Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:43:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NadruzJunior_Wilson_D.pdf: 7058533 bytes, checksum: 4c5de2a81e69e83274d6104bfd0f8293 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: A expressão precoce dos genes de expressão imediata constitui uma característica fundamental do miocárdio durante o desenvolvimento de hipertrofia cardíaca. O gene de expressão imediata c-jun codifica um fator de transcrição que tem sido apontado como um importante regulador da resposta hipertrófica em miócitos cardíacos. Neste estudo, investigamos se a sobrecarga pressora aguda ou o tratamento com fenileftina estimulou a transcrição de c-jun em miócitos cardíacos e avaliamos a importância dos fatores de transcrição da família MEF2 neste processo. Experimentos de immunoblotting e imunohistoquímica demonstraram que MEF2 é bastante expresso no miocárdio de ratos e é localizado predominantemente no núcleo de miócitos cardíacos. Ensaios de "gel shift" de extratos nucleares revelaram um aumento significativo na afinidade de MEF2 pelo DNA após 1 e 2 horas de sobrecarga pressora. Demonstramos também que a sobrecarga pressora induziu a uma translocação nuclear progressiva e ativação de ERK5. Experimentos de co-imunoprecipitação e de atividade quinase in vitro indicaram que a atividade da ERK5 foi paralela a uma maior associação entre ERK5/MEF2 e a uma maior capacidade da ERK5 fosforilar MEF2 in vitro. Ensaios de gene repórter utilizando transfecção in vivo de plasmídeos contendo o promotor do c-jun demonstraram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento consistente na transcrição de c-jun no miocárdio de ratos. Ao se utilizar plasmídeos contendo o promotor do c-jun mutado no sítio MEF2, observamos que não houve ativação da transcrição do c-jun em resposta à sobrecarga hemodinâmica. A mutação do sítio MEF2 também aboliu a ativação do promotor do c-jun em reposta ao tratamento com fenileftina em miócitos cardíacos ventriculares de ratos neonatos. Além disto, demonstramos que a transfecção dos miócitos ventriculares de ratos neonatos com um oligodeoxinucleotídeo ERK5-antisenso inibiu a ativação do promotor do c-jun em resposta à fenileftina. Estes achados identificam MEF2 como um regulador potencial da transcrição do c-jun e sugerem que ERK5 pode ser um importante mediador da ativação do promotor do c-jun e de MEF2 em resposta a estímulos hipertróficos em miócitos cardíacos. Além de estudar a regulação da expressão de c-Jun, também investigamos a sua ativação no miocárdio submetido à sobrecarga pressora aguda. Experimentos de immunoblotting utilizando subfrações celulares e estudos de imunohistoquímica demonstraram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento concomitante na expressão de c-Jun e na fosforilação na serina-63 no núcleo de miócitos cardíacos. Observamos que a fosforilação de c-Jun foi paralela à fosforilação e translocação de JNKl para o núcleo de miócitos cardíacos. Além disto, ensaios de "gel shift" revelaram que a sobrecarga pressora induziu a um aumento na atividade de ligação de c-Jun com o DNA, que se correlacionou com o aumento de sua expressão. Estes dados demonstram que c-Jun é regulado por uma combinação de expressão e fosforilação e indicam que este sinergismo amplifica a ativação de c-Jun no miocárdio de ratos submetido à sobrecarga pressora / Abstract: The early expression of immediate early genes is a fundamental feature of myocardial hypertrophy. The immediate early gene c-jun codifies a transcription factor that has been assigned to be an important regulator of the hypertrophic response in cardiac myocytes. In the present study we investigated whether pressure overload or phenylephrine treatment stimulated MEF2-dependent transcriptional activation of c-jun in cardiac myocytes. Westem blotting and immunohistochemistry analysis of rat myocardium demonstrated that MEF2 is high1y expressed in the rat heart and is predominantly located at nuc1ei of cardiac myocytes. Gel shift assays of myocardial nuclear extracts revealed a consistent DNA binding activation of MEF2 after 1 and 2 hours of pressure overload. We further show that pressure overload induced a progressive nuclear translocation and activation of ERK.5. Co-immunoprecipitation and in vitro kinase assays indicated that the activation of ERK.5 was paralleled by increased association ERK.5/MEF2 and by enhanced ability of ERK.5 to phosphorylate MEF2. Experiments with in vivo transfection of left ventric1e with c-jun promoter reporter gene showed that pressure overload induced a consistent increase of c-jun transcriptional activity in the rat myocardium. Rendering the MEF2 site of the c-jun plasmid inactive by mutation abolished the load-induced activation of c-jun promoter reporter gene. Mutation of MEF2 site also abolished the phenylephrine- induced c-jun promoter activation in neonatal rat ventricular myocytes (NRVM). In addition, we demonstrated that NRVM transfection with ERK.5 antisense oligodeoxynuc1eotide inhibited the phenylephrine-induced c-jun promoter activation. These findings identify MEF2 as a potential regulator of c-jun transactivation and suggest that ERK5 might be an important mediator of