Tesis para optar al grado académico de Magister en Bioquímica, área de especialización en Bioquímica Toxicológica y Diagnóstico Molecular y Memoria para optar al título profesional de Bioquímica / En la actualidad la mujer ha decido posponer la maternidad hasta después de los 30 años. El aplazar la maternidad hacia la ventana de subfertilidad (31 a 41 años), provoca una disminución de la fertilidad y en el éxito de los programas de fertilización in vitro, los cuales poseen estrechos márgenes de éxito, que se hacen cada vez más pequeños conforme va aumentando la edad de las mujeres. Por esta razón es necesario conocer los mecanismos involucrados en el envejecimiento ovárico, durante el periodo de subfertilidad femenino. Para ello se ha utilizado el modelo múrido, debido a su similitud con procesos que regulan la función del ovario en el ser humano, considerándose como un buen modelo para comprender los mecanismos involucrados en el envejecimiento reproductivo. Se ha demostrado que durante el periodo de sub-fertilidad y en mujeres menopáusicas, los ovarios presentan características fisiológicas similares a las encontradas en el Síndrome de ovario poliquístico, patología de alta prevalencia en mujeres durante edad fértil. Estas observaciones se basan en el hecho de que en ambas condiciones existe un retraso en el desarrollo folicular, disminución del número de folículos antrales y la aparición de estructuras quísticas, que prevalecen incluso después de la menopausia. Se ha descrito que uno de los factores que participa en la aparición de estas condiciones es el aumento del tono nervioso simpático y del contenido de noradrenalina (NA) intraovárica, la que ejerce su función a través de la activación de los receptores 2-adrenérgicos. Este aumento en la actividad nerviosa simpática del ovario se ha relacionado con un aumento en la secreción de hormonas esteroidales y la mantención y/o aparición de las estructuras quísticas, lo que conduce a problemas de fertilidad. Para disminuir la estimulación del sistema nervioso simpático sobre el ovario en el periodo de subfertilidad de la rata (8 a 10 meses), y para determinar si la NA participa en el cese de la función ovárica y/o formación de los quistes foliculares, se propuso bloquear la acción de los receptores -adrenérgicos. Para ello, se administró una inyección diaria de propranolol (antagonista -adrenérgico), durante 2 meses a ratas que se encuentran en el periodo de subfertilidad. Después de los dos meses de tratamiento se analizó la ciclicidad estral de la rata por medio de la observación microscópica del frotis vaginal, se determinaron las hormonas esteroidales en plasma mediante EIA, la concentración de NA y su metabolito MHPG en ovario mediante HPLC; además se realizó análisis morfológico de los ovarios. Los resultados muestran que el bloqueo -adrenérgico con propranolol permite reactivar el desarrollo folicular. Esto evidenciado por: a) el aumento en el número de folículos antrales sanos y cuerpos lúteos, b) el aumento del porcentaje de ovulación y los niveles de hormonas esteroidales en el plasma, c) la disminución en el número de folículos quísticos (quistes y prequistes) y el tamaño de los folículos tipo III y prequistes. Considerando que durante el envejecimiento existe un aumento del tono adrenérgico sobre el ovario, que podría resultar perjudicial, hemos logrado, mediante el bloqueo - adrenérgico, mejorar la funcionalidad ovárica. Este tratamiento reactivó el desarrollo folicular, evidenciado en la recuperación de la esteroidogénesis y foliculogénesis, dando a este fármaco expectativas para su uso a nivel clínico como terapia de ayuda, para poder expandir o retrasar la ventana de subfertilidad en la mujer / Today women have decided to postpone childbearing even after their thirties. The delay of the motherhood towards the subfertility period is associated to diminished fertility and a decreased success rate in in vitro fertilization programs, the latter being rarely successful and even less successful as women get older. For this reason it became necessary to understand the mechanisms related to ovarian ageing during the subfertility period. To accomplish this, the murine model has been used, because it describes almost all the process that regulates the ovarian function in humans, therefore is a good model for understanding the mechanisms involved in the reproductive aging. It has been show that during the sub-fertility and the menopausal period in woman, the ovaries present physiological characteristics similar to those found in the polycystic ovarian syndrome, the pathology with the highest prevalence in women during the fertility age. The observations are based, for example, in the delay in follicular development, decreased number of antral follicles and the spontaneous generation of cystic structures, that prevail until the menopausal age. Today we know one of the factors that participates in the generation of this condition is the rise in the sympathetic tone and the noradrenaline (NA) released in the ovary, which exerts his function through the 2-adrenergic receptor activation. That is correlated with the steroid hormone secretion and the maintenance or generation of the cystic structures, leading to fertility issues. To inhibit the effect in the rise of the sympathetic tone in the ovary during the sub fertility period, and to determine if the NA participates in the cessations of the ovarian function and/or follicular cyst formation and maintenance, we propose a pharmacological block the - adrenergic receptors. To achieve this we administered propranolol, a -adrenergic receptors antagonist, in a daily injection for 2 months, to rats that have reached the sub fertility period (8 and 10 months old). After 2 months of propranolol treatment, estrous cyclicity was analyzed through vaginal smear, steroidal hormones were analyzed in plasma through EIA, the NA content and one of its metabolites was measured in HPLC and finally we performed a morphological analysis of the complete ovary. The results show that the -adrenergic blockade allows reactivation of the follicular development, which is evidenced by an increase in: a) healthy antral follicles and corpora lutea amount, b) ovulation percentage and esteroidal hormones levels in plasma, and c) decreased amount of cystic follicles (cyst and precyst) and in the follicles size (type III follicles and precyst). Therefore we can observe an activation in follicular development that leads to ovulation and inhibits the cyst formation pathway. During aging there is an increase in the ovarian adrenergic tone. After the -adrenergic blockade, we could see the improvement of the ovarian function and follicular development, as evidenced by the rise in the steroidogenesis and folliculogenesis. These findings let us propose propranolol for use in clinical trials as a clinical therapy help, to expand or delay the sub fertility period in the woman

