y de PKB/Akt, sin afectar los niveles totales de Akt. Finalmente, los resultados permiten concluir que la insulina es un regulador negativo del estrés de RE en cardiomiocitos inducida por TG y TU / Conditions like thapsigargin (TG) and tunicamycin (TU), hypoxia, reductive and oxidative damage, viral infections and hypoglycemia may produce endoplasmic reticulum stress, leading to an accumulation of misfolded proteins in the ER, and the subsequent activation of a cell stress response knows as UPR. This response can leads to cell adaptation, alarm or cell death. The adaptive response is especially designed to reestablish ER homeostasis by the induction of genes that encode chaperones, the ERAD pathway and the proteoasomal proteins degradation, as well as proteins increasing the folding capacity of the ER. However, depending of the strength or exposure time, the cell death program can be activated leading to that apoptosis, necrosis and autophagy. The adaptive response above described, can signal three independent transductional pathways: IRE1, PERK and ATF6, being IRE1 and ATF6 pathway involved in the early stages of UPR, to reestablish ER homeostasis. However a chronic stress activates cell death signaling pathway, inducing genes like GADD153/CHOP. Insulin participates in different cell processes including the regulation of glucose metabolism in muscle and adipose tissue, fatty acids metabolism in the liver and adipocytes. These actions are mediated by the activation of its membrane receptor, insulin receptor (IR), wich has an intrinsic tyrosine kinase activity and allows the activation of the following signaling cascades PI3K/PKB/Akt and MAPK/ERK. Severeal evidences have shown that TG and TU induce ER stress. However the research made on the insulin activity in the regulation of the ER stress are only in neurons, in which the inhibition of PKB/Akt is capable of induce the GADD153/CHOP expression, but the mechanism involved in this process is not fully understood. Our working hypothesis state that “Insulin attenuates the endoplasmic reticulum stress in cultured cardiomyocytes”. The experimental model was primary cultures of neonatal rat cardiomyocytes exposed to the stressors, TG and TU, for 24 h and insulin for 15 minutes and 24 h. Our results showed that both, TG and TU, induced ER stress in cardiomyocytes activating the cell death program in concentration-dependent manner. This event was characterized by the expression of GADD153/CHOP. However any effect was observed in Grp78/BIP levels. ER stress induction affected the cell viability in concentration-dependent manner, was assessed by IP and tripán blue exclusion tests. We also observed that apoptosis was the type of cell death activated in our model of ER stress. Insulin itself did not induce ER strees in cultured cardiomyocytes, however decreased GADD153/CHOP expression triggered by TG and TU. This effect is partial because the insulin did not recover GADD153/CHOP basal levels. ER stress induction in cultured cardiomyocytes affected insulin signaling pathway characterized by decreased insulin receptor activation and phosphorylated PKB/Akt levels without any effect in total PKB/Akt levels. This effect was seen both with TG and TU. In summary, these results suggest that insulin receptor signaling pathway is negatively regulated by ER stressors in cultured cardiomyocytes