MEF2 and c-jun promoter activation in response to hypertrophic stimuli in cardiac myocytes. In addition to studying the regulation of c-Jun expression, we also investigated the activation of this transcription factor in the overloaded myocardium. Immunoblotting of subcellular ftactions and immunohistochemistry assays demonstrated that pressure overload induced a parallel increase in c-Jun expression and in serine-63-phosphorylation in nuc1ei cardiac myocytes nuc1ei. We also observed that load-induced c-Jun phosphorylation was concomitant to JNKl phosphorylation and translocation to cardiac myocytes nuclei. M;)reover, gel shift assays revealed that pressure overload promoted an increase in c-Jun DNA-binding activity, which correlated with the increase in c-Jun expression. These results show that c-Jun is regulated by a combination of increased expression and phosphorylation and indicate that the synergism of these effects might act as a mechanism to amplify c-Jun activity in the overloaded myocardium / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T00:19:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Scopacasa_BeatrizSequeira_M.pdf: 6864268 bytes, checksum: aeb2004ee876f703f17a145244fc7034 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: O presente estudo teve como objetivos a avaliação dos efeitos da colchicina (inibidor da polimerização da tubulina) sobre o crescimento hipertrófico e a função cardíaca basal e durante aumentos progressivos de resistência periférica com fenilefrina, em ratos submetidos à constrição da crossa da aorta. Os ratos submetidos à sobrecarga de pressão por constrição da crassa da aorta (CoAo) ou cirurgia fictícia (SO) foram divididos em grupos tratados com colchicina (T-0.4 mg/kg/dia i.p.) ou salina e avaliados após o 2'% 6o e 15° dias da cirurgia. Após pesagem dos corações, verificou-se aumento de 24 e 30% da razão massa do ventrículo esquerdo/massa do ventrículo direito nos ratos CoAo era relação aos ratos KG quando avaliados no 6° e 15° dias após a cirurgia.Já os ratos CoAo-T, nesses mesmos períodos, apresentaram aumentos de 15 e 15% em relação aos ratos SO-T. Da análise dessas diferenças estimamos que o tratamento com colchicina atenuou o crescimento hipertrófico, avaliado no 6° e 15° dias após a cirurgia, do ventrículo esquerdo em ratos coarctados em 38 e 50%. respectivamente. Resultados das análises planimétrica e morfométrica do ventrículo esquerdo mostraram que a CoAo provocou aumento da espessura da parede ventricular esquerda e aumento no diâmetro dos miócitos, enquanto o tratamento com colchicina atenuou significativamente estas alterações nos ratos CoAo-T. Não foram detectadas dilatações do ventrículo esquerdo nos grupos SO-T, CoAo-T e CoAo. Os ratos CoAo e CoAo-T apresentaram valores de pressão sistólica do ventrículo esquerdo (PSVE) semelhantes. Não houve diferença significativa entre os dois grupos de ratos nos valores do gradiente sistólico transcoarctaçâo (GS), indicando o mesmo grau de sobrecarga pressora nos dois grupos. Os ratos SO e SO-T apresentaram valores semelhantes de FSVE. A pressão diastólica do ventrículo esquerdo (PDVE) permaneceu em -7 mmHg em todos os grupos no 2° e 6° dia após a cirurgia. No 15° dia, ratos CoAo e CoAo-T apresentaram elevação da PDVE para 10 e 11 mmHg, respectivamente. Grupos diferentes de ratos foram preparados para avaliação do comportamento das pressões do ventrículo esquerdo durante infusões de doses crescentes de fenilefrina. Os ratos de todos os grupos apresentaram respostas semelhantes de aumentos de PSVE e PDVE não importando o nível das mesmas na situação basal, no 2°, 6° e 15° dias apôs a cirurgia. Estes resultados indicam que a ftinção ventricular tanto basal como durante sobrecargas agudas de pressão dos ratos SO-T, CoAo-T e CoAo estava preservada. Foram realizados experimentos com separação das frações de tubulina polimerizada e não-polimerizada e posterior separação e identificação da ß-tubulina através de Western Blot. Observamos que a CoAo produz aumento de cerca de 2.5 vezes na quantidade detectada de tubulina polimerizada e que o tratamento com colchicúia aboliu este aumento nos animais com constrição da aorta. Nossos resultados permitem a conclusão de que o tratamento com colchicina atenuou o crescimento hjpertrófico do miocárdio de ratos submetidos à sobrecarga pressora por constrição da crassa da aorta, sem, entretanto, causar disfunção cardíaca tanto basal como em situação de aumento progressivo de resistência periférica. De maneira geral, os resultados de nosso estudo permitem afirmar que a integridade funcional dos microtúbulos é um pré-requisito para o crescimento hipertrófico do miocárdio induzido por sobrecarga pressora. Por outro lado, a preservação da função na ausência de hipertrofia compensatória sugere que a ruptura da integridade dos microtúbulos favorece a ativação de mecanismo que melhora a eficiência contrátil do miocárdio e/ou impede sua deterioração funcional / Abstract: To determine whether the inhibition of microtubule integrity in vivo by colchicine could attenuate the development of cardiac hypertrophy, we studied four groups of rats: 1. Transverse aorta constriction treated with colchicine - TAoC-T; 2. Transverse