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Magíster en Bioquímica, área de especialización en bioquímica clínica y Memoria para optar al título profesional de Bioquímico / La neurotransmisión noradrenérgica está relacionada con procesos como el aprendizaje y la memoria. Se ha observado en el cuadro depresivo una disminución en la neurotransmisión de noradrenalina (NA), alteraciones de la arquitectura dendrítica y la disminución de los niveles de factores tróficos como el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El hecho de que una variación de los niveles de NA pueda activar diferentes receptores adrenérgicos en el espacio sináptico, podría explicar en parte los mecanismos de plasticidad sináptica involucrados en cambios morfofuncionales, desde acciones sobre la complejidad dendrítica hasta la modulación sobre procesos complejos como aprendizaje y memoria. Esta noción es apoyada por el hecho de que los fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico revierten la atrofia dendrítica observada en modelos animales de depresión, y recuperan el deterioro cognitivo. En base a estos antecedentes hemos propuesto en esta Tesis que: “La activación de receptores β‐adrenérgicos promueve un aumento en la complejidad dendrítica en cultivos primarios de neuronas hipocampales”. Se obtuvieron cultivos hipocampales de ratas en estado fetal de 18 días (E18), y se cultivaron durante 7 días in vitro (7 DIV). En estos cultivos se evaluó a través de Western Blot la respuesta frente a la estimulación de receptores β‐adrenérgicos, midiendo la fosforilación de la Proteína de Unión al Elemento de Respuesta al AMP cíclico (CREB) frente a estímulos cortos (5‐ 15 minutos) con noradrenalina (100 nM) en ausencia y presencia del β‐antagonista propranolol (10 μM). Junto con ello, se observó la distribución de CREB fosforilado a través de inmunocitoquímica luego de estímulos de 2 horas con los mismos fármacos. No fue posible a través de estas técnicas observar modificaciones en la intensidad de la señal o la distribución de p‐CREB. Sin embargo, la adición de NA fue capaz de promover un incremento en el calcio citosólico, como se demostró a través del uso de sondas fluorescentes, y una reducción en la actividad neuronal evaluada por registros whole-cell. Los cultivos a los 7 DIV presentan receptores β2‐adrenérgicos, visualizados a través de Western Blot. Más aún, estudios de inmunocitoquímica muestran que el receptor β2 presenta una distribución principalmente somatodendrítica. A través de la estimulación farmacológica de los cultivos durante 24 horas con NA 100 nM o clenbuterol 25 nM, en ausencia y presencia de propranolol 10 μM, se estudió si la activación de receptores adrenérgicos modula la morfología dendrítica. Ésta fue evaluada a través de la medición de puntos de intersección (Análisis de Sholl), puntos de ramificación, largo y número de dendritas. La estimulación con clenbuterol 25 nM no produjo efecto sobre ninguno de estos parámetros, descartando la participación de los receptores β2‐ adrenérgicos en la arquitectura dendrítica. Tampoco produjo efectos en la morfología de las dendritas la administración por separado de noradrenalina o propranolol. Sin embargo, los cultivos estimulados con NA posterior a la incubación con propranolol mostraron una reducción en el número de intersecciones del análisis de Sholl en el rango de los 30‐80 μm en comparación con el control. Estos cambios están acompañados por un descenso en el largo total de las dendritas primarias, y en particular de las dendritas primarias mayores a 40 μm, sin que el número de dendritas primarias por neurona se viera modificado. Un efecto similar se observó en las dendritas secundarias. Estos resultados sugieren que los cambios en el largo dendrítico observados probablemente no se asocian a la activación de receptores β2‐adrenérgicos. Proponemos que la activación de receptores α‐ y β1‐adrenérgicos regularían la morfología neuronal, probablemente con efectos opuestos, controlando el largo dendrítico de las dendritas primarias y secundarias de mayor tamaño. El estudio realizado en esta Tesis por primera vez describe efectos de la activación de receptores adrenérgicos sobre la morfología neuronal, pudiendo explicar en parte los cambios morfológicos y mejoría cognitiva tras el tratamiento de fármacos que incrementan los niveles de NA en el espacio sináptico / Noradrenergic neurotransmission is related with processes as learning and memory. In depressive behavior, it has been observed a decrease in noradrenaline (NA) neurotransmission, alterations on dendritic arborization and a decrease in levels of trophic factors, such as brain derived neurotrophic factor (BDNF). The fact that different levels of NA can activate different adrenergic receptors at synaptic cleft, could explain part of synaptic neuroplasticity mechanisms involved in morphofunctional alterations, from actions on dendritic complexity to modulation of complex processes as learning and memory. This notion is supported by the fact that drugs that increase levels of NA at synaptic cleft reverse dendritic atrophy observed in animal models of depression, and recover cognitive impairment. Considering these antecedents, this Thesis proposed that: “Activation of β‐adrenergic receptors promotes an increase in dendritic complexity in primary cultures of hippocampal neurons”. Hippocampal primary cultures were obtained from embryonic day 18 (E18) Sprague‐Dawley rat fetuses, and cultured for 7 days in vitro (7DIV). In these cultures, changes in phosphorylation of cAMP‐response element binding protein (CREB) were evaluated by Western Blot, in response to short stimulus (5‐15 min) with 100 nM NA in absence and presence of 10 μM propanolol, a β‐adrenergic receptor antagonist. In addition, levels of phosphorylated CREB (p‐CREB) were measured by immunocytochemistry, after stimulation of 2 hours with the same drugs. It was not possible to observe modifications on signal intensity of p‐CREB through these techniques. However, the addition of NA promoted an increase in cytosolic calcium, measured by fluorescent probes for calcium, and a reduction of neuronal activity evaluated by whole‐cell recording. The 7 DIV cultures showed β2‐adrenergic receptors, which were visualized by Western Blot. Moreover, immunocytochemistry studies showed that β2‐adrenergic receptor was distributed in neurons mainly in the somato‐dendritic compartment. Through pharmacological stimulation of cultures for 24 hours with 100 nM NA or 25 nM clenbuterol, with 10 μM propranolol absent or present, the activation of adrenergic receptors and their role in dendritic morphology has been measured. Morphology was evaluated through the measurement of intersection points (Sholl Analysis), branching points, and dendritic length and number. Stimulation with 25 nM clenbuterol did not have effect on any of these parameters, thus any role of β2‐adrenergic receptors in dendritic architecture was discarded. Neither administration of NA nor propranolol alone produced effects on dendrite morphology. However, NA‐stimulated cultures after incubation with propranolol showed a reduction in the number of intersections in Sholl analysis compared with controls, in the 30‐80 μm range. Those changes were accompanied by a reduction in primary dendrites greater than 40 μm, without any modifications in primary dendrite number per neuron. A similar effect was shown in secondary dendrites. These results suggest that changes observed in dendritic length were probably not associated with the activation of β2‐adrenergic receptors. We propose that the activation of α‐ and β1‐adrenergic receptors may regulate neuron morphology, probably with opposite effects, controlling dendritic length of longer primary and secondary dendrites. The study carried out in this Thesis describes for first time the effects of adrenergic receptors activation in dendrite morphology, and may explain in part the morphological changes and cognitive improvement after treatment of drugs that increase levels of NA in the synaptic cleft

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El estrés es la forma que posee el organismo para afrontar una situación agobiante y/o amenazadora. Frente a una situación de estrés, el organismo responde activando el Sistema Nervioso Simpático, lo que produce un aumento en la liberación de catecolaminas, que se traduce en una respuesta simpaticomimética conocida como “respuesta de pelea o huida”. Existen etapas del desarrollo en las cuales es especialmente delicado para el equilibrio del organismo, el enfrentarse a situaciones de estrés. Por ejemplo, durante el embarazo, un estrés crónico que cambie el ambiente en el cual se desarrolla el individuo, tiene efectos importantes que programan permanentemente su desarrollo postnatal. En el presente trabajo estudiamos el efecto que produce el estrés por frío, sobre las características farmacológicas de los receptores β-adrenérgicos cardíacos de la descendencia. Para tal efecto, se sometió a ratas Sprague-Dawley preñadas, a estrés por frío crónico intermitente (4ºC por 3h/día) durante todo el periodo de gestación y se evaluó el efecto que causa este estrés en la descendencia, comparándola con un grupo control, en el cual la madre se mantuvo a 20ºC durante la gestación. Las crías adultas se sacrificaron y se estudiaron los cambios a nivel cardíaco de los receptores β-adrenérgicos mediante técnica de radioligando, los cambios en la actividad del Sistema Nervioso Simpático a través de la determinación de Noradrenalina (NA) y su metabolito por HPLC y los niveles plasmáticos de las hormonas sexuales por ELISA, comparando en cada caso entre machos y hembras buscando diferencias entre género. Hubo diferencias evidentes entre géneros, al momento del sacrificio las ratas hembras estresadas tuvieron menor peso corporal junto con un mayor peso ventricular que las ratas controles, algo que en ratas machos no variaba. En cambio, las ratas machos tenían una menor concentración de receptores β-adrenérgicos y una mayor actividad nerviosa simpática a nivel cardíaco (medida como el recambio de NA) comparada con las ratas hembras. Pero, comparando entre el mismo sexo no hubo cambios en la concentración de receptores β-adrenérgicos, en la concentración de NA ni tampoco en la activación nerviosa a nivel cardíaco por efecto del estrés. Sin embargo, hubo un cambio en la afinidad de los receptores β-adrenérgicos (reflejada en el aumento en la IC50 del Atenolol y del Propranolol). Por lo tanto, existen diferencias fisiológicas entre ratas machos y hembras, estas últimas presentan una mayor concentración de receptores β-adrenérgicos lo que podría indicar una mayor susceptibilidad a la respuesta frente al estrés. Por otro lado, el estrés por frío crónico intermitente no produce variaciones en la concentración de receptores β-adrenérgicos, pero sí cambia la respuesta funcional de estos receptores, lo que podría afectar las respuestas del organismo a situaciones de estrés futuras / Stress is the way that possesses the organism to affront an oppressive or threatening situation. Facing a stressful situation, the organism activates the Sympathetic Nervous System, resulting in an increased release of catecholamines, which is translated into a sympathomimetic response known as the “fight or flight response”. There are some stages of development which facing a stressful situation is particularly sensitive to the balance of the body. For example, during pregnancy, a stressful situation that changes the environment of the foetus, will have important effects that permanently programs postnatal development. In the present work we study the effect produced by cold stress on the pharmacological characteristics of heart β-adrenergic receptors in the offspring. To this end, we submitted pregnant Sprague-Dawley rats to chronic intermittent cold stress (4°C for 3h/day) throughout the gestation period and assessed the effect that causes this stress in the offspring, compared with a control group in which the mother was kept at 20°C during pregnancy. The adult offspring were sacrificed and we studied the changes at cardiac β-adrenergic receptors by radioligand technique, changes in the Sympathetic Nervous System through the determination of Noradrenaline and its metabolite by HPLC and plasma levels sex hormones by ELISA, comparing in each case between males and females looking for differences between genders. There were obvious differences between genders, at the moment of sacrifice female rats had lower body weight along with an increased ventricular weight than control rats, which did not vary in male rats. In contrast, the male rats had a lower concentration of β-adrenergic receptors and increased sympathetic nerve activity (measured as the turnover of Noradrenaline) compared with female rats. But, comparing the same sex there was no change in the concentration of β-adrenergic receptors, in Noradrenaline concentration or nerve activation in the heart, caused by stress. However, there was a change in the affinity of β-adrenergic receptors (reflected in the increased in IC50 of Atenolol and Propranolol). Therefore, there are physiological differences between male and female rats, the latter have a higher concentration of β-adrenergic receptors which may indicate an increased susceptibility to stress. On the other hand, chronic intermittent cold stress does not cause variations in the concentration of β-adrenergic receptors, but changes the functional response of these receptors, which could affect the body’s responses to future stressful situations

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son las principales células no contráctiles presentes en el miocardio. Su función principal es preservar la estructura y el buen funcionamiento cardiaco, lo cual se realiza a través de la síntesis y secreción de componentes de la matriz extracelular. Después de un daño tisular, los fibroblastos cardiacos son células claves, del proceso reparativo y de cicatrización. Si este proceso se exacerba, se llega a fibrosis cardiaca rigidizando el corazón e incrementando el riesgo de arritmias, alterando fuertemente la función cardiaca. En este sentido, se ha demostrado que el aumento de AMPc, contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración, secreción de colágeno y la diferenciación celular. En fibroblastos cardiacos se ha descrito que isoproterenol, un agonista de los receptores β-adrenérgicos, actúa vía Gs y estimula la producción de AMPc. Por otro lado, BK agonista del receptor B2 de cininas, activa su receptor vía Gq, y por sí mismo, no altera la producción de AMPc. Sin embargo, BK en combinación con isoproterenol potencia la respuesta adrenérgica aumentando de manera sinérgica la producción de AMPc en relación a la activación solo por isoproterenol. El objetivo de este trabajo fue estudiar in vitro, en cultivos primaros de fibroblastos cardiacos de ratas neonatas, el cross-talk entre las vías de señalización