aorta constriction treated with saline - TaoC: 3. Sham operated rats treated with colchicine SO-T; 4, Sham operated rats treated with saline - SO. Six week old rats were daily administered colchicine (0.4 mg/Kg/day) or saline via intraperitoneal injection for variable period that ranged 2 to 15 days alter the surgery. TAoC and SO rais. showed similar body weight gain along the period that followed the surgery. Colchicine treatment retarded the body weight gain of both SO-T and TAoC-T rats. These animals lost weight from the beginning of colchicine treatment up to the 6th day after the surgery. After this period there was a partial recover of body weight gain in colchicine treated rats. LV and RV mass evaluated at 2th. 6 th and 15 th post-operative days paralleled the changes in body mass in SO and SO-T rats. Thus, the ratio between LV and RV mass and body mass remained stable in these rats over the period of this study. In addition, the ratio between LV and RV mass i, LVM/RVM) remained stable at --3.5 in these rats. Because, this index is not influenced by changes in body mass, it was preferred to estimate the effect of pressure overload in the LV mass gain in rats that underwent TAoC. In untreated rats. TAoC increased this index by 24% (to 4.2) and 30% (to 4.3) al 6 th and 15 th after the surgery, respectively, compared with SO rats. In contrast. TAoC-T rats showed no change in the LVM/RVM, (3.9) along the experimental period. As expected, TAoC induced a progressive increase in LV wall thickness (LVWT). Compared to the values of the 2nd post-operative day the LVWt of TAoC rats increased by 33% and 72%, at the 6"' and 15Ib day after the surgery, respectively. However, no significant change was observed m LVWTf SO, SO-T and TAoC-T rats. TAoC caused a progressive increase the ratio LVWT/LVD LVWT/LVd. characterizing a concentric hypertrophy. Otherwise. TAoC-T and SO-T rats showed patterns indicating concentric remodeling.Stereological analysis of myocardial section indicated that TAoC rats increased the diameter of single cardiac, myocytes progressively along the experimental period.The diameter of the cardiac myocytes in the remaining groups of rats did not change along the experimental period. Stable systolic gradients of 45 mmHg between the left ventricle and abdominal aorta were seen in both, TAoC and TAoC-T rats. Left ventricular peak systolic pressures (LVSP) were also comparable in these rats. Left ventricular end diastolic pressure (LVEDP) increased from ~7 mmHg at the 2nd and 6* day to 11 mmHg in T'AoC and TAoC-T rats. Increasing doses of phenylephrine increased LVSP and LVEDP in all groups of rats. Because the basal pressures and the responses to phenylphrine of TAoC and TAoC-T were higher than that of SO and SO-T rats, we analyzed the pressure responses to phenylephrine of the various groups by comparing the slopes of the regression line for the relationship between the maximal changes of LVSP and their respective LVEDP- No difference in this slope was observed among the various groups. Thus, these results indicated the preservation of cardiac pumping function in CO-T, TAoC and TAoC-T rats.Treatment with colchicine consistently reduced the polymerized fraction of tubulin in the myocardium of both sham-operated and aortic constricted rats, while TAoC-untreated rats showed a consistent increase in polymerized fraction, compared with sham-operated treated and untreated and TAoC-treated rats. Thus the inhibition of microtubule polymerization attenuated the development of cardiac hypertrophy in pressure overloaded rat heart, but did not affect the cardiac function / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Resumo não disponível

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Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T06:22:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Theizen_ThaisHoltz_M.pdf: 5129139 bytes, checksum: 63a638522984d7d9b6474a1cd25b1193 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Os mecanismos responsáveis pela transdução dos estímulos mecânicos em sinais bioquímicos no músculo cardíaco não estão totalmente esclarecidos. Evidências experimentais demonstram uma participação importante de elementos do citoesqueleto sarcomérico e extra-sarcomérico na transdução dos sinais mecânicos em bioquímicos nos miócitos cardíacos. Presume-se que a participação destas estruturas na transdução mecanobioquímica se faça através de moléculas sensíveis à tensão ou estiramento provocados pelo estímulo mecânico nas proteínas do citoesqueleto. Evidências experimentais obtidas em células em cultura, bem como em miócitos cardíacos indicam que a Fak apresenta diversas características de molécula sinalizadora de estímulos mecânicos. O príncipal objetivo do presente estudo foi investigar a expressão e atividade da quinase de adesão focal (Fak) em miocárdio de camundongos que apresentam mutação para o gene da distrofina (MDX). Resultados obtidos por immunobloting demonstraram aumento da fosforilação basal da Fak (cerca de 3 vezes) em animais MDX sem constrição da aorta (CoAo) (MDX controle), quando comparados a camundongos Swiss não submetidos a CoAo (Swiss controle). Por outro lado, não observamos aumento da atividade da Fak após CoAo em animais MDX, mas foi observada fosforilação da Fak em camundongos Swiss submetidos a CoAo. Resultados obtidos através de experimentos de imunofluorescência e posterior avaliação em microscopia confocal a laser demonstraram distribuição regular da Fak, acompanhando o padrão sarcomérico de estriação...