Gs-Gq y determinar si el aumento en los niveles de AMPc modula la adhesión, migración, síntesis de colágeno y diferenciación en fibroblastos cardiacos. BK tiene un efecto sinérgico en los niveles de AMPc aumentados por isoproterenol. Del mismo modo, BK potencia la adhesión de fibroblastos cardiacos estimulada por Isoproterenol; sin embargo, BK no tiene efectos sobre la migración en los fibroblastos cardiacos inducida por isoproterenol. Por otro lado, BK e isoproterenol por separado disminuyen la síntesis de colágeno; sin embargo, la administración conjunta de ISO+BK induce una mayor disminución de la síntesis. El efecto sinérgico de BK sobre el aumento de AMPc inducido por ISO potencia la inhibición de la diferenciación celular de fibroblasto a miofibroblasto estimulada por TGF-β1. Finalmente, determinamos que el efecto sinérgico de BK sobre la señalización de ISO es gatillada vía Gq-PLC-CaMK-II, conduciendo al aumento sinérgico en la producción de AMPc / Cardiac fibroblasts are the major non-contractile cells present in the myocardium. Its main function is to preserve the structure and the proper functioning of the heart, which is done through the synthesis and secretion of extracellular matrix components. After tissue injury, cardiac fibroblasts are key cells of the reparative process and healing. If this process is exacerbated cardiac fibrosis is reached, stiffening the heart and increasing the risk of arrhythmia, altering strongly the heart function In this regard, it has been shown that the increase of cAMP, helps to reduce the degree of cardiac fibrosis, by regulating processes such as adhesion, migration, collagen secretion and cell differentiation. In cardiac fibroblasts has been reported that isoproterenol, an agonist of β-adrenergic receptors, acts via Gs and stimulates the production of cAMP. On the other hand, BK an agonist of B2 kinin receptor, activates its receptor Gq, and by itself does not alter cAMP production. However, in combination with isoproterenol enhances the adrenergic response, increasing the levels of cAMP in a synergistic manner, in relation to activation by isoproterenol alone. The aim of this work was to study in vitro, in cultured of neonatal rat cardiac fibroblasts, the cross-talk between signaling pathways Gs-Gq and determine if the increase in cAMP modulates adhesion, migration, collagen secretion and differentiation in cardiac fibroblasts. BK has a synergistic effect on cAMP levels increased by isoproterenol. Similarly, BK enhances the adhesion of cardiac fibroblasts stimulated by isoproterenol, but BK has no effect on migration in cardiac fibroblasts induced by isoproterenol. Furthermore, BK and isoproterenol separately decrease collagen synthesis, but the co-administration of ISO+ BK induces a greater decrease in the synthesis. The synergistic effect of BK in the cAMP levels induced by ISO, showed inhibit the cellular differentiation of fibroblasts into myofibroblasts stimulated by TGF-β1 Finally, we determined that the synergistic effect of BK on ISO signaling is triggered via Gq-PLC-CaMK-II, leading to the synergistic increase in cAMP production

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado académico de Doctora en Farmacología / El estrés está definido como cualquier estímulo capaz de alterar la homeostasis del organismo, es una reacción fisiológica necesaria para la supervivencia y es la forma que posee el organismo para afrontar una situación agobiante y/o amenazadora. Frente a una situación de estrés, el organismo reacciona generando una respuesta simpaticomimética conocida como “respuesta de pelea o huida”, produciendo un aumento en la liberación de noradrenalina. Todos los organismos vivos son moldeables durante el embarazo y sus primeros momentos de vida. Esto les permite adaptarse al medio ambiente que los rodea sin regirse exclusivamente por su carga genética. El periodo de gestación es una etapa particularmente sensible a situaciones de estrés, pudiéndose generar modificaciones en el ambiente fetal lo que a su vez puede producir una adaptación permanente en el desarrollo postnatal, proceso conocido como programación fetal. Se han encontrado estrechas relaciones entre diversas enfermedades y el ambiente fetal, entre ellas encontramos relaciones entre bajo peso al nacer con un aumento en las muertes por enfermedades coronarias, intolerancia a la insulina y aumento en la presión arterial en la adultez. Nuestro objetivo fue determinar el efecto producido por tratamientos de estrés por frío crónico (4°C/3h/día) aplicado durante todo el periodo de gestación en ratas Sprague-Dawley sobre los transportadores de noradrenalina placentarios, los receptores β-adrenérgicos cardíacos y los cambios sobre la función cardiovascular y metabólica en la descendencia hembra. Se observó que el tratamiento de estrés por frío crónico generó un aumento en las concentraciones de noradrenalina y corticosterona en el plasma de las ratas gestantes junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. No se observaron cambios en el peso de las ratas gestantes, sin embargo se encontró un aumento en el peso de las crías estresadas durante la etapa prenatal. Además, se observó que en crías hembras de 20 días se generó un aumento en la razón de los receptores β1/β2-adrenérgicos cardíacos y que a los 60 días se registra una disminución en la afinidad de estos receptores y un aumento en las áreas y perímetros de los cardiomiocitos junto con un aumento en el peso de sus corazones. Con el objetivo de determinar si el aumento en área y perímetro de los cardiomiocitos afecta la funcionalidad del corazón se sometió a las crías hembras adultas a una sobrecarga adrenérgica crónica (administración de isoproterenol subcutáneo, 125 μg/kg de peso/10 días), encontrándose un aumento en la presencia de extrasístoles lo que generó un 40% de mortalidad en las crías hembras. Finalmente, para determinar los posibles efectos metabólicos del estrés prenatal se realizó un test de tolerancia a la glucosa (administración oral de 2 g de glucosa/kg de peso de una solución al 40%) encontrando resistencia a la insulina en las crías hembras adultas. Tomando en cuenta todo lo anteriormente mencionado, concluimos que la exposición a una situación crónica de estrés por frío durante el periodo de gestación produjo un aumento en las concentraciones de noradrenalina plasmática materna junto con una disminución en la funcionalidad de los transportadores de noradrenalina placentarios. Esto programaría a estos nuevos sujetos, causando una mayor sensibilidad frente a una sobrecarga adrenérgica crónica (40% muerte) junto con presencia de resistencia a la insulina en las crías hembras adultas / Stress is defined as any stimulus capable of altering the homeostasis of the organism, it is a physiological reaction necessary for survival and is the way that has the organism to face a threatening and/or overwhelming situation. Faced with a stressful situation, the organism reacts by generating a sympathomimetic response known as the “fight or flight response”, resulting in an increase in norepinephrine release. All living organisms are moldable during pregnancy and their first moments of life. This allows them to adapt to the environment around them not bound exclusively to their genetic charge. The gestation period is particularly sensitive to a stress situation capable of modifying the fetal environment, which can cause a permanent adaptation on the postnatal development; this is known as fetal programming. Close relationships between various diseases and fetal environment has been found. Among them there are relations between low birth weight with an increase in deaths from coronary diseases, insulin intolerance and increase in blood pressure in adulthood. Our objective was to determine the effect produced by chronic cold stress treatments (4°C/3h/day) applied during the entire period of pregnancy in Sprague-Dawley rats on placental norepinephrine transporters, cardiac β-adrenergic receptors and changes on cardiovascular and metabolic function in the female offspring. An increase in norepinephrine and corticosterone concentrations on plasma of stressed pregnant rats with a decrease in the functionality of placental norepinephrine transporters was observed. No changes were observed in the weight of pregnant rats, however an increase in the weight of pups was found prenatally. In addition, females of 20 days old of the stressed progeny, presented an increase in the ratio of the cardiac β1/β2-adrenergic receptors, and at 60 days old, a decrease in the affinity of these receptors was apparent. An increase in the cardiac cells areas and perimeters along with an increase in the weight of their hearts was also found at 60 days old. To determine what was happening with the functionality of these hearts, we exposed the adult females to a chronic adrenergic overload (administration of a daily subcutaneous isoproterenol injection with 125 μg/kg of weight/10 days). The chronic overload of adrenergic stimulation provoked an increase in the presence of premature beats causing death to 40% of the females pups. To determine possible programming of metabolic effects of prenatal stress, a tolerance glucose test (oral administration of 2g of glucose/kg of weight of a 40% solution) was performed. Results demonstrated that gestational stress programmed a metabolic disturbance that was expressed in the adult progeny, founding insulin resistance in adult females. Therefore, the increase in maternal plasma norepinephrine concentration provoked by the exposure to chronic cold stress during all gestation period caused a decrease in the functionality of the placental norepinephrine transporters. This would be the cause to program the fetus for an increased sensitivity to a chronic adrenergic overload (40% of death) together with the presence of insulin resistance in adult females / Conicyt; Fondecyt

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Existen evidencias que el propanolol inhibe la potenciación sináptica de largo plazo en rebanadas de hipocampo, sugiriendo que este compuesto deprime la transducción de señales dependiente de la activación del receptor -adrenérgico. En la corteza occipital, se ha descrito también el fenómeno de la potenciación sináptica de largo plazo, caracterizado por un aumento progresivo en la actividad de las neuronas piramidales, el cual puede ser evocado por estimulación de alta frecuencia de la fibra neuronal. la potenciación sináptica occipital, al igual que en el hipocampo, depende principalmente de receptores NMDA, pero además se ha visto una importante acción de los receptores -adrenérgicos. Se estudió el efecto de la administración intraperitoneal de propanolol en la potenciación de largo plazo occipital de la rata. Ratas albinas de la cepa Sprague-Dawley de 150-300 g. fueron anestesiadas con uretano (1.5 g/Kg de peso vivo). La estimulación consistió en pulsos simples de onda cuadrada de 100 s de duración, 0.2 Hz y de intensidad creciente (entre 50 y 200 A), con el objeto de determinar la máxima amplitud asintótica de las respuestas evocadas contralaterales. La potenciación de largo plazo se indujo aplicando un tren tetanizante de ondas rectangulares monofásicas de 500 ms de duración, 312 Hz, y una intensidad 50% mayor que la necesaria para obtener respuestas basales. Los resultados muestran que propanolol (1, 25; 2,5 y 5,0 mg/kg i.p.), indujo una inhibición dosis-dependiente de la potenciación sináptica de largo plazo. Esta observación indica que propanolol es capaz de interferir a nivel cortical con el componente noradrenérgico mediado por receptores beta en la potenciación de largo plazo. Dado que la potenciación sináptica es el principal fenómeno que sustenta los mecanismos centrales involucrados en el desarrollo de la memoria y el aprendizaje, el presente estudio puede contribuir a futuras aplicaciones clínicas, en situaciones de estrés crónico y/o malnutrición perinatal donde ocurren cambios en la disponibilidad de noradrenalina central y/o en la densidad de sus receptores, en donde la activación de los receptores -adrenérgicos podría ser insuficiente comprometiendo procesos de memoria y aprendizaje. En este sentido, tal vez parte de los esfuerzos terapéuticos futuros para el tratamiento de estos desórdenes deberían estar dirigidos hacia la corrección farmacológica de los niveles endógenos de noradrenalina central con el objeto de paliar los déficits de aprendizaje y memoria que acompañan a estos cuadros crónicos

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardiacos son células que cumplen un rol fundamental en el mantenimiento de la homeostasis de la matriz extracelular del corazón. Luego de un daño al miocardio, además, participan activamente del remodelado cardiaco como tal o diferenciándose a miofibroblasto, un fenotipo celular que presenta características que lo hacen apto para funciones de cicatrización. Se ha observado que luego de un daño al miocardio, el corazón está expuesto a un mayor tono adrenérgico con la finalidad de compensar la disfunción adquirida por la injuria del tejido. Estudios de nuestro laboratorio han demostrado que la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol induce autofagia en fibroblastos cardiacos de rata adulta, un proceso degradativo que se ha reportado capaz de perder su equilibrio en diversas patologías cardiovasculares. Por esto, se vuelve interesante determinar si estos mismos estímulos son capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos, células que aparecen sólo cuando hay daño al miocardio. Los resultados muestran que tanto fibroblastos como miofibroblastos cardiacos presentan receptores adrenérgicos sólo del subtipo β2. Miofibroblastos cardiacos presentaron mayor número de receptores β2-adrenérgicos y con mayor afinidad por sus ligandos que fibroblastos cardiacos. En ambos fenotipos celulares los receptores mencionados se encuentran funcionales. En cuanto a la autofagia, los estímulos clásicos inductores de autofagia (rapamicina y/o privación de nutrientes) y la estimulación β2-adrenérgica por Isoproterenol inducen autofagia en fibroblastos. De modo distinto, estos inductores no fueron capaces de inducir autofagia en miofibroblastos cardiacos de rata adulta, aunque se encontró que en condiciones basales presentaban mayor nivel de autofagia que los fibroblastos. Los resultados demuestran que los miofibroblastos cardiacos son resistentes a la inducción de autofagia por estimulación β2-adrenérgica, lo que puede abrir una puerta para el entendimiento del rol de este proceso en estados patológicos del corazón.