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: Mechanisms involved in the transduction of mechanical stimuli into biochemical signals in the myocardium are not fully understood. Experimental evidences suggested an important role of the sarcomeric cytoskeleton and extra-sarcomeric in transduction of mechanical stimuli into biochemical signals in the cardiomyocytes. Presumably, these structures participate in the mechano-biochemical signal transduction through proteins located in the cytoskeleton responsive to tension, induced by mechanical stimuli. Recent data have been suggested that Focal adhesion molecule (Fak) could be a molecule involved in the transduction of the mechanical stimuli. The aim of the present study is to investigate the activation and expression of Fak in the myocardium of dystrophin-deficient mdx mice (MDX). Westem blot studies demonstrated an increase in the Fak basal phosphorilation (approximately 3 times) in the MDX mice submitted to transversal aortic constriction (TAC), when compared to swiss mice not submitted to TAC...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations / Mestrado / Mestre em Clinica Medica

Orientador: Eros Antonio de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-29T00:53:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Palhares_LucianaCampanatti_M.pdf: 999057 bytes, checksum: 4cf4ac78ee5c2affa0bc758ab16e2998 (MD5) Previous issue date: 2001 / Resumo: A oscilação oral de alta freqüência é considerada que tenha um efeito terapêutico dentro da fisioterapia respiratória. Essa oscilação é produzida nos pulmões, através de um aparelho chamado Flütter VRP1, que pode ser utilizado como conduta fisioterapêutica, para promover a desobstrução dos brônquios, facilitando a higiene pulmonar. Com o objetivo de estudar o comportamento do pico de fluxo expiratório, nos doentes no período pós-operatório de cirurgia cardíaca, estudaram-se 30 pacientes, utilizando a oscilação oral de alta freqüência (Flütter VRP1) e comparou-se com 30 pacientes, realizando a fisioterapia respiratória convencional. Foi medido o pico de fluxo expiratório, um dia antes da cirurgia e depois no terceiro, quarto e quinto dias do pós-operatório, tanto do grupo que utilizou o Flütter VRP1, como do grupo de fisioterapia convencional, o qual foi chamado de grupo controle, para efeito de comparação da evolução desses dados. O grupo que utilizou o Flütter VRP1 apresentou um aumento no pico de fluxo expiratório em relação ao grupo que realizou a fisioterapia convencional. Conclui-se que a oscilação oral de alta freqüência, proporcionada pelo aparelho Flütter VRP1, pode ser adicionada no tratamento da fisioterapia respiratória, no pós-operatório de cirurgia cardíaca / Abstract: Oral high frequency oscillation is considered a useful treatment in respiratory physiotherapy. This oscillation is produced in the lungs by a Flütter VRP1 device which can be used for bronchial disobstrucion, there by aiding pulmonary hygiene. The effect of this therapy on peak expiratory flow was examined in 60 postoperative cardiac surgery patients. Thirty of these patients were treated with oral high frequency oscillation Flütter VRP1 and where compared to 30 patients receiving conventional respiratory physiotherapy control group. The peak expiratory flow was measured one day before surgery and on the third, forth and fifth days, postsurgery in both groups. The results showed that patients who used Flütter VRP1 had an increased, peak expiratory flow compared to patients who received conventional physiotherapy. Thus, oral high frequency oscillation provided by the Flütter VRP1 device may be a useful auxiliary treatment in respiratory physiotherapy following cardiac surgery / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T17:10:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_RodrigoMiguel_M.pdf: 990546 bytes, checksum: 89707fd9af8f5fee21ed10ae08d243da (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: As doenças do miocárdio constituem umas das principais causas de morbidade e mortalidade da população em geral. Hoje, as modalidades farmacológicas disponíveis são eficientes no tratamento dos sintomas, no entanto possuem poucos efeitos sobre a progressão das cardiopatias. Estudos preliminares evidenciam que a interferência nas vias de sinalização celular relacionadas ao desenvolvimento das doenças cardiovasculares pode ser um alvo potencial para bloquear a progressão, bem como reverter o processo de deterioração funcional e estrutural característicos desta condição clínica. Atualmente sabe-se que as proteínas tirosina quinases estão amplamente envolvidas em mecanismos de transdução de sinais específicos gerados na célula, bem como na patogenia de diversas doenças como o câncer e do coração. Neste contexto, a disponibilidade de compostos quinazolínicos com propriedades inibidoras de tirosina quinase permitiu propor