Orientador: Rosana Almada Bassani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T18:24:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ElizangelaSouto_M.pdf: 5397962 bytes, checksum: a6952b7daf58ed6c84d6fb7eecc0d06f (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Importantes ajustes cardiovasculares dependentes de estimulação adrenérgica do coração ocorrem no período perinatal. O objetivo deste trabalho foi estudar a resposta cronotrópica a catecolaminas em ratos imaturos, com foco em mecanismos intrínsecos e extrínsecos à via de transdução ?-adrenérgica. Foi determinada a resposta cronotrópica a tiramina (TIR), isoproterenol (ISO), noradrenalina (NA), forskolin (FSK) e 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) em átrios direitos de ratos de 0-23 dias de idade e adultos. No mesmo tecido, foram quantificados os níveis de mRNA de diversas proteínas pela técnica de reação em cadeia de polimerase em tempo real (qRT-PCR). Os principais resultados foram: a) a resposta cronotrópica máxima (Rmax) a TIR e NA exógena mostrou-se deprimida em átrios de ratos de 0-2 dias, enquanto a sensibilidade aos agonistas reduziu-se com o amadurecimento; b) o bloqueio do transportador neuronal de catecolaminas por desipramina foi menos efetivo em causar desvio à esquerda na curva concentração-efeito nos átrios de animais imaturos, e aboliu as diferenças de sensibilidade (mas não de Rmax) à NA; c) a inibição do transportador extraneuronal de monoaminas não modificou o pD2 do ISO em átrios de animais imaturos, os níveis de mRNA para este transportador foram ~30% daqueles em adultos; d) apesar da redução da Rmax à NA em neonatos, não houve diferença na Rmax a ISO, FSK e IBMX entre as diferentes idades; e) o bloqueio de adrenoceptores ?2 com ICI118,551 reduziu Rmax e pD2 do ISO apenas nos átrios de ratos imaturos, indicando contribuição deste subtipo de receptores apenas nos primeiros dias após o nascimento; f) a expressão de adrenoceptores ?2, Gi, Gs e adenilato ciclase (isoforma 1) foi maior em átrios de animais imaturos, enquanto aquela de adrenoceptores ?1 foi semelhante em todos os grupos etários. Conclui-se que os componentes pós-receptor desta via de sinalização já estão presentes no neonato, embora tenha sido detectada aparente imaturidade no acoplamento de adrenoceptores ?1. Entretanto, foram identificados mecanismos compensatórios, tais como a participação de adrenoceptores ?2 e menor remoção neuronal e extraneuronal de catecolaminas. Palavras-chave: átrio direito, receptores adrenérgicos beta, catecolaminas, desenvolvimento pós-natal / Abstract: Important cardiovascular adjustments that depend on the adrenergic regulation of the cardiac function occur during the perinatal period. The goal of this work was to study the chronotropic responsiveness to catecholamines in immature rats, focusing on mechanisms intrinsic and extrinsic to the ?-adrenergic signaling pathway. The chronotropic response to tyramine (TYR), isoproterenol (ISO), norepinephrine (NE), forskolin (FSK), and 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) was determined in right atria isolated from 0-23 day-old and adults rats. In the same tissue, mRNA levels of relevant proteins were quantified by real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The main results were: a) the maximum chronotropic response (Rmax) to TYR and to exogenous NE were lower in rigth atria from 0-2day-old rats, while the sensitivity to the agonists decreased during development; b) inhibition of neuronal norepinephrine transporter by desipramine was less effective at shifting the concentration-effect curve to the left in immature animals, and abolished the differences in sensitivity (but not in Rmax) to NE. c) inhibition of the extraneuronal monoamine transporter did not changed the ISO pD2 in atria from immature animals, in which the mRNA levels for this transporter were ~ 30% of those in adults; d) despite the lower Rmax to NE in neonates, the Rmax to ISO, FSK and IBMX was comparable among ages; e) ?2-adrenoceptor blockade with ICI118,551 reduced Rmax and ISO pD2 only in atria from immature rats, indicating contribution of this receptor subtype only in the first days after birth; f) ?2-adrenoceptor, Gi, Gs and adenylate cyclase (isoform 1) transcript levels were greater in the atria of immature animals, while that of ?1-adrenoceptor was similar in all age groups. In conclusion, post-receptor components of this signaling pathway seem to already be mature in newborns, although an apparent immaturity in ?1-adrenoceptor coupling was detected. However, compensatory mechanisms were identified, such as the participation of ?2-adrenoceptor and weaker neuronal and extraneuronal catecholamine removal. Keywords: right atria, ?-adrenoceptor, catecholamines, postnatal development / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T15:51:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferraz_KarinaCoutinho_D.pdf: 4092717 bytes, checksum: 304af959216055cd75432ac292abc300 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Evidências clínicas e experimentais indicam o envolvimento de metaloproteinases da matriz extracelular (MMPs) na patogênese de diversas doenças, incluindo as doenças cardiovasculares. Particularmente, alterações na atividade da MMP-2 parecem desempenhar um importante papel na hipertensão, na insuficiência cardíaca e em outras alterações do sistema cardiovascular. Diversos estudos mostram vários alvos não relacionados à matriz extracelular para a MMP-2, incluindo proteínas intracelulares e mediadores vasoativos. Adicionalmente, diversos trabalhos indicam o envolvimento desta enzima na clivagem proteolítica de receptores ?1- e ?2-adrenérgicos. Embora alguns estudos tenham sugerido que a MMP-2 possa afetar o tônus vascular e prejudicar a função dos ?-adrenoreceptores, nenhum estudo prévio examinou os efeitos hemodinâmicos agudos desta enzima. Nós verificamos os efeitos da MMP-2 recombinante humana (rhMMP-2), administrada por via intravenosa (i.v.), a carneiros anestesiados sob condições basais e durante estimulação ?-adrenérgica com dobutamina. Vinte e seis carneiros machos anestesiados foram utilizados em dois protocolos experimentais. Primeiramente, rhMMP-2 (220 ng.kg-1.min-1 durante 60 min) ou salina foi infundida e nenhuma alteração hemodinâmica foi encontrada. No segundo protocolo, infundiu-se dobutamina (5 ?g.kg-1.min-1, i.v., durante 180 min) ou salina em carneiros que haviam recebido a mesma infusão descrita acima de rhMMP-2 ou salina precedida pelo tratamento com doxiciclina (10 mg.kg-1, i.v., durante 15 min) ou salina. Os níveis plasmáticos e cardíacos de MMP-2 foram avaliados por zimografia e a atividade gelatinolítica foi analisada por espectrofluorimetria. Nós observamos que, enquanto a infusão de rhMMP-2 não aumentou os níveis plasmáticos e cardíacos de MMP-2, produziu um aumento na atividade gelatinolítica do coração, e a doxiciclina preveniu este efeito. A dobutamina reduziu o índice de resistência vascular sistêmico (IRVS) e aumentou o índice cardíaco (IC) e a dP/dtmax no ventrículo esquerdo. Entretanto, a co-infusão de rhMMP-2 e dobutamina foi associada com uma menor redução no IRVS e com menores aumentos no IC e na dP/dtmax induzidos pela dobutamina. O pré-tratamento com doxiciclina impediu estas alterações induzidas pela rhMMP-2 na resposta à dobutamina. Adicionalmente, verificou-se que a rhMMP-2 reduziu a formação de AMP cíclico em cardiomiócitos e que os inibidores de MMPs doxiciclina e ONO-4817 impediram esta redução. Nossos resultados mostram que a rhMMP-2, sob condições basais, não exerce efeitos hemodinâmicos em carneiros. Entretanto, a rhMMP-2, sob estimulação cardíaca, prejudica a resposta cardiovascular induzida pela ativação de receptores ?-adrenérgicos / Abstract: Experimental and clinical evidence indicate the involvement of matrix metalloproteinases (MMPs) in the pathogenesis of many disease conditions, including cardiovascular diseases. Particularly, imbalanced MMP-2 activity apparently plays a critical role in hypertension, heart failure and in other alterations of the cardiovascular system. Various studies show many targets unrelated to the extracellular matrix for MMP-2, including intracellular proteins and vasoactive mediators. Additionally, recent studies indicate the involvement of this enzyme in proteolytic cleavage of 'beta'1- and 'beta'2-adrenoreceptors. Although some studies have suggested that MMP-2 may affect the vascular tone and impair 'beta'-adrenoreceptor function, no previous study has examined the acute hemodynamic effects of this enzyme. We examined the effects of recombinant human MMP-2 (rhMMP-2) administered intravenously (i.v.) to anesthetized lambs at baseline conditions and during ?-adrenergic stimulation with dobutamine. Twenty-six anesthetized male lambs were used in two study protocols. Firstly, rhMMP-2 (220 ng.kg-1.min-1 over 60 min) or vehicle was infused and no significant hemodynamic changes were found. In the second protocol, we infused dobutamine (5 ug.kg-1.min-1, i.v., over 180 min) or saline in lambs that had received the same rhMMP-2 infusion preceded by treatment with doxycycline (10 mg.kg-1, i.v., during 15 min) or saline. Plasma and cardiac MMP-2 levels were assessed by gelatin zymography and gelatinolytic activity was assessed by spectrofluorimetry. We found that, while the infusion of rhMMP-2 did not increase plasma and cardiac MMP-2 levels, it increased cardiac gelatinolytic activity, and doxycycline blunted this effect. Dobutamine decreased systemic vascular resistance index (SVRI) and increased the cardiac index (CI) and left ventricular dP/dtmax. However, co-infusion of rhMMP-2 and dobutamine was associated with lower dobutamine-induced decrease in SVRI and with lower dobutamine-induced increase in CI and dP/dtmax. Pre-treatment with doxyxycline blunted rhMMP-2-induced changes in dobutamine responses. Additionally, we found that rhMMP-2 decreased cyclic AMP levels in cardiomyocytes and that tne inhibitors of MMPs doxyxycline and ONO-4817 prevented this reduction. Our findings show that rhMMP-2, at baseline conditions, exerts no major hemodynamic effects in lambs. However, rhMMP-2, during cardiac stimulation, impairs the responses elicited by activation of 'beta'-adrenoreceptors / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

Orientador: Cláudia Herrera Tambeli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:27:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Favaro-Moreira_NadiaCristina_D.pdf: 14440949 bytes, checksum: 19ac7e9f7196c13dfd756bd4150b1456 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Disfunção temporomandibular (DTM) é um termo coletivo que abrange uma série de problemas clínicos que envolvem os músculos mastigatórios e a articulação temporomandibular (ATM) e está comumente associada à inflamação. Apesar de medicamentos anti-inflamatórios não esteróides (AINEs) serem frequentemente utilizados no controle de dor inflamatória, sabe-se que a dor inflamatória possui um componente simpático que pode predominar em casos menos responsivos a tratamentos com AINEs. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar se os hormônios gonadais modulam a resposta antinociceptiva ao bloqueio dos ?-adrenoreceptores (ARs) na ATM de ratos, (ii) avaliar se um e três dias de tratamento com o ?