estudos com o intuito de avaliar a potencialidade desses fármacos sobre o bloqueio da evolução da insuficiência cardíaca. Primeiramente, para um estudo biológico sistemático, torna-se importante investigar se existem efeitos diretos das quinazolinas sobre o coração. Para tanto, no presente estudo, investigamos os possíveis efeitos de três compostos quinazolínicos,; DMA ¿ Cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-N,N-dimetilfenil)aminoquinazolina; CLQUI ¿ 6,7-dimetóxi-4-cloroquinazolina, PD153035 ¿ Cloridrato de 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-bromofenil)aminoquinazolina, sobre a função cardíaca em preparação de coração isolado (Langendorff). Foram feitos experimentos concentração-resposta de DMA, CLQUI e PD153035 sobre a pressão sistólica do ventrículo esquerdo e frequência cardíaca de corações isolados de ratos. Todos os compostos testados causaram aumento da pressão ventricular, com diferentes potências para este efeito . O DMA foi o composto que produziu maior resposta pressora quando infundido em concentrações entre 30pM - 2?M (resposta pressora máxima = 27 ? 3 mmHg), enquanto o PD153035 apresentou a menor resposta (resposta pressora máxima = 8 ? 4 mmHg). Também ocorreu diminuição, concentração-dependente, da freqüência cardíaca . As respostas bradicárdicas foram de aproximadamente 24%, 29% e 25% para DMA, CLQUI e PD153035, respectivamente.em relação aos valores basais. Para avaliar os possíveis mecanismos envolvidos nas respostas pressoras e bradicárdicas, realizamos experimentos concentração-resposta apenas com DMA na presença de ?-bloqueador (propranolol) e inibidor do canal tipo-L de cálcio (diltiazem) e também com redução da concentração de cálcio no tampão de perfusão. No entanto, o aumento da pressão ventricular observado não era dependente da ativação de receptores ?-adrenérgicos e nem de receptores de cálcio tipo-L, já que a utilização de propranolol e diltiazem nos experimentos concentração-resposta com DMA em corações isolados, não promoveu o bloqueio do efeito pressor. A redução da concentração de cálcio no tampão de perfusão, apesar de diminuir o efeito pressor do DMA, não nos esclareceu por qual mecanismo a quinazolina estaria atuando para elevar a pressão sistólica dos corações .Por outro lado, observamos que existia uma correlação inversa estreita entre o aumento de pressão ventricular e a queda de freqüência cardíaca observada em todos os experimentos. Em experimentos onde a freqüência cardíaca foi mantida constante durante a infusão de concentrações crescentes de DMA, através da ação de estimulador elétrico, observamos que este procedimento aboliu a resposta pressora do DMA em corações isolados. Levantamos, então, a hipótese de que o principal efeito desses compostos sobre o coração seria a bradicardia. Com esses dados, obtivemos informações de que a adenosina também produz efeitos, em corações isolados, semelhantes àqueles observados com os compostos quinazolínicos (i.e. bradicardia e aumento da pressão sistólica do ventrículo esquerdo), comprovando este dado através de experimentos concentração-resposta de adenosina (ADO) em coração isolado de rato. Sabe-se que a adenosina exerce papel protetor no miocárdio, principalmente sob condições de injúria como , por exemplo, na isquemia. Uma das possibilidades é a de que o composto quinazolínico estaria atuando de forma direta ou indireta sobre receptores de adenosina. Realizamos, então, experimentos de isquemia em corações isolados para verificar se a quinazolina também poderia estar protegendo o miocárdio. Optamos, neste caso, pela utilização do PD153035 já que este foi anteriormente caracterizado como um inibidor da atividade das tirosinas quinases e encontra-se atualmente em testes terapêuticos em pacientes com câncer. Os resultados comprovaram nossa hipótese, revelando o efeito protetor do PD153035 sobre corações isquêmicos a partir de concentrações de 1 nM. Para comprovar esse resultado, utilizamos o inibidor inespecífico dos receptores de adenosina, 8-fenil-teofilina (8-F T), em experimentos de isquemia de corações perfundidos com PD153035. A presença do inibidor aboliu o efeito protetor do PD153035 sobre a isquemia do miocárdio. De maneira geral, estes achados demonstraram que os efeitos cardíacos de compostos quinazolínicos com propriedades inibidoras de tirosina quinase se dão direta ou indiretamente sobre os receptores de adenosina / Abstract: Heart failure remains to be a major cause of morbidity and mortality worldwide. A variety of drugs have been shown to improve symptoms, but most of them do not interfere in the progress of heart failure. A number a signaling pathway has been shown to contribute to cellular damage and deterioration observed in the cardiac myocytes in heart failure. Several evidences support a role of protein tyrosine kinases (PTKs) in the signaling mechanisms underlying the myocardial dysfunction. In this context, the tyrosine kinases inhibitors may have a key role to block the development of heart diseases. Thus, this study was designed to investigate the effects of quinazoline compounds, with the ability to inhibit tyrosine kinases, on isolated rat heart (Langendorff preparation). DMA ¿ 