-bloqueador não seletivo para AR ?1 e ?2 nadolol reduzem a dor em pacientes com DTM significativamente mais do que o placebo, (iii) avaliar se as mulheres experimentam relativamente maior benefício com o tratamento com nadolol que os homens dependendo do seu estado hormonal, e (iv ) comparar o efeito do nadolol com o efeito do ibuprofeno. O primeiro objetivo foi desenvolvido em ratos machos e fêmeas, intactos ou gonadectomizados (com ou sem reposição hormonal) através da coadministração de formalina e antagonista específico para AR ?1 , ?2 e ?3 na região da ATM. O comportamento nocieptive foi quantificado e utilizado para a análise estatística. Para o segundo objetivo Nadolol (40 mg/dia), ibuprofeno (400 mg/dia) ou placebo foi administrado em 27 mulheres que não usam contraceptivo oral (CO), 28 mulheres usando CO e 29 homens, que estavam de acordo com os Critérios Diagnósticos para Pesquisa (Research Diagnostic Chriteria) para DTM. Eles completaram um estudo cruzado, aleatorizado, duplo-cego e com controle placebo. As mulheres participaram durante três meses (durante a fase menstrual e durante a fase peri-ovulatória em mulheres que não usam CO, e durante a fase menstrual e durante a fase de uso do CO em mulheres usando CO), em um total de 6 etapas de análise ( 2 por mês), e homens participaram durante um mês com três etapas de análise com um período de 6 dias entre cada etapa. Cada etapa consistiu de uma avaliação de basal e duas avaliações durante o tratamento, uma no primeiro e o outra no terceiro dia de tratamento. A dor foi avaliada por meio da utilização da escala visual analógica (VAS) e as comparações foram feitas através do pré-tratamento (basal), o primeiro e o terceiro dia de intervenção (pós-tratamento). O bloqueio dos ARs ? reduz significativamente a nocicepção da ATM em ratos machos e fêmeas, mas as fêmeas são mais sensíveis. Os hormônios gonadais reduziram a resposta ao bloqueio de ARs ? na ATM de machos e fêmeas. No estudo em humanos um e três dias de tratamento com nadolol ou ibuprofeno produz uma analgesia em mulheres e homens significativamente maior que placebo, mas as mulheres são mais sensíveis independente do estado hormonal. Em resumo, estes dados demonstram que os hormonios sexuais podem modular o efeito analgésico de bloqueadores de ARs ? dependendo dos níveis séricos dos hormonios gonadais, do subtipo de ARs ? ativado e da dose de droga administrada. A maior eficácia no tratamento da dor em mulheres é clinicamente relevante uma vez que a DTM é mais prevalente e mais severa em mulheres do que em homens / Abstract: Temporomandibular disorder (TMD) is a collective term embracing a number of clinical problems that involve the masticatory muscles, and the temporomandibular joint (TMJ), commonly associated with inflammation. Despite anti-inflammatory drugs (NSAIDs) are frequently used in the control of inflammatory pain, it is well known that inflammatory pain has a sympathetic component that might predominate in the cases less responsive to NSAIDs treatments. Therefore, the aims of this study were: (i) to evaluate whether gonadal hormones modulate the antinociceptive responsiveness to the blockade of ?-adrenoreceptors (ARs) in the TMJ of rats, (ii) to evaluate whether one and three days of treatment with the nonselective ?1 and ?2-AR antagonist nadolol would reduce clinical pain symptoms in TMD patients significantly more than placebo, (iii) to evaluate whether women would experience relatively greater benefit from nadolol than men depending on their hormonal status, and (iv) compared the effect of nadolol with the effect of ibuprofen. The first aim was developed in male and female rats, intact or gonadectomized (with or without hormone replacement), by coadministration of formalin and specific antagonist for ?1, ?2 and ?3-ARs in the TMJ region. The nocieptive behavior was quantified and used for estatistical analysis. For the second aim Nadolol (40 mg/day), ibuprofen (400 mg/day) or placebo was administrated in 27 women not using oral contraceptive (OC), 28 women using OC, and 29 men which met the Research Diagnostic Criteria for TMD. They completed a randomized, crossover, double¿blind, placebo controlled study. Women participated for three months (during menstrual phase and during peri-ovulatory phase in women not using OC, and during menstrual phase and during OC using phase in women using OC) in a total of 6 stages of analysis (2 per month), and men participated for one month whith three stages of analysis and 6 days of wash out. Each stage consisted of a baseline evaluation and two evaluations during treatment, one on the first and the other on the third day of treatment. Clinical pain ratings were obtained by Visual Analog Scale (VAS) and comparisons were made across the pre-treatment (baseline), the first and the third day of intervention (post-treatment). Blockade of ?-ARs significantly reduce the TMJ nociception in male and female rats, but females are more responsive. The gonadal hormones reduce the responsiveness to the blockade of ?-ARs in the TMJ of males and females rats. In the human study one and three days of treatment with nadolol or ibuprofen produces analgesia in TMD women and men significantly more than placebo, but women are more responsive independent of their hormonal status. In summary, these data demonstrate that gonadal hormones can modulate the analgesic effect of ?-ARs blockers depending on the gonadal hormones serum levels, on the ?-ARs activated subtype and on the dose of drug administered. The greater treatment efficacy in women is of clinical relevance since TMD is more prevalent and severe in women than in men / Doutorado / Fisiologia Oral / Doutora em Odontologia