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-N,N-dimethylphenyl) aminoquinazoline chloridrate; CLQUI ¿ 6,7-dimetóxi-4-chloroquinazoline chloridrate and PD153035 ¿ 6,7-dimetóxi-4-N-(3¿-bromophenyl)aminoquinazoline chloridrate were used in this study. All these compounds increased left ventricular systolic pressure and reduced heart rate in a concentration-dependent fashion. These functional effects were more evident for DMA (EC50LVSP= 0.1 ± 0.03 nM; EC50HR= 0.2 ± 0.02 nM and EmaxLVSP= 0.9 ± 0.2; EmaxHR= 173 ± 8 bpm), followed CLQUI (EC50LVSP= 0.6 ± 0.5 nM; EC50HR= 0.9 ± 0.3 nM and EmaxLVSP= 0.6 ± 0.2; EmaxHR= 173 ± 1 bpm) and PD153035 (EC50LVSP= 6.0 ± 1.2; EC50HR= 19.0 ± 9.0 and EmaxLVSP= 0.3 ±;0.1 EmaxHR= 164 ± 3 bpm) (figure 10 and 11). The quinazoline induced increases in left ventricular systolic pressure (LVSP) were caused by the reduction in heart rate (HR) as demonstrated by the straight correlation between LVSP and HR (figure 16 and 17) attained at various doses of these compounds and by the abolition of pressor responses in isolated hearts in which heart rate was restored to control levels through external pacing (figure 18). Further studies revealed that the bradicardia induced by these compounds mimics the effect of adenosine on isolated rat heart and is blocked by the unspecific adenosine receptor antagonist 8-phenil-theophiline (8 PT) (figure 20). Finally, experiments performed to assess the functional effects of ischemia/reperfusion in isolated rat heart revealed that the compound PD153035 protect the myocardium from ischemia (figure 21). The administration of PD153035 at 1 µM avoided the myocardial stunning and dysfunction observed after 40 min of continuous stop-flow ischemia. This effect was completely abolished by the co-administration of the unspecific adenosine receptor antagonist 8 PT (figure 22), indicating that this effect is also mediated by adenosine. In summary, we have shown in this study that the quinazoline compounds formerly demonstrated to have the ability to inhibit tyrosine kinases produces 1) an indirect pressor response via a reduction in heart rate, 2) a concentration-dependent reduction in heart rate mediated by the activation of adenosine receptors, 3) protection of myocardium from ischemia/reperfusion also by a mechanism mediated by the activation of adenosine receptors. In conclusion, our results indicated that the quinazoline compounds tested in the present study have additional pharmacological effects rather than the inhibition of tyrosine kinases. These additional effects are mediated by adenosine receptors and might be dependent on a direct activation of the adenosine receptors or even on the increase in adenosine availability. Further studies are necessary to clarify the exact mechanisms by which these compounds mimic the adenosine effects / Mestrado / Mestre em Farmacologia

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:15:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Machado_GracielaAraujo_M.pdf: 4555277 bytes, checksum: d812f52e71f472a89d4009b8dd61c6b1 (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: Estímulos mecânicos provocam ativação precoce da quinase de adesão focal (Fak) no miocárdio. Esta ativação é acompanh~da pelo recrutamento de vias de sin31i7~ção intracelulares envolvidas no crescimento hipertrófico, bem como de outras vias envolvidas na sobrevivência celular. Dados anteriores obtidos em nosso laboratório demonstraram que o estímulo mecânico ativa a Fak e desempenha papel critico na regulação da re-expressão de genes fetais, sugerindo a participação deste sin31i7~dorintracelular no estabelecimento da hipertrofia e remode1amentocardíacos. No presente estudo, investigamos: 1- a expressão, fosforilação e distnDuiçãoda Fak no resíduo de tirosina 397 e 2 -a expressão e fosforilação nos resíduos Ser/Thr da Erk1l2, ambos na área de infarto e no miocárdio remoto, durante o processo de remodelamento do ventrículo esquerdo, em modelo experimental de infarto do miocárdioem ratos. Dados obtidos no pr esente trabalho demonstraram que a ligadura da artéria coronária descendente anterior provocou infartos classificados como infartos de extensão moderada a grande. As análises morfométicas e das pressões do ventrículo esquerdo, obtidas 1, 3, 7, 15 e 45 dias após o infarto, demonstraram dilatação da câmara, acomp~mh~dade aumentos do comprimento e diâmetro dos cardiomiócitos e aumentos da pressão diastólica final, eventos característicos do remodelamento cardíaco após infarto do miocárdio. Estes dados confirmam dados da literatura que demonstram que em infartos de grandes extensões, a tensão na parede do ventrículo esquerdo dificilmente se normaliza, o que ocasiona dilatação, tanto pelo estiramento da área remota, quanto por expansão da área de infarto, seguida de deterioração funcional progressiva do ventrículo. Além disto, experimentos com as técnicas de westem blot e imunohistoquímicademonstraram que após o infarto do miocárdio ocorre ativação da Fak no miocárdio remoto, detectada com anticorpo específico para a Fak fosforilada no resíduo de tirosina 397, presente já no primeiro dia e mantida até 45 de evolução do infarto do miocárdio. Por outro lado, na área do infarto, houve desaparecimento da expressão da Fale,seguida de aumento progressivo de sua expressão e atividade, ao longo da evolução do processo de cicatrização. Importante observar, que o aumento da expressão e atividade da Fak na região do infarto foi acompanhada pela infiltração de células inflamatórias naquela região. Semelhante ao que foi observado com a Fak demonstramos a ativação e expressão da ErkI/2, tanto na área remota, quanto na área de infarto. Diante dos resultados obtidos nesta investigação e ainda com base nos estudos anteriores de nosso laboratório, podemos inferir que a atividade aumentada da Fak no miocárdio remoto possa contribuir para o estabelecimento do crescimento hipertrófico dos cardiomiócitos. No entanto, também é possível que a ativação excessiva e prolongada da Fale, tanto nos cardiomiócitos, quanto nas células intersticiais e inflamatórias ative mecanismos de sinalização que contnDuem para a deterioração funcional e estrutural do miocárdio, de tal forma, que a modulação de sua atividade no infarto do miocárdio pode trazer beneficiosterapêuticos / Abstract: Mechanical stimuli initiate an acute activation of focal adhesion molecule (Fak) in the myocardium. This Fak activation initiates intracellular pathways that cnlmlnHtein the hypertrophy development. In addition, the activation of Fak can be accompanied by activation of other intracellular signa1ingpathways involved in the cellular growth. Data obtained in our laboratory demonstrated that mechanical stress activates Fak and it is crucial in the regulation of fetal genes re-expression, demonstrating the important role of Fak in the hypertrophy and cardiac remodeling. In the present study we investigated: 1 - Fak expression and phosphorylation at Tyr-397 residue in the infarcted area and in the remote myocardium; 2 - Erk 1/2 expression and activation at SerlThr residue in the infarcted area and in the remote myocardium. These events were observed during left ventricle (LV) myocardial remodeling afier myocardial infarction in rats. In this study the ligation of the left anterior descending artery induced infarcted area of the LV, classified as moderate to large extension. Morphometrical and hemodinamic ana1ysisevaluated 1, 3, 7, 15 e 45 afier myocardial infarction demonstrated that the LV diastolic final pressure and diameter was markedly elevated, and that cardiac myocytes became elongated and hypertrophied. These results were confirmed by data obtained in the literature that demonstrated that afier a large to moderate myocardial infarction the LV undergoes a series of morphologic changes characterized by progressive increase inLV mass and volume and decrease in global LV systolicperformance. In addition, using westem blot and immunohistochemica1techniques, we a1so demonstrated that Fak is phosphorylated at Tyr-397 in the remote myocardium in the first day up to 45 days afier LV infarction. On the other hand, the absence ofFak expression in the infarcted area by the 1st day afier the myocardial infarction was followed by a progressive increase of Fak expression and activation, paralleled to scaring processes and intlammatory cell migration at this site. Similarly, we observed Erk 1/2 expression and activation in the infarcted and remote area. Since Fak was constantly activated in the remote area demonstrated in the present study, and based on the results obtained in our laboratory that demonstrated the important role of the Fak in the myocardial remodeling afier pressure overload, we hypothesize that Fak could contribute to hypertrophic growth afier myocardial infarction. On the other hand, the increase in the Fak activation in the myocardium and/or intlammatory cells could be deleterious, and could contribute to the dysfunction ofthe heart. Thus, the Fak would be a new therapeutic target in the future / Mestrado / Farmacologia / Mestre em Farmacologia

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:16:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_ClaudiaRaquelCantarelli_M.pdf: 14867636 bytes, checksum: 773ca96858437d6f79a46d39f99a9ec9 (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Sobrecargas hemodinâmicas induzem hipertrofia e remodeIamento das câmaras cardíacas inicialmente como mecanismo compensatório, evoluindo para insuficiência cardíaca quando as sobrecargas persistem. A resposta inicial à sobrecarga pressora inclui ativação rápida e coordenada de vias de sinalização intracelular que resultam na regulação de fatores nucleares, expressão gêniea e aumento na síntese protéica. A identidade dos vários componentes do mecanismo de sinalização e sua importância relativa para as mudanças fenotípicas dos miócitos cardíacos em resposta à sobrecarga pressora permanecem indefinidos. No presente estudo, utilizamos a técnica de mRNA differential display para avaliar a expressão gêniea ampla no ventrículo esquerdo de ratos submetidos a sobrecargas de pressão por constricção da crossa da aorta com duração de 2 e 4 horas. Inicialmente foram identificados 43 fragmentosde cDNA-candidatos que apresentaram aumento de expressão em ventrículos esquerdos sobrecarregados. Estes fragmentos foram então reamplificados, clonados, seqüenciados e identificados através de comparações com seqüências depositadas no GenBank. Foram identificados 5 seqüências homologas com genes já identificados. Um gene em especial, aquele que codifica a quinase TBKl, despertou nosso interesse por seu envolvimento potencial na regulação de vias que controlam a atividade do fator de transcrição NF-kB, conhecido por coordenar processos celulares fundamentais em resposta a estímulos de diversas naturezas. Assim, na avaliação subseqüente da TBKl, confirmamos o aumento de sua expressão no miocárdio através da técnica de RT-PCR com oligonucleotídeos específicos para o TBKl aplicada a RNA total obtido de ventrículos esquerdos submetidos a 2 e 4 horas de sobrecarga pressora e de ratos controle. Os resultados deste experimento confirmaram o aumento na expressão de TBKl no miocárdio em resposta à sobrecarga de pressão. Em seguida, avaliamos a expressão e localização da TBKl no ventrículo esquerdo através de técnicas de Westem Blot, fracionamento de componentes citoplasmáticos e citosólico através de ultracentrifugação diferencial e imunohistoquímica. Verificamos que a quinase TBKl se expressa tanto no miocárdio e em miócitos cardíacos como em células da camada média das artérias coronárias e que sua quantidade no miocárdio aumenta significativamente cerca de 2 horas até 24 horas após o início da sobrecarga pressora. Experimentos realizados com marcação do anticorpo anti-TBKl em extratos nucleares e citosólicos revelaram a presença de TBKl na fração nuclear dos miocárdios, com aumento significativo neste extrato após cerca de 30 minutos de hipertrofia e permanecendo elevada até 24 horas de sobrecarga pressora. Experimentos de co-imunoprecipitação indicaram que a TBKl se associa com o NF-kB e que esta associação aumenta no miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Experimentos de quinase in vitro utilizando imunoprecipitados de TBKl e NF-kB indicaram que o imunocomplexo do anticorpo anti-TBKl induz a fosforilação do NF-kB e que este efeito está aumentado no miocárdio de corações sobrecarregados. Foram também realizados experimentos para avaliar a expressão, localização e atividade do fator de transcrição NF-kB. Experimentos com extratos nuclear e citosólico do miocárdio indicaram a translocação do NF-kB para o núcleo induzida pela sobrecarga pressora. Estes resultados foram corroborados pela detecção de marcação mais intensa de núcleos com o anticorpo anti-NF-kB nos miócitos cardíacos de corações sobrecarregados. Finalmente, experimentos realizados com extratos nucleares em ensaio de mobilidade eletroforética (EMSA) indicaram a ativação da ligação do NF-kB com o DNA de sondas contendo a região de consenso para este fator em miocárdio de corações submetidos a sobrecarga pressora. Nossos resultados indicaram 1) que a técnica de mRNA differential display permitiu a avaliação, apesar de restrita, de genes expressos diferencialmente durante sobrecarga pressora; 2) que a quinase TBKl é ativada e pode ter papel importante na ativação do fator de transcrição NF-kB nos períodos iniciais de resposta miocárdica à sobrecarga pressora; 3) o fator de transcrição NF-kB é ativado precocemente e permanece ativado até 24 horas no miocárdio de ratos submetidos a sobrecarga pressora, indicando uma função potencial deste fator nos processos responsáveis pela resposta das células miocárdicas à sobrecarga hemodinâmica / Abstract: To examine genes that are early differentially expressed in response to pressure overload we performed differential display reverse transcriptase-polymerase chain reaction on samples of rat left ventricle (LV) subjected to 2 and 4 hours of transverse aortic constriction. Specifically, we identified increased expression of five genes out of 43 candidate-cDNA ftagments. One such a gene, TBKI raised our interest because of its potential role on the regulation of pathways that control the activity of the transcription factor NF-kB, known to coordinate fundamental cellular processes in response to stressful stimuli. RT-PCR analysis with TBKI-specific primers in LV samples confirmed the enhanced expression of transcripts of TBKI in overloaded myocardium. To verify the functional significance of such finding we first examined TBKI expression in LV by immunoblot and immunohistochemical analysis. TBKI protein levels increased at 2 and remained elevated up to 24 hs of pressure overload. The immunostaining analysis showed TBKI expressed predominantly in cardiac myocytes and in the media of coronary vessels. Co-immunoprecipitation experiments indicated a load-induced increase in the association of TBKI with p50NF-kB that was paralleled by enhanced anti-TBKI immunocomplex kinase activity toward p50NF-kB. Experiments with myocardial nuclear and cytosolic extracts indicated a load-induced p50NF-kB translocation from cytosolic to nuclear fraction and increases in DNA-binding activity demonstrated by electrophoretic mobility shift assay, concurrent with increased TBKI expression and p50NF-kB phosphorylation by anti- TBKI immunoprecipitates. These results suggest that TBKI is rapidly activated and might regulate NF-kB in overloaded myocardium with potential implications in load-induced cardiac hypertrophy